劉二強, 陳香君, 回麗媛, 朱明星, 王秀青*

(1．兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院,北京 100089;2.寧夏醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學 科技中心，寧夏 銀川 750004)

天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生理代謝影響的研究

劉二強1, 陳香君2, 回麗媛2, 朱明星3, 王秀青2*

(1．兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院,北京 100089;2.寧夏醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學 科技中心，寧夏 銀川 750004)

研究天蠶素A-馬蓋寧雜合肽作用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)后對細胞生理代謝的影響。利用全波長酶標儀測定雜合肽作用MRSA后對DNA、RNA、總蛋白、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶的影響，利用溶氧電極測定雜合肽對細胞呼吸作用的影響，通過生物發(fā)光分析儀檢測雜合肽作用細胞后ATP生產(chǎn)的變化。結(jié)果顯示，雜合肽作用MRSA后對細胞DNA、RNA、總蛋白的合成能力均出現(xiàn)抑制作用。β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶的表達活性同樣受到了明顯的抑制。雜合肽作用細胞后呼吸作用明顯下降，ATP生產(chǎn)能力受到抑制。雜合肽作用細胞后抑制了胞內(nèi)部分生物大分子的合成能力、胞內(nèi)酶的表達活性及細胞的能量代謝功能，通過胞內(nèi)機制發(fā)揮了抑菌作用。

天蠶素A-馬蓋寧；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；生理代謝；生物大分子；抗菌肽

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是廣泛存在于自然界生物體內(nèi)的一類小分子多肽，由特定基因編碼產(chǎn)生，作為生物機體天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，能夠抵御病原體的侵害[1-2]?？咕膶毦⒄婢?、病毒以及癌細胞等具有良好的生物活性。因其不易產(chǎn)生耐藥性，具有熱穩(wěn)定性和較好的水溶性，對高等動物正常細胞幾乎無毒害作用而顯示出強大的抗菌應用前景，有望作為新一代抗菌藥物替代傳統(tǒng)抗生素。自20世紀70年代瑞典科學家Boman等[3]首次在天蠶血淋巴中發(fā)現(xiàn)抗菌肽以來，抗菌肽一直成為生命科學研究的熱點之一[4]，并在各種生物中發(fā)現(xiàn)了大量的抗菌肽。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)在金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)感染中所占的比例越來越高，據(jù)相關報道，部分地區(qū)高達70%以上[5]，目前已經(jīng)成為醫(yī)院感染的重要致病菌之一。由于MRSA對于常用抗菌藥物存在較高的耐藥率，臨床治療MRSA感染成為目前感染治療的難點之一。因此越來越多的科研工作者尋求更為有效的抗菌肽，研究抗菌肽對MRSA的作用機制，以期能夠盡早應用于臨床感染治療領域。天蠶素A-馬蓋寧(CecA-Mag)是由抗菌作用較強的兩種陽離子小肽天蠶素A(CecropinA)和馬蓋寧(Magainin)雜合而成。研究者前期選用了天蠶素A成熟肽段1～7以及馬蓋寧2～12的氨基酸序列(GenBank上序列號分別為X06672和J03193)，選用酵母偏愛密碼子設計CecA-Mag雜合肽基因。雜合肽體外試驗顯示，其對G+及G-菌均具有良好的抑菌效果[6]，對臨床分離出的MRSA菌株亦有良好的抑殺活性。課題組前期在雜合肽殺傷MRSA機制研究中，發(fā)現(xiàn)雜合肽可以改變細胞膜的通透性[7]，并且能夠進入胞內(nèi)，在細胞內(nèi)累積，同時可以與核酸分子結(jié)合。大量研究結(jié)果表明，多數(shù)抗菌肽存在胞內(nèi)殺傷機制，抗菌肽在細胞內(nèi)累積，并干擾細胞正常代謝，通過抑制DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成，或抑制胞內(nèi)酶活性，達到抑制、殺滅細菌的目的。本研究在雜合肽處理MRSA后，通過對DNA、RNA、總蛋白合成能力的測定，胞內(nèi)酶表達活性的變化，以及細胞呼吸作用、ATP生產(chǎn)能力的變化測定，研究了雜合肽存在的情況下對胞內(nèi)物質(zhì)代謝的影響情況，探討了雜合肽對MRSA胞內(nèi)物質(zhì)的影響作用機制，進一步明確了雜合肽通過引起MRSA胞內(nèi)生物大分子的表達變化，發(fā)揮胞內(nèi)抑菌機制，進而導致細菌死亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 天蠶素A-馬蓋寧雜合肽 雜合肽由上海楚肽生物科技有限公司采用固相化學合成法合成，Purity(HPLC)純度≥95%。ddH2O作為溶解雜合肽的溶劑，0.22 μm濾器過濾[8]。

1.1.2 菌種來源 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株為臨床菌株，由寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院實驗中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①MH培養(yǎng)基(青島海博生物技術有限公司);②M9乳糖誘導培養(yǎng)基：Na2HPO4·7H2O 1.28 g，KH2PO40.3 g，NaCl 0.05 g，NH4Cl 0.1 g，MgSO40.05 g，CaCl20.001 g，乳糖 0.5 g，溶于100 mL超純水。

1.1.4 主要試劑和儀器 細菌DNA提取試劑盒，美國Omega公司；細菌RNA提取試劑盒，北京天根公司；BCA蛋白定量試劑盒，北京康為世紀公司；鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、對硝基苯磷酸二鈉(PNPP)，美國Amersco公司；溶葡萄球菌素、蟲熒光素(luciferin)與蟲熒光素酶(luciferase)、5′-三磷酸腺苷(ATP)二鈉鹽水合物，美國sigma公司；Multiskan GO全波長酶標儀，美國Thermo Fisher公司；O2微電極(OX50)，丹麥Unisense公司；濱松生物發(fā)光分析儀，北京濱松光子公司。

1.2 方法

1.2.1 雜合肽作用MRSA后對細胞DNA合成能力的影響 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的MRSA菌液4 000×g離心5 min，PBS洗滌離心后，用新鮮的 MH培養(yǎng)基重懸至 1×108cfu/mL，每個實驗組設5個平行。35 ℃、220 r/min培養(yǎng)8 h后，分別加入 100 μL經(jīng)ddH2O稀釋的雜合肽溶液，混勻后，使雜合肽的終濃度分別為1×MIC和3×MIC。以加入100 μL純水作為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)30、60、90、120、150、180、210 min后，4 000×g離心5 min，去上清[9]。利用Omega 細菌DNA提取試劑盒提取MRSA基因組DNA，用全波長酶標儀測量提取DNA樣本的OD260及OD280[10]，OD260值為1相當于大約50 μg/mL雙鏈 DNA，OD260/OD280比值為1.7～1.9時，表示DNA純度較高。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.2.2 雜合肽作用MRSA后對細胞RNA合成能力的影響 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的MRSA菌液4 000 g離心5 min，用PBS洗滌離心后，用新鮮的MH培養(yǎng)基重懸菌體至1×108cfu/mL,每個實驗組設5個平行。35 ℃、220 r/min培養(yǎng)8 h后，分別加入100 μL雜合肽溶液，混勻后，使雜合肽的終濃度分別為1×MIC和3×MIC。以加入100 μL純水作為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)0、30、60、90、120、150、180、210 min后，4 000×g離心5 min，去上清。利用Omega 細菌RNA提取試劑盒提取MRSA 總RNA。提取出的RNA溶液用全波長酶標儀測OD260及OD280，OD260/OD280比值在 1.8～2.0 視為抽提的 RNA 純度較高。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取其平均值[11]。

1.2.3 雜合肽作用MRSA后對細胞總蛋白合成能力的影響 取25 μL蛋白標準品用PBS稀釋至100 μL，使終濃度為0.5 mg/mL。將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板的蛋白標準孔中，加PBS補足到20 μL，用全波長酶標儀測定A562，繪制標準曲線。參照試劑盒說明書，配制適量BCA工作液。雜合肽處理0、30、60、90、120、150、180、210 min后的菌液離心，棄上清，PBS洗滌。分別加入100 μL TE緩沖液和5 μL溶葡萄球菌素(1 mg/mL)，37 ℃溫育10 min。取出置冰浴中，分別加入400 μL冰純水和500 μL冰冷的20%三氯乙酸(TCA)，混勻冰浴5 min。離心，去上清，加入200 μL冰冷的PBS重懸。分別取20 μL重懸液各3管到96孔板的樣品孔中，各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min，冷卻至室溫，用全波長酶標儀測定A562。根據(jù)標準曲線計算出樣品的蛋白濃度[12]。

1.2.4 雜合肽作用MRSA后對β-半乳糖苷酶表達活性的影響 取培養(yǎng)至對數(shù)期的MRSA菌液，用PBS洗滌4 000 g離心5 min，M9乳糖誘導培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至加入25 mL M9 乳糖誘導培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，35 ℃振蕩誘導5 h后離心。用M9 乳糖誘導培養(yǎng)基重懸至1×108cfu/mL，加入100 μL雜合肽溶液，使肽終濃度分別為1×MIC和3×MIC。以加入100 μL ddH2O作為陰性對照。35 ℃誘導培養(yǎng)0、30、60、90、120、150、180、210 min后，離心收集，用500 μL TE緩沖液重懸后加入2 μL溶葡萄球菌素(1 mg/mL)，37 ℃溫浴10 min，再置于超聲波細胞粉碎機中，冰浴，15 kHz超聲波處理3 min，4 ℃離心，取上清液400 μL，加入800 μL β-半乳糖苷酶反應緩沖液(NaCl 0.8 g，KCl 0.02 g，Na2HPO4·12H2O 0.29 g，KH2PO40.024 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，β-硫基乙醇 0.39 g，超純水溶解至100 mL)，再加入400 μL 10 mg/mL 鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)充分混勻后，37 ℃溫浴30 min，加入400 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應，用全波長酶標儀測定405 nm 處的OD值[13]。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.2.5 雜合肽作用MRSA后對堿性磷酸酶表達活性的影響 將處于對數(shù)生長期MRSA菌懸液4 000 g離心5 min，PBS洗滌，新鮮MH培養(yǎng)基重懸菌沉淀至1×108cfu/mL。取菌懸液，加入雜合肽溶液50、180、210 min后，離心收集，用500 μL TE緩沖液重懸后加入2 μL溶葡萄球菌素(1 mg/mL)，37 ℃溫浴10 min，再置于超聲波細胞粉碎機中，冰浴，15 kHz超聲波處理3 min，4 ℃離心，取上清液400 μL，加入800 μL 2 mol/L乙二醇胺緩沖液(乙二醇胺10 mL，MgCl2·6H2O 102 mg，50 mL超純水溶解，濃鹽酸調(diào)pH至10.0)，再加入400 μL 10 mg/mL對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)，充分混勻后，37℃溫浴30 min，加入400 μL 1 mol/L NaOH終止反應，用全波長酶標儀測定405 nm 處的OD值[14]。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.2.6 雜合肽作用MRSA后對細胞呼吸作用的影響 將處于對數(shù)生長期MRSA菌懸液4 000 g離心5 min，用PBS洗滌后，新鮮的MH培養(yǎng)基重懸菌沉淀至1×108cfu/mL。在菌懸液中加入100 μL雜合肽溶液，使肽終濃度分別為1×MIC和3×MIC，37 ℃振蕩培養(yǎng)。以加入100 μL ddH2O作為陰性對照。本研究采用O2微電極(OX50)測量菌液中0、10、20、30、40、50、60 min時溶氧率的變化[15]。將初始時刻菌懸液中的溶氧率作為100%，空氣測定值為0%，實驗重復3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.2.7 雜合肽作用MRSA后對細胞ATP生產(chǎn)的影響 ATP標準曲線的測定：ddH2O稀釋ATP標準品，在96孔板中加入10 μL終濃度為0、20、40、60、80、100 pmol/L的ATP標準品，再加入50 μL 蟲熒光素-蟲熒光素酶混合物(50 mmol/L甘氨酸，0.15 mmol/L蟲熒光素，0.2 mg/mL蟲熒光素酶，1 mmol/L tris，0.55 mmol/L EDTA, 0.1% BSA，0.1%疊氮化鈉，pH 7.6)，濱松生物發(fā)光分析儀檢測發(fā)光度值，繪制標準曲線。取對數(shù)生長期MRSA菌液，PBS洗滌，新鮮MH培養(yǎng)基重懸菌沉淀至1×108cfu/mL。在菌懸液中加入100 μL的雜合肽溶液，使肽終濃度分別為1×MIC和3×MIC。以加入100 μL ddH2O作為陰性對照。37 ℃處理0、10、20、30、40、50、60 min后，離心收集菌體，ddH2O重懸后加入0.05%苯扎溴銨和1 mmol/L MgCl2，室溫作用3 min后置冰上備用。取熒光素-熒光素酶混合液150 μL于96孔板中，加入50 μL 苯扎溴銨處理的樣本，濱松生物發(fā)光分析儀檢測發(fā)光值，計算ATP量[16]。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜合肽作用MRSA后對細胞DNA合成能力的影響

雜合肽對MRSA DNA合成的影響如圖1所示。以純水作為陰性對照組的結(jié)果顯示，隨著時間的延長DNA的合成量總體呈上升趨勢，說明胞內(nèi)DNA正常合成，細菌正常繁殖。在菌液中加入雜合肽后，基因組DNA合成量在30 min內(nèi)繼續(xù)升高，30 min后總體呈下降趨勢，90 min后DNA的合成被明顯抑制。與1×MIC濃度相比，3×MIC濃度的雜合肽對DNA合成的抑制作用更強。

圖1 雜合肽對MRSA DNA合成能力的影響Fig.1 The influence of peptides on the synthesis of bacterial DNA *與對照組比較P<0.05～0.01；**與對照組比較P<0.01；下圖同 *compared with control group, P<0.05～0.01;**compared with control group, P<0.01；Same figure

2.2 雜合肽作用MRSA后對細胞RNA合成能力的影響

雜合肽作用MRSA后對RNA合成能力的影響如圖2所示。以純水作為陰性的對照組中，RNA的合成量隨時間呈穩(wěn)定上升趨勢，說明細菌正常繁殖代謝，RNA的量也在不斷增多。加入雜合肽后，細菌RNA合成量明顯降低。3×MIC濃度的雜合肽組，30 min后明顯受到抑制 ，1×MIC濃度的雜合肽處理組60 min后同樣能夠明顯抑制RNA的合成。3×MIC濃度的雜合肽組對RNA合成能力的抑制作用比1×MIC濃度的抑制效果更強。

圖2 雜合肽對MRSA RNA合成能力的影響Fig.2 The influence of peptides on the synthesis of bacterial RNA

2.3 雜合肽作用MRSA后對細胞總蛋白合成能力的影響

雜合肽作用MRSA后對細菌總蛋白合成能力的影響如圖3所示。在純水作為陰性對照的對照組中，蛋白的合成量呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢，細菌胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄翻譯過程是正常的進行。加入雜合肽后，不同濃度組的蛋白合成量均出現(xiàn)明顯下降，并沒有像DNA組出現(xiàn)滯后期，并且下降速度更快，尤其是3×MIC濃度組在30 min后即明顯抑制了蛋白質(zhì)的合成(P<0.01)。1×MIC濃度組同樣能夠明顯抑制總蛋白的合成能力。

圖3 雜合肽對MRSA總蛋白 合成能力的影響Fig.3 The influence of peptides on the synthesis of bacterial total protein

2.4 雜合肽作用MRSA細菌后對β-半乳糖苷酶表達活性的影響

乳糖存在的條件下誘導細菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，該酶可水解鄰-硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)，生成黃色的鄰-硝基苯酚(ONP)，ONP在波長405 nm處有最大吸收峰，可以根據(jù)OD405值的變化反映堿性磷酸酶的表達活性。由圖4所示OD405的變化可以看出，以純水作為陰性對照的對照組中，β-半乳糖苷酶的表達活性隨時間呈穩(wěn)步上升趨勢。雜合肽處理組，無論是1×MIC還是3×MIC組，均隨著時間的延長β-半乳糖苷酶表達活性逐步下降，3×MIC濃度組在60 min時出現(xiàn)明顯的抑制酶活現(xiàn)象并隨著時間的延長抑制作用更加強烈，1×MIC濃度組在120 min內(nèi)沒有出現(xiàn)明顯的抑制效果，但120 min后同樣出現(xiàn)了對β-半乳糖苷酶表達活性明顯的抑制作用。

圖4 雜合肽對MRSA β-半乳糖苷酶表達活性的影響Fig.4 nhibition of β-galactosidase activities of MRSA cells by antibacterial peptides

2.5 雜合肽作用細菌后對堿性磷酸酶表達活性的影響

堿性磷酸酶可以催化對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)水解產(chǎn)生黃色的對硝基苯酚(pNP)，pNP在波長405 nm處有最大吸收峰，可以根據(jù)OD405的值反映堿性磷酸酶的表達活性。雜合肽處理MRSA后對堿性磷酸酶的表達活性影響如圖5所示，以純水作為陰性對照的對照組，堿性磷酸酶的表達持續(xù)增加。與β-半乳糖苷酶的實驗結(jié)果類似，雜合肽抑制了堿性磷酸酶的表達，3×MIC組較1×MIC組抑制程度更強。雜合肽抑制了胞內(nèi)兩個重要酶β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶的表達活性，同時這與雜合肽抑制蛋白合成能力的結(jié)果是一致的。

圖5 雜合肽對MRSA堿性磷酸酶表達活性的影響Fig.5 Inhibition of alkaline phosphatase activities of MRSA cells by antibacterial peptides

2.6 雜合肽作用細菌后對細胞呼吸作用的影響

雜合肽作用細菌后對細胞呼吸作用的影響如圖6所示，與以純水作為對照的對照組相比，3×MIC濃度組處理的菌懸液中溶氧率明顯高于對照組，而且從20 min開始即出現(xiàn)了明顯的差異，說明3×MIC濃度組的雜合肽顯著的抑制了細胞的呼吸作用，使菌懸液中溶解的氧消耗減慢。1×MIC濃度組處理的菌懸液中溶氧率與對照組相比，前50 min內(nèi)未出現(xiàn)明顯的統(tǒng)計學差異，60 min時則出現(xiàn)明顯差異。雜合肽在更高的濃度范圍對細胞呼吸作用的抑制作用更為強烈。

圖6 雜合肽對MRSA呼吸作用的影響Fig.6 The effect of antimicrobial peptides on oxygen consumption of MRSA

2.7 雜合肽作用細菌后對細胞ATP生產(chǎn)的影響

ATP生物發(fā)光法的原理就是在熒光素酶和Mg2+的作用下，熒光素與ATP發(fā)生腺苷酰化被活化，活化后的熒光素與熒光素酶相結(jié)合，化學能轉(zhuǎn)化成光能，檢測的熒光值強度與ATP濃度成一定比例關系。雜合肽處理MRSA后對堿性磷酸酶的表達活性影響如圖7所示，與對照組相比，3×MIC濃度組在處理細菌20 min后ATP的生產(chǎn)量即出現(xiàn)明顯的抑制，40 min后抑制作用更為明顯。1×MIC濃度組則在30 min時出現(xiàn)對ATP的生產(chǎn)明顯抑制。不同濃度組對ATP的生產(chǎn)均出現(xiàn)不同程度的抑制，且高濃度組受到的抑制更明顯。

圖7 雜合肽對MRSA ATP生產(chǎn)的影響Fig.7 The effect of antimicrobial peptides on the ATP content of MRSA

3 討 論

目前研究證明大部分抗菌肽通過破壞靶細胞膜的完整性而導致微生物死亡[17]，但在某些情況下，微生物在抗菌肽造成細胞膜膜滲漏的同時，仍能長期生存，說明膜的破壞并不是靶細胞死亡的全部機制[18-19]。越來越多的研究結(jié)果證明抗菌肽還存在胞內(nèi)作用機制[20]，抗菌肽能夠穿透細胞膜進入胞內(nèi)，通過抑制胞內(nèi)正常的生理代謝功能，導致細菌死亡。Hao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽buforinⅡ并不引起大腸埃希菌細胞質(zhì)膜破裂，而是穿透細胞膜后進入胞內(nèi)，與DNA和RNA結(jié)合，導致細菌死亡?？咕膇ndolicidin及其衍生物能夠完全抑制大腸埃希菌DNA和RNA的合成，對總蛋白合成能力則沒有造成影響[22-23]，而在更高的抗菌肽濃度下則顯著抑制蛋白質(zhì)的合成，而且觀察到細菌細胞膜的變化和胞內(nèi)容物的泄漏[24]?？咕腜R-39能夠抑制大腸埃希菌DNA、RNA和總蛋白的合成。本研究表明，天蠶素A-馬蓋寧雜合肽能夠抑制MRSA的DNA、RNA和總蛋白的合成能力。雜合肽沒有首先抑制DNA的合成功能可能是因為雜合肽與DNA的特殊結(jié)合方式，也可能是雜合肽首先影響到DNA復制相關的酶類或者其他與復制相關的分子，導致DNA可以繼續(xù)完成部分的復制功能[20]；另外雜合肽與DNA的結(jié)合有可能類似于抗原抗體反應，存在最佳計量結(jié)合狀態(tài)。雜合肽迅速抑制了RNA的合成，一方面是雜合肽與RNA結(jié)合，另一方面可能是雜合肽結(jié)合到了影響轉(zhuǎn)錄的功能區(qū)域上。雜合肽對蛋白的合成表現(xiàn)出明顯的抑制作用，高濃度的肽抑制蛋白合成的能力比低濃度的肽強。雜合肽結(jié)合核糖體RNA后會首先影響到總蛋白的合成，這能夠解釋雜合肽處理細菌后總蛋白合成的下降。

抗菌肽可與細菌的胞內(nèi)酶結(jié)合，通過抑制胞內(nèi)酶的活性，達到抑菌的效果。Vincent等[25]研究表明，細菌素Microcin J25能夠與胞內(nèi)的RNA聚合酶結(jié)合，進而導致底物不能與酶的活性中心結(jié)合，抑制RNA聚合酶的活性。又有研究表明，富含脯氨酸的抗菌肽L-pyrrhocoricin、Drosocin可以降低大腸埃希菌中β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶的表達活性，通過胞內(nèi)機制發(fā)揮抑菌作用[26]。天蠶素A-馬蓋寧雜合肽作用MRSA后，胞內(nèi)酶β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶的表達活性均下降，這可能是雜合肽抑制了酶的表達量或抑制了酶的活性中心，以發(fā)揮抑菌效果。

抗菌肽死亡素thanath可以通過抑制細菌的呼吸作用導致細菌死亡[18]。也有研究表明，Microcin J25可以改變氧的消耗速率[25]。人唾液抗菌蛋白富組蛋白histatin能夠?qū)е掳咨钪榫侨芫缘腁TP損失，進而抑制呼吸作用，產(chǎn)生活性氧自由基，最終導致其死亡[27]。MRSA細胞呼吸鏈在細胞質(zhì)膜上，前期研究證明天蠶素A-馬蓋寧雜合肽可以引起細胞膜通透性的改變[7]，但雜合肽可以在細胞膜發(fā)生破壞之前或同時，通過作用于細胞質(zhì)膜，破壞質(zhì)膜上呼吸鏈電子傳遞的完整性，阻斷內(nèi)膜上的氧化酶系統(tǒng)氧化磷酸化過程，而抑制細菌的呼吸作用。細菌的呼吸作用可能是細菌代謝過程中抗菌肽發(fā)揮抑菌作用的重要靶點，其深入的抑菌機制也將是我們下一步研究的方向。抗菌肽可以通過阻斷胞內(nèi)的多條代謝途徑，發(fā)揮殺傷作用，從而抑制、殺滅細菌。由于抗菌肽對細菌存在多個作用靶點，使其不易產(chǎn)生耐藥性，而有望成為新一代抗菌藥物或輔助治療藥物。

天蠶素A-馬蓋寧雜合肽作用于MRSA后可以抑制細胞DNA、RNA、總蛋白的合成能力，抑制胞內(nèi)酶的活性和細胞能量代謝功能，通過阻斷細菌胞內(nèi)多條代謝途徑，干擾細胞的正常生理代謝，發(fā)揮胞內(nèi)殺傷作用，從而抑制細菌生長、殺滅細菌。

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Effect of CecropinA-Magainin Hybrid Peptide in Physiological Metabolism of Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus

LIU Er-qiang1, CHEN Xiang-jun2, HUI Li-yuan2, ZHU Ming-xing3, WANG Xiu-qing2

(1.BeijingNorthernHosp.ofWeaponryIndust,Beijing100089; 2.Inst.ofClinic.Lab.ofMed.,3.Sci. &Technol.Ctr.,NingxiaMed.Uni.,Yinchuan750004)

The effect of cecropin A-magainin heterozygous peptide in physiological metabolism of methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) was studied. The effect of DNA, RNA, total protein, β-galactosidase, alkaline phosphatase after the reaction of the heterozygous peptide were determined with holo-wave length ELISA instrument. The respiration of the cell was determined using dissolve oxygen electrode. The variation of the cell ATP production was examined with bioluminescence analyzer. The results showed that the synthetic abilities of DNA, RNA, total protein decreased after treated with heterozygous peptide were inhibited. And the expression ability of β-galactosidase, alkaline phosphatase was significantly inhibited. Therefore, after treated with heterozygous peptide the intracellular synthetic abilities of macro-molecules, the expression activities of intracellular enzymes, and the energy metabolism of the cell was inhibited of biological, and play the inhibition role through intracellular mechanism.

cecropin A-magainin; methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA); physiological metabolism; biomacromolecule; antimicrobial peptides

國家自然科學基金項目(31360622)

劉二強 男，碩士研究生。研究方向為臨床病原微生物與分子診斷學。E-mail:kku6666@163.com

* 通訊作者。女，博士，碩士生導師。研究方向為臨床病原微生物與分子診斷學。Tel：0951-4083334，E-mail:xiuqingwang1979@163.com

2015-09-07；

2015-09-28

Q936

A

1005-7021(2016)05-0044-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.008