陶國翔，李愛秀，封加棟，張 敏，戰(zhàn) 麗

(1.武警后勤學(xué)院基礎(chǔ)部藥物設(shè)計實(shí)驗(yàn)室，天津 300309；2.武警后勤學(xué)院科研部，天津 300309；3.武警后勤學(xué)院訓(xùn)練部，天津 300309)

基于分子對接技術(shù)研究漆酶與介質(zhì)間的結(jié)合模式與相互作用機(jī)制

陶國翔1，李愛秀1，封加棟1，張 敏2，戰(zhàn) 麗3

(1.武警后勤學(xué)院基礎(chǔ)部藥物設(shè)計實(shí)驗(yàn)室，天津 300309；2.武警后勤學(xué)院科研部，天津 300309；3.武警后勤學(xué)院訓(xùn)練部，天津 300309)

為深入研究漆酶-介質(zhì)體系中漆酶與介質(zhì)間的相互作用，基于分子對接技術(shù)計算模擬了變色栓菌漆酶與5種典型介質(zhì)之間的結(jié)合模式，并在分子水平闡明了漆酶與介質(zhì)的相互作用機(jī)制。結(jié)果表明，漆酶活性位點(diǎn)的Leu164、Asn264、Phe265、Gly392、Ala393、Ile455等氨基酸殘基與介質(zhì)發(fā)生疏水作用，Asp206與介質(zhì)中的羥基發(fā)生氫鍵作用；漆酶與介質(zhì)作用時His458遠(yuǎn)離了T1Cu，對漆酶氧化電勢的提高具有較大貢獻(xiàn)。為漆酶與介質(zhì)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步改造以及從天然資源中挖掘新介質(zhì)提供了理論指導(dǎo)。

漆酶；介質(zhì)；漆酶-介質(zhì)體系；分子對接；結(jié)合模式；相互作用機(jī)制

漆酶(laccase，EC1.10.3.2)是一種多銅氧化酶，根據(jù)其來源不同可分為昆蟲漆酶、植物漆酶、細(xì)菌漆酶和真菌漆酶[1]。真菌是漆酶最重要的來源，來源于變色栓菌(Trametesversicolor)的真菌漆酶具有易得、產(chǎn)量高的優(yōu)勢，因此變色栓菌一直被作為生產(chǎn)漆酶的真菌[2]。漆酶的特征底物為酚類和芳胺類，通過銅離子與底物之間的電子傳遞實(shí)現(xiàn)對底物的催化氧化作用，其催化氧化機(jī)制如圖1所示。

圖1 漆酶活性位點(diǎn)的催化氧化機(jī)制

由于漆酶在催化氧化過程中副產(chǎn)物只有水，所以具有極高的環(huán)保價值，被稱為“綠色催化劑”[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在催化體系中加入一種小分子介質(zhì)(mediator)，與漆酶共同構(gòu)成漆酶-介質(zhì)體系(laccase-mediator system，LMS)，漆酶的催化氧化能力會顯著提升[4]。在LMS中，介質(zhì)主要通過間接提高漆酶的氧化電勢和減少漆酶與底物之間的空間阻礙等方式提高電子傳遞效率[5]。一是介質(zhì)首先被漆酶氧化生成具有較高氧化電勢的介質(zhì)中間體，介質(zhì)中間體再與底物反應(yīng)，這樣就間接提高了漆酶的氧化電勢；二是底物不必直接結(jié)合到漆酶的活性位點(diǎn)，而讓介質(zhì)充當(dāng)漆酶與底物之間的“電子梭”，克服了某些底物與漆酶活性位點(diǎn)空間匹配性不佳的問題。LMS的建立提高了催化效率、擴(kuò)大了底物范圍、拓寬了應(yīng)用領(lǐng)域。例如：LMS用于催化氧化木質(zhì)素降解，為實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的高值化利用邁出了重要一步[6]；LMS可有效催化降解工業(yè)廢水中的多環(huán)芳烴、酚類等有毒物質(zhì)，降低工業(yè)廢水的化學(xué)耗氧量、生物耗氧量和色度等[7]；LMS還可降解土壤中的殘留農(nóng)藥[8](如毒死蜱、滴滴涕等)和抗生素[9](如磺胺地托辛)等。由此可見，LMS的應(yīng)用有利于循環(huán)經(jīng)濟(jì)的開展和綠色化學(xué)的推廣，具有極高的社會和環(huán)保意義。但是由于目前常用的介質(zhì)成本較高、穩(wěn)定性較差以及具有一定毒性和刺激性等因素[10]，影響了LMS的進(jìn)一步應(yīng)用。作者基于分子對接技術(shù)，從已知變色栓菌漆酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)，從分子水平揭示漆酶與常見介質(zhì)之間的結(jié)合模式和可能的相互作用機(jī)制，擬為新介質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和現(xiàn)有介質(zhì)的合理改造奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 技術(shù)平臺

所有計算均利用分子模擬與分子設(shè)計軟件包MOE 2009在計算機(jī)上完成。

1.2 漆酶和介質(zhì)結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)用漆酶是變色栓菌漆酶與2,5-二甲基苯胺的復(fù)合物，蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)編號為1KYA。文獻(xiàn)報道1KYA中漆酶活性位點(diǎn)由Phe162、Leu164、Asp206、Asn264、Phe265、Phe332、Phe337、Pro391、Gly392、Ala393、Ile455和His458等氨基酸組成[11]。

介質(zhì)為文獻(xiàn)報道的3個天然介質(zhì)和2個人工合成介質(zhì)[5，12-13]，天然介質(zhì)為丁香酸甲酯、乙酰丁香酮、乙酰香草酮，人工合成介質(zhì)為N-羥基苯并三唑(HBT)和N-羥基乙酰苯胺(NHA)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

圖2 介質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.3 分子對接

分子對接是將小分子介質(zhì)放置于漆酶活性位點(diǎn)處，并尋找合適的取向和構(gòu)象，使介質(zhì)與漆酶的形狀和相互作用匹配最佳。

1.3.1 分子對接模型的建立

為保證分子對接的可靠性，首先建立了分子對接模型。將1KYA中的配體(2,5-二甲基苯胺)抽提出來作為初始構(gòu)象，嘗試不同的對接參數(shù)，再將2,5-二甲基苯胺對接回漆酶活性位點(diǎn)，根據(jù)對接前后2,5-二甲基苯胺在活性位點(diǎn)中的位置及其與氨基酸殘基的相互作用關(guān)系，判斷參數(shù)設(shè)置的合理性以及MOE 2009軟件包研究漆酶與介質(zhì)相互作用的適用性。

將1KYA導(dǎo)入MOE 2009，刪除其雜原子、溶劑分子、2,5-二甲基苯胺等，保留漆酶A鏈，在Amber99力場下，利用Protonate 3D模塊，在pH=5.0、溫度300 K條件下對漆酶加氫加電荷。之后設(shè)置力場為MMFF94x，利用MOE-Dock模塊將介質(zhì)與漆酶活性位點(diǎn)對接，參數(shù)設(shè)置如下：Placement：Triangle Mather；Rescoring1：London dG；Refinement:Forcefield。對接完成后，選取合適的介質(zhì)和以漆酶活性位點(diǎn)為中心、半徑5 ?范圍內(nèi)的氨基酸殘基，其余部分固定，在MMFF94x力場下進(jìn)行能量優(yōu)化[14]。

1.3.2 介質(zhì)與漆酶的對接

介質(zhì)結(jié)構(gòu)首先由MOE 2009軟件包中Builder模塊繪制，然后以1KYA中配體2,5-二甲基苯胺的構(gòu)象為模板，利用Flexible alignment模塊分別將5種介質(zhì)與之疊合，選擇最佳的疊合構(gòu)象作為介質(zhì)對接的初始構(gòu)象。采用已建立的分子對接模型將介質(zhì)對接到漆酶活性位點(diǎn)。根據(jù)對接結(jié)果的評分大小、氫鍵作用和關(guān)鍵氨基酸殘基的疏水作用等確定最佳對接結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子對接模型的建立與評價

2.1.1 1KYA中漆酶活性位點(diǎn)與2,5-二甲基苯胺的結(jié)合模式(圖3)

漆酶表面的Ⅰ型Cu(T1Cu)是電子的初級接受位點(diǎn)，在T1Cu中心形成一個由若干氨基酸殘基構(gòu)成的活性位點(diǎn)。由圖3可知，在1KYA中2,5-二甲基苯胺占據(jù)了漆酶的活性空腔，2,5-二甲基苯胺的氨基與His458形成氫鍵，His458作為電子入口與T1Cu配位，把接受的電子傳遞給T1Cu。漆酶活性位點(diǎn)的Phe162、Leu164、Phe265、Pro391、Gly392與2,5-二甲基苯胺發(fā)生疏水作用[11]。

2.1.2 分子對接后1KYA中漆酶活性位點(diǎn)與2,5-二甲基苯胺的結(jié)合模式(圖4)

將1KYA中2,5-二甲基苯胺取出后，再對接回漆酶活性位點(diǎn)處，2,5-二甲基苯胺上的氨基與His458之間存在氫鍵作用，2,5-二甲基苯胺與Phe162、Leu164、Phe265、Pro391、Gly392存在疏水作用。對接結(jié)果從2,5-二甲基苯胺的結(jié)合位置氫鍵作用以及與關(guān)鍵氨基酸殘基的疏水作用等方面較好地重現(xiàn)了復(fù)合物中漆酶活性位點(diǎn)與2,5-二甲基苯胺的結(jié)合特點(diǎn)，表明利用以上參數(shù)在MOE-Dock模塊下建立的分子對接模型是可靠的。

圖3 1KYA中漆酶活性位點(diǎn)與2,5-二甲基苯胺的結(jié)合模式

圖4 分子對接后1KYA中漆酶活性位點(diǎn)與2,5-二甲基苯胺的結(jié)合模式

Fig.4 Binding mode of laccase active site and 2,5-dimethylaniline in 1KYA after molecular docking

2.2 介質(zhì)與漆酶對接結(jié)果

2.2.1 漆酶活性位點(diǎn)與介質(zhì)的結(jié)合模式

采用建立的分子對接模型，將介質(zhì)與漆酶活性位點(diǎn)對接，得到漆酶活性位點(diǎn)與介質(zhì)的結(jié)合模式，如圖5所示。

丁香酸甲酯 乙酰丁香酮 乙酰香草酮 HBT

NHA

圖5 漆酶活性位點(diǎn)與介質(zhì)的結(jié)合模式

Fig.5 Binding mode of laccase active site and mediators

由圖5可知，4個loop環(huán)勾勒出活性位點(diǎn)的輪廓，5種介質(zhì)均能較好地結(jié)合在漆酶活性位點(diǎn)，被疏水氨基酸殘基包圍，介質(zhì)的羥基深入到了活性位點(diǎn)內(nèi)部的極性區(qū)。

2.2.2 漆酶活性位點(diǎn)氨基酸殘基與介質(zhì)相互作用的2D示意圖(圖6)

圖6 漆酶活性位點(diǎn)氨基酸殘基與介質(zhì)相互作用的2D示意圖

由圖6可知，與介質(zhì)發(fā)生相互作用的氨基酸包括1個酸性氨基酸Asp206、1個堿性氨基酸His458和若干中性氨基酸Leu164、Asn264、Phe265、Gly392、Ala393、Ile455。與介質(zhì)發(fā)生疏水作用的氨基酸分別位于3個loop環(huán)上，分別為Leu164，Asn264、Phe265和Gly392、Ala393，其中Leu164和Gly392、Ala393分別位于活性位點(diǎn)兩側(cè)，構(gòu)成進(jìn)入活性位點(diǎn)的入口。酸性氨基酸Asp206與介質(zhì)中的羥基發(fā)生氫鍵作用，Phe265的苯環(huán)與介質(zhì)中的苯環(huán)平行，發(fā)生π-π相互作用，Asn264與丁香酸甲酯和乙酰丁香酮的甲氧基的氧原子發(fā)生氫鍵作用。

2.2.3 Asp206與羥基及His458與T1Cu的距離(表1)

表1 Asp206與羥基及His458與T1Cu的距離/?

Tab.1 Distance of Asp206-hydroxyl and His458-T1Cu/?

介質(zhì)Asp206與羥基距離His458與T1Cu距離2,5二甲基苯胺-2.23丁香酸甲酯1.274.16乙酰丁香酮1.254.37乙酰香草酮1.334.68HBT1.274.47NHA1.284.52

注:1KYA晶體結(jié)構(gòu)中2,5-二甲基苯胺的氨基與Asp206之間的距離為3.20 ?。

介質(zhì)的羥基與1KYA中2,5-二甲基苯胺的氨基均可傳遞質(zhì)子給Asp206。由表1可知，對接結(jié)果經(jīng)能量優(yōu)化后，介質(zhì)中的羥基與Asp206的距離較1KYA中2,5-二甲基苯胺的氨基與Asp206的距離有顯著差異；此外，介質(zhì)與漆酶活性位點(diǎn)對接結(jié)果中His458均遠(yuǎn)離了T1Cu。

2.2.4 LMS質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)制

以上結(jié)果與文獻(xiàn)報道的LMS中介質(zhì)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)制相符，即漆酶首先與介質(zhì)反應(yīng)，介質(zhì)失去氫形成含氮氧自由基或苯氧自由基的活性中間體(圖7)，活性中間體從活性位點(diǎn)脫離再與底物反應(yīng)，奪取底物的氫，從而引發(fā)一系列非酶促反應(yīng)導(dǎo)致底物的降解[15-16]。

圖7 LMS質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)制

據(jù)文獻(xiàn)報道，活性位點(diǎn)中的酸性氨基酸Asp206在真菌漆酶中高度保守，與漆酶底物的pH值依賴性有關(guān)，當(dāng)pH值為弱酸性時，Asp206的羧基發(fā)生解離，活性位點(diǎn)帶上負(fù)電荷，有利于與含羥基或氨基取代基的底物結(jié)合[11]。Asp206作為質(zhì)子受體可接受來自介質(zhì)的質(zhì)子，介質(zhì)羥基與Asp206之間的氫鍵作用有利于質(zhì)子的傳遞。在1KYA中2,5-二甲基苯胺的氨基與Asp206之間距離為3.20 ?，在介質(zhì)與漆酶的對接結(jié)果中，氫鍵距離為1.25～1.33 ?，氫鍵距離的縮短有利于質(zhì)子傳遞。

介質(zhì)在傳遞質(zhì)子的同時發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，堿性氨基酸His458具有接受電子的能力，與Asp206通過質(zhì)子與電子的接受保持體系pH值平衡。His458作為電子受體，將接受的電子再傳遞給T1Cu。His458與T1Cu的距離會對漆酶的氧化電勢產(chǎn)生影響，在對接結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，漆酶活性位點(diǎn)與介質(zhì)作用時，活性位點(diǎn)的氨基酸構(gòu)象會發(fā)生改變，His458均不同程度遠(yuǎn)離了T1Cu。當(dāng)His458遠(yuǎn)離T1Cu時，His458對T1Cu的電子貢獻(xiàn)降低，T1Cu表現(xiàn)出更多“缺電子特性”，導(dǎo)致氧化電勢升高。Leu164、Gly392、Ala393、Ile455與介質(zhì)間的疏水作用使介質(zhì)較好地結(jié)合在漆酶活性位點(diǎn)，Phe265與介質(zhì)苯環(huán)之間的π-π相互作用、Asn264與甲氧基的氫鍵作用有利于介質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定。

3 結(jié)論

基于分子對接技術(shù)研究了漆酶活性位點(diǎn)與5種常見介質(zhì)的結(jié)合模式，漆酶活性位點(diǎn)氨基酸與介質(zhì)相互作用的關(guān)鍵在于酸性氨基酸Asp206與介質(zhì)發(fā)生氫鍵作用，對介質(zhì)中間體的生成有重要作用。酸性氨基酸Asp206可作為質(zhì)子受體，介質(zhì)將質(zhì)子傳遞給Asp206形成介質(zhì)中間體；His458作為電子受體，與Asp206共同維持體系pH值平衡。Leu164、Asn264、Phe265、Gly392、Ala393、Ile455與介質(zhì)發(fā)生疏水作用，其中Phe265還會與介質(zhì)中苯環(huán)發(fā)生π-π相互作用，達(dá)到穩(wěn)定介質(zhì)構(gòu)象的目的。在漆酶與介質(zhì)相互作用過程中，漆酶活性位點(diǎn)某些氨基酸構(gòu)象發(fā)生變化，其中His458遠(yuǎn)離T1Cu，導(dǎo)致漆酶的氧化電勢升高。本研究在分子水平深入闡明了漆酶與介質(zhì)之間的相互作用機(jī)制，為新介質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和現(xiàn)有介質(zhì)的合理改造提供了重要的理論依據(jù)。

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Binding Mode and Interaction Mechanism of Laccase and Mediator Based on Molecular Docking Technique

TAO Guo-xiang1,LI Ai-xiu1,FENG Jia-dong1,ZHANG Min2,ZHAN Li3

(1.DrugDesignLaboratoryoftheBasicScienceDepartment,LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300309,China;2.ScientificResearchDepartment,LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300309,China;3.TrainingDepartment,LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300309,China)

To discuss and reveal the interaction between laccase and mediator in laccase-mediator system,the binding mode of laccase fromTrametesversicolorand 5 kinds of typical mediators was simulated based on a molecular docking technique,the interaction mechanism of laccase and mediators was explained at a molecular level.Results indicated that,amino acid residues Leu164,Asn264,Phe265,Gly392,Ala393,Ile455 were bound with the mediators at laccase active site by hydrophobic force,and Asp206 was bound with the hydroxyl of mediator by hydrogen bond.At the same time,amino acid residues His458 stood off T1Cu,and this might contribute to increase the oxidation potential of laccase.This study provides foundations for further structure design of laccase and mediator,and finding new mediators from natural resources.

laccase;mediator;laccase-mediator system;molecular docking;binding mode;interaction mechanism

武警后勤項(xiàng)目(WJHQ2012-14)，武警后勤學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目(WHZ201201)

2016-07-04

陶國翔(1991-)，男，河北南宮人，碩士研究生，研究方向：計算機(jī)輔助藥物設(shè)計，E-mail：taoguoxiang91@126.com；通訊作者：李愛秀，教授，E-mail：liaixiu2006@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.009

陶國翔，李愛秀，封加棟，等.基于分子對接技術(shù)研究漆酶與介質(zhì)間的結(jié)合模式與相互作用機(jī)制[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(12)：42-47.

O 641 Q 814.9

A

1672-5425(2016)12-0042-06