張 雪，馬玉華，仲偉敏

(貴州省果樹科學(xué)研究所， 貴陽(yáng) 550006)

貴州三葉木通遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

張 雪，馬玉華*，仲偉敏

(貴州省果樹科學(xué)研究所， 貴陽(yáng) 550006)

為科學(xué)保存和利用貴州三葉木通資源，采用AFLP和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)貴州省部分縣(市)的31份三葉木通資源進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析。結(jié)果顯示：(1)兩種標(biāo)記方法分別通過(guò)8對(duì)引物擴(kuò)增出9 252條、11 643條DNA譜帶，多態(tài)性條帶分別為8 818、11 643，擴(kuò)增多態(tài)率分別為95.31%和100%，說(shuō)明供試種質(zhì)資源遺傳多樣性較豐富。(2)AFLP和ISSR方法所得遺傳相似系數(shù)區(qū)間分別為0.762 3～0.893 5和0.828 9～0.917 1，說(shuō)明不同種質(zhì)間存在一定的遺傳差異。(3)聚類分析表明，在遺傳相似系數(shù)0.85處，31份三葉木通種質(zhì)資源分別被聚為5組(AFLP)和3組(ISSR)，其中26號(hào)(7-4-中1)、27號(hào)(8-1-1)、28號(hào)(8-3-中)和30號(hào)(9-3-中1)4個(gè)資源及31號(hào)(9-4-1)和29號(hào)(9-2-S1)2個(gè)資源在兩組分析方法中分別處于同一亞組內(nèi)，說(shuō)明其為親緣關(guān)系較近的樣本，且樣本4號(hào)(2-2-N1)、8號(hào)(3-1-S1)和樣本26號(hào)(7-4-中1)、27號(hào)(8-1-1)兩兩相似系數(shù)最大，可能是同一來(lái)源的種質(zhì)。

三葉木通；遺傳多樣性；親緣關(guān)系；AFLP；ISSR

三葉木通[Akebiatrifoliata( Thunb.) Koidz.]是木通科木通屬一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的半落葉藤本野生果樹[1]，又稱八月瓜、八月炸，是木通屬植物中最具果用價(jià)值的一類，其果實(shí)、種子、莖藤及根系有上千年的應(yīng)用歷史[2-3]。中國(guó)野生三葉木通資源豐富，主要分布在河北、山西、山東、河南、陜西南部、甘肅東南部至長(zhǎng)江流域各省區(qū)。貴州省自然條件優(yōu)越，獨(dú)特的立體氣候孕育了豐富的植物種質(zhì)資源，同時(shí)也是木通的重要產(chǎn)地之一[4]。據(jù)報(bào)道，該類野生果樹資源在貴州共有4屬9種、1新種、2新記錄種、3變種[5]，其分布面廣、種類多且零星分散[6]。調(diào)查顯示省內(nèi)各地將該種野生果樹通稱為‘八月瓜’，但其實(shí)際為木通科中木通屬和八月瓜屬的多個(gè)種[7]，這就造成了品種資源類型多，但資源本身命名不科學(xué)的問(wèn)題，給資源保存和利用帶來(lái)了諸多不便。至今，對(duì)于三葉木通的研究多數(shù)都集中在化學(xué)成分、藥用價(jià)值、生物學(xué)特性、栽培技術(shù)和資源分布等方面，而對(duì)其分子水平上的遺傳多樣性研究及親緣關(guān)系分析還鮮有報(bào)道。

分子標(biāo)記是植物遺傳多樣性研究方法中的一種，是以多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，較形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記等具有不受組織類別、發(fā)育階段、環(huán)境等因素影響的優(yōu)點(diǎn)。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是Vos創(chuàng)立的一項(xiàng)檢測(cè)DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)[8]，具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、DNA用量少等優(yōu)點(diǎn)。AFLP標(biāo)記技術(shù)是一種能較全面展示種質(zhì)資源遺傳特征的分子學(xué)工具，非常適合用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，對(duì)親緣關(guān)系相近的材料進(jìn)行遺傳多樣性研究[9]。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)標(biāo)記是基于簡(jiǎn)單序列而設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列引物，是一種以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，譜帶豐富，可以檢測(cè)到基因組中多個(gè)位點(diǎn)的差異。ISSR標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單、可靠性、重復(fù)性高等特點(diǎn)，已成功應(yīng)用于李[10-13]、桃[14]、杏[15-16]和櫻桃[17]等核果類果樹種質(zhì)資源的鑒定分析。本研究以貴州省內(nèi)三葉木通種質(zhì)資源為試材，通過(guò)AFLP和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析31份野生資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，以期為貴州省三葉木通種質(zhì)資源的科學(xué)保存和利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自貴州省園藝研究所種質(zhì)資源圃，資源來(lái)源地包括貴州西部水城縣、中部的甕安縣、北部的湄潭縣和仁懷市以及東北部的沿河縣(實(shí)際采收地點(diǎn)已屬于重慶市的酉陽(yáng)縣境內(nèi))等地。每個(gè)供試樣本選取樹體中部不同方位的大小均勻、葉色一致的成熟健康葉片10片放入冰盒帶回試驗(yàn)室，洗凈、吸水紙吸干后置于-80℃冰箱中保存。樣品名稱根據(jù)資源圃中定植位置來(lái)命名(表1)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用AFLP和ISSR兩種標(biāo)記方法進(jìn)行分析，基因組提取參照陳大明等[18]的CTAB法并加以修改。

1.2.1 AFLP 1)試劑。限制性內(nèi)切酶MseI和PstI(NEB 公司)，T4連接酶(NEB 公司)，Taq酶、dNTP、引物、B002-1marker、DGL2000 marker均購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

2)酶切及連接體系總體積20 μL，其中DNA模板4 μL， PstI/MseI 2 μL，T4連接酶1 μL，adapter 1 μL，10×reaction buffer 2.5 μL，10 mmol/L ATP 2.5 μL，ddH2O補(bǔ)齊20 μL。

3)預(yù)擴(kuò)增體系總體積為25 μL，PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，72 ℃后延伸5 mim，30個(gè)循環(huán)。

4)根據(jù)預(yù)擴(kuò)增體系對(duì)于64對(duì)引物組合的初步篩選，從中選出條帶相對(duì)豐富且穩(wěn)定的引物組合8對(duì)，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物做1∶20稀釋后作為選擇擴(kuò)增模板，體系總體積為25 μL；第一輪擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃變性30 S，65 ℃退火30 S，72 ℃延伸80 S，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7 ℃，擴(kuò)增12輪；接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23輪，94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，72 ℃后延伸5 min。

表1 樣本序號(hào)及命名

1.2.2 ISSR 1)試劑。Taq酶(2 U/μL)、dNTP (10 mmol/L)、引物(10 mmol/L)、DNA marker均購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

2)ISSR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25 μL，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，72 ℃后延伸10 min，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用GENESCAN3.1軟件對(duì)膠圖進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，每2個(gè)堿基讀1次數(shù)，AFLP分析方法marker片段范圍為 70～500 bp，這樣在70～500 bp之間一共讀取216個(gè)數(shù)，ISSR分析方法marker片段范圍為50～1 000 bp，這樣在該區(qū)間一共讀取475個(gè)數(shù)。AFLP和ISSR為顯性標(biāo)記，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，所用引物對(duì)31份樣品的讀帶記錄結(jié)果形成“1～0”矩陣。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)算多態(tài)性條帶所占比例。

用GENESCAN3.1軟件對(duì)膠圖進(jìn)行分析，通過(guò)Binthere軟件提取樣品的各片段大小，用Excel進(jìn)行0，1數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，通過(guò)NTSYSpc-2.11F軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)原始矩陣用SimQual程序求DICE相似系數(shù)矩陣，并獲得相似系數(shù)矩陣。用 SHAN程序中的 UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，并通過(guò) Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

通過(guò)體系優(yōu)化分別篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性及穩(wěn)定性好的8對(duì)引物進(jìn)行AFLP和ISSR擴(kuò)增。結(jié)果(表2)表明，相同的引物數(shù)量進(jìn)行不同方法的PCR擴(kuò)增，其中AFLP擴(kuò)增總條帶數(shù)為9 252，多態(tài)性條帶數(shù)為8 818條，平均多態(tài)率達(dá)95.31%；而ISSR擴(kuò)增總條帶數(shù)為11 643，多態(tài)性條帶也為11 643，其多態(tài)性比例達(dá)到了100%。2種擴(kuò)增方法獲得的部分DNA圖譜(圖1)顯示，引物A-1和807擴(kuò)增條帶數(shù)分別達(dá)到了1 304和1 572，多態(tài)性條帶占到了98%和100%。從分析方法可知，ISSR較AFLP具有擴(kuò)增條帶豐富，多態(tài)性條帶檢出率高的特點(diǎn)。綜合兩種分析方法，供試材料的平均多態(tài)率達(dá)到了97.6%，說(shuō)明供試的樣品遺傳多樣性比較豐富。

2.2 遺傳多樣性分析

用NTSYSpc-2.11F軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到31個(gè)樣本間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)。基于AFLP的DNA圖譜，所得31個(gè)樣本的遺傳相似系數(shù)位于區(qū)間0.762 3～0.893 5之間，其中樣本4和樣本8的遺傳相似系數(shù)值0.893 5最大，說(shuō)明該兩個(gè)樣本之間親緣關(guān)系最近；22號(hào)和29號(hào)樣本的遺傳相似系數(shù)值0.762 3為最小，說(shuō)明這兩個(gè)樣本間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；ISSR遺傳距離和遺傳相似系數(shù)分析顯示，31個(gè)樣本間的遺傳距離范圍在0.553 2～1.840 8之間，其中遺傳距離最大來(lái)自9號(hào)和27號(hào)之間，遺傳距離最小為26號(hào)和27號(hào)之間。31個(gè)樣本的遺傳相似系數(shù)區(qū)間為0.828 9～0.917 1之間，其中遺傳相似系數(shù)值最小為0.828 9，來(lái)自樣本30號(hào)和15號(hào)之間，最大值為0.917 1，來(lái)自樣本26號(hào)和27號(hào)之間。遺傳相似系數(shù)和遺傳距離在一定程度上顯示的親緣關(guān)系是一致的，26號(hào)和27號(hào)之間遺傳距離最近，遺傳相似系數(shù)也最高。

A. AFLP(引物A-1)； B. ISSR(引物807)； 1～31. 樣品；M. Marker.圖1 兩種標(biāo)記方法的DNA圖譜A . AFLP marker (primer A-1)； B. ISSR (primer 807)；1-31. Samples ； M . MarkerFig.1 The DNA maps of two markers

表2 AFLP和ISSR擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 聚類分析

用NTSYSpc-2.11F軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用 SHAN程序中的 UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，并通過(guò) Tree plot模塊生成聚類圖。(圖2，A)結(jié)果顯示，當(dāng)相似系數(shù)在0.85時(shí)，可將供試的三葉木通資源分為5個(gè)組：第1組包含22個(gè)資源，分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、23、24、25號(hào)；第2組包含21號(hào)和22號(hào)2個(gè)資源；第3組僅為10號(hào)1個(gè)資源；第4組包含26號(hào)、27號(hào)、28號(hào)和30號(hào)4個(gè)資源；第5組包含29號(hào)和31號(hào)2個(gè)資源。

ISSR分析所得31個(gè)資源的聚類圖(圖2，B)顯示，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.85時(shí)，供試資源分為3個(gè)組：第1組包含1號(hào)到25號(hào)；第2組26號(hào)、27號(hào)、28號(hào)和30號(hào)4個(gè)資源；第3組包含29號(hào)和31號(hào)2個(gè)資源。從以上結(jié)果可知，兩組分析方法所得的分組數(shù)雖然不一致，但是26號(hào)、27號(hào)、28號(hào)和30號(hào)4個(gè)資源及29號(hào)和31號(hào)2個(gè)資源在兩組分析方法中分別處于同一亞組內(nèi)，說(shuō)明26號(hào)(7-4-中1)、27號(hào)(8-1-1)、28號(hào)(8-3-中)和30號(hào)(9-3-中1)4個(gè)資源親緣關(guān)系較近，29號(hào)(9-2-S1)和31號(hào)(9-4-1)2個(gè)資源親緣關(guān)系較近。同時(shí)結(jié)果還表明，同一地區(qū)的資源大多能聚集在一起，體現(xiàn)一定的地域性，這種區(qū)域性聚集體現(xiàn)在兩種分析方法的第1組資源中，來(lái)自于貴州省內(nèi)的大部分資源聚為一組。

3 討 論

本研究利用AFLP技術(shù)對(duì)三葉木通31個(gè)資源進(jìn)行了標(biāo)記分析，從研究結(jié)果來(lái)看，8對(duì)引物共獲得多態(tài)性標(biāo)記條帶8 818條，多態(tài)性檢出率為95.31%，較黃佩蓓等[19-20]研究中多態(tài)性比例90.65%稍高，說(shuō)明本研究中AFLP的反應(yīng)體系已達(dá)到最優(yōu)，同時(shí)也說(shuō)明了AFLP技術(shù)對(duì)于三葉木通種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析是適用的。由于AFLP技術(shù)包括了DNA提取、酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增、染色、檢測(cè)、識(shí)別等一系列步驟，涉及的技術(shù)操作面廣且步驟較繁瑣，所以同一資源不同的研究者所得到的結(jié)果也會(huì)有差異，這樣就限制了AFLP的橫向比較。為了提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)同時(shí)選取了ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)三葉木通31個(gè)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，與 AFLP分析方法結(jié)果相互印證。從研究結(jié)果來(lái)看，ISSR標(biāo)記篩選出的8對(duì)引物對(duì)31個(gè)資源的擴(kuò)增多態(tài)率均為100%，說(shuō)明供試資源遺傳多樣性較豐富。

圖中樣品編號(hào)同表1圖2 31個(gè)資源的AFLP(A)和ISSR(B)聚類圖The sample code with Table 1Fig.2 Clustering figure of AFLP(A) and ISSR(B) markers

試驗(yàn)分析中供試種質(zhì)資源多為三葉木通，結(jié)合兩種標(biāo)記方法首先從遺傳多樣性參數(shù)分析來(lái)看，AFLP和ISSR遺傳相似系數(shù)區(qū)間分別為0.762 3～0.893 5、0.828 9～0.917 1，說(shuō)明不同的三葉木通種質(zhì)存在一定的遺傳差異；AFLP分析方法平均遺傳相似系數(shù)為0.827 9，而ISSR分析方法的平均遺傳相似系數(shù)為0.872 5，二者相近；聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.85時(shí)，兩種分析方法分別被聚為5組和3組。雖然兩種方法所得的分組數(shù)不一致，但是從分組的資源來(lái)看，26號(hào)(7-4-中1)、27號(hào)(8-1-1)、28號(hào)(8-3-中)和30號(hào)(9-3-中1)4個(gè)資源及29號(hào)(9-2-S1)和31號(hào)(9-4-1)2個(gè)資源在兩組分析方法中分別處于同一亞組內(nèi)，說(shuō)明對(duì)于親緣關(guān)系較近的資源來(lái)說(shuō)兩種分析方法的結(jié)果是一致的。同時(shí)，被聚為同一組的樣本其形態(tài)性狀具有相似性，如樣本26、27、28和30號(hào)其葉片顏色均為深綠色，果皮顏色為紫紅或淺紫紅。這也表明通過(guò)兩種標(biāo)記方法所得的遺傳相似系數(shù)及聚類分析結(jié)果與樣本形態(tài)性狀分類一致，從而驗(yàn)證了兩種分析方法的數(shù)據(jù)可靠性。表明兩種分析方法均能揭示三葉木通資源的遺傳多樣性，且兩種分析方法的分析結(jié)果相近。

一般情況下，植物資源表型差異越大，可能存在的遺傳變異越大，陳紅等[21]對(duì)貴州李資源遺傳多樣性的研究表明，其聚類結(jié)果與形態(tài)性狀不符合，具有不同性狀的材料聚在一起，同時(shí)來(lái)自不同產(chǎn)地的種質(zhì)沒(méi)有明顯的界限。本研究中，資源9號(hào)(3-3-S1)取自重慶酉陽(yáng)縣，該種質(zhì)與貴州省內(nèi)大部分種質(zhì)資源聚為一類，這可能是因?yàn)槿~木通各種質(zhì)資源在長(zhǎng)期的自然選擇和雜交育種過(guò)程中基因相互滲透，形成了豐富的遺傳多樣性所致[22-23]，這還有待進(jìn)一步的研究。而28號(hào)(8-3-中)和24號(hào)(6-3-S1)兩個(gè)資源雖然同樣來(lái)自水城縣，但是該兩個(gè)品種在兩種分類方法中均不聚于同一組內(nèi)，說(shuō)明該兩個(gè)資源沒(méi)有明顯的地域相關(guān)性，同時(shí)也表明該地區(qū)種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。本研究中31份供試樣本大致可分為3組，其中樣本1號(hào)到25號(hào)為一組，樣本26號(hào)(7-4-中1)、27號(hào)(8-1-1)、28號(hào)(8-3-中)和30號(hào)(9-3-中1)為一組，樣本29號(hào)(9-2-S1)和樣本31號(hào)(9-4-1)為一組；樣本4號(hào)(2-2-N1)、8號(hào)(3-1-S1)和樣本26號(hào)(7-4-中1)、27號(hào)(8-1-1)兩兩相似系數(shù)最大，可能是同一來(lái)源的種質(zhì)。

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(編輯:宋亞珍)

Analysis of Genetic Relationship and Genetic Diversity ofAkebiatrifoliatain Guizhou

ZHANG Xue, MA Yuhua*, ZHONG Weimin

(Guizhou Fruit Institute，Guiyang 550006，China)

For conservation and utilization ofAkebiatrifoliataresources scientifically in Guizhou, we chose two kinds of method called AFLP and ISSR markers to analysis the genetic relationship and genetic diversity aboutA.trifoliatawith total of 31samples. They came from part of the county or city in Guizhou Province. The results showed that: (1) with 8 pairs of primer we gained 9 252 and 11 643 amplification DNA bands, respectively，The polymorphism rates are 95.31% and 100%, respectively, meaning that the germplasm diversity is abundant in tested samples. (2) For AFLP and ISSR, the ranges of similarity coefficient are between 0.762 3 to 0.893 5 and 0.828 9 to 0.917 1 respectively, showing that the resources ofA.trifoliatahas a certain genetic differences between different species in Guizhou. (3) Clustering analysis told us, in the similarity coefficient of 0.85, 31A.trifoliataresources were divided into 5 groups and 3 group, among them the No. 26, No.27, No.28, No.30 samples belong to the same group, as well as No.29 and No.31.Especially No.4, No.8 and No.26, No.27 may be the same source of germplasm，because they got the largest similarity coefficient in each other.

Akebiatrifoliata；genetic diversity；genetic relationship；AFLP；ISSR

1000-4025(2016)11-2192-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2192

2016-09-08;修改稿收到日期:2016-11-10

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng) [黔省專合字(2012)10號(hào)].

張雪(1987-)，女，碩士，助理研究員，主要從事果樹生理及分子生物學(xué)研究。E-mail:zhangxuenl@126.com

*通信作者:馬玉華，博士，副研究員，主要從事果樹生理及生物技術(shù)研究。E-mail:m_yh79@163.com

Q346+.5;Q789

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