陳 敏，馬 琳，賈聰俊，劉希強(qiáng)，龔 攀，王 贊

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

紫花苜蓿赤霉素受體基因的克隆及表達(dá)分析

陳 敏，馬 琳，賈聰俊，劉希強(qiáng)，龔 攀，王 贊*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

赤霉素受體(GID)是赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要成員，直接影響著赤霉素對(duì)植物體效應(yīng)的發(fā)揮。該研究利用同源克隆的方法，首次從紫花苜蓿中克隆得到1個(gè)赤霉素受體基因，命名為MsGID1b。序列分析發(fā)現(xiàn)，MsGID1b基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 053 bp，編碼350個(gè)氨基酸，推測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為39. 839 kD，是一個(gè)無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)的親水性蛋白。序列比對(duì)結(jié)果表明，MsGID1b基因與蒺藜苜蓿MtGID1b基因的核苷酸序列相似性為98%，氨基酸序列相似性為99%，且具有HSL家族典型的HGG和GXSXG保守結(jié)構(gòu)域及GA、DELLA蛋白結(jié)合位點(diǎn)。熒光定量PCR分析表明，MsGID1b基因在紫花苜蓿各組織中的表達(dá)豐度依次為：根>盛花>初花>莖>葉>莢果；經(jīng)GA3、ABA、NaCl、PEG和黑暗誘導(dǎo)后該基因表達(dá)上調(diào)，尤其是在GA3誘導(dǎo)下，MsGID1b基因的表達(dá)量一直維持在較高水平，表明MsGID1b基因可能參與紫花苜蓿的抗逆調(diào)控。

紫花苜蓿；GID1b；同源克隆；表達(dá)模式

赤霉素(GAs)是一類(lèi)重要的植物激素，影響著植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)環(huán)節(jié)，包括種子萌發(fā)，莖桿伸長(zhǎng)，葉片擴(kuò)張，花粉成熟和開(kāi)花誘導(dǎo)等，同時(shí)參與植物對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)[1]。與其他植物激素相比，GAs刺激莖桿節(jié)間伸長(zhǎng)的效果較生長(zhǎng)素更為顯著，且在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高作物產(chǎn)量等方面不存在超最適濃度的抑制作用[2]。多項(xiàng)研究證明，在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育中，GA能協(xié)同其他激素共同調(diào)節(jié)果實(shí)的生長(zhǎng)[3]。水稻和小麥“綠色革命”中的相關(guān)基因均與赤霉素相關(guān)[4-5]，各物種的赤霉素缺失突變體都具有顯著的矮化表型[6]，而赤霉素缺失及不敏感突變體的深入研究則較好地解析了植物中的赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在植物缺少游離赤霉素的情況下，轉(zhuǎn)錄抑制因子DELLA蛋白大量積累在植物細(xì)胞核中，抑制下游基因的表達(dá)；而在活性赤霉素存在的條件下，赤霉素受體蛋白GID1感知并結(jié)合游離GAs，誘導(dǎo)下游DELLA蛋白與其形成三元復(fù)合體，進(jìn)而被泛素E3酶復(fù)合體識(shí)別，最終DELLA蛋白被26S蛋白酶體降解，從而釋放下游基因的表達(dá)，使植株恢復(fù)生理功能[7-9]。

赤霉素受體蛋白GID1的首次分離由UEGUCHI-TANAKA M等[10]于2005年在水稻中完成，隨后，NAKAJIMA M等[11]從擬南芥中克隆得到AtGID1A、AtGID1B和AtGID1C等3個(gè)赤霉素受體基因，它們與水稻中的GID1基因具有高度的相似性，互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AtGID1s可恢復(fù)水稻gid1-1的矮化表型。隨著赤霉素受體的分離，赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑得到了更好的解析[12]。目前，赤霉素受體基因已相繼從楊樹(shù)[13]、棉花[14]、茶樹(shù)[15]、甘藍(lán)型油菜[16]、板栗[17]、蘋(píng)果[18]、葡萄[19]、花生[20]、東方山羊豆[21]等物種中成功分離和表達(dá)。李曉晨等[22]克隆了甘藍(lán)型油菜赤霉素受體基因BnGID1，并在甘藍(lán)型油菜矮化突變體NDF-1中過(guò)量表達(dá)，得到的轉(zhuǎn)基因植株高出對(duì)照49.05 cm，較大程度地恢復(fù)了NDF-1的株高。CAO等[23]將辣椒赤霉素受體基因CaGIDlb.1、CaGIDIb.2、CaGID1c在擬南芥雙突變體gid1agid1c中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CaGID1s能促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)，使植株高度增加。MAURIAT M等[13]在楊樹(shù)中過(guò)表達(dá)赤霉素受體基因PttGID1，得到的轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照植株高，且轉(zhuǎn)基因植株葉片比對(duì)照組細(xì)長(zhǎng)。李俊[24]將東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID在擬南芥中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)速度加快，干重比對(duì)照提高90%～160%；GoGID過(guò)表達(dá)紫花苜蓿后，轉(zhuǎn)基因株系的高度、干鮮重明顯高于對(duì)照組，其中株高比對(duì)照提高 19%～35%，干重比對(duì)照提高 8%～46%；此外，過(guò)表達(dá)GoGID的轉(zhuǎn)基因煙草植株在生物量上得到明顯的提高[21]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)赤霉素受體基因能夠加快植株增長(zhǎng)速度、恢復(fù)株高、提高生物量。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，粗蛋白、維生素和礦物質(zhì)含量豐富，素有“牧草之王”的美譽(yù)，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)一直是紫花苜蓿育種的主要目標(biāo)。然而，紫花苜蓿為同源四倍體(2n=4x=32)，其異花授粉及自交不親和的特性，使得QTL-圖位克隆定位基因較為困難。近年來(lái)，紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系逐漸構(gòu)建成功，為紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因育種提供了良好的技術(shù)支撐[25]。本研究利用同源克隆的方法克隆得到紫花苜蓿赤霉素受體基因，并對(duì)該基因編碼蛋白的理化特性、組織表達(dá)特異性及不同處理下該基因的表達(dá)模式變化進(jìn)行了分析，為該基因后續(xù)的功能驗(yàn)證及培育高產(chǎn)紫花苜蓿品種提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

紫花苜蓿品種‘中苜1號(hào)’(MedicagosativaL. cv. Zhongmu No.1)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所楊青川研究員惠贈(zèng)。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 參照Quick RNA Isolation Kit說(shuō)明書(shū)(北京華越洋生物技術(shù)有限公司)提取總RNA；參照SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen公司)反轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。

1.2.2MsGID1b基因克隆 根據(jù)蒺藜苜蓿GID1b(GenBank登錄號(hào)BN001192.1)的基因序列，利用同源克隆方法，設(shè)計(jì)特異性引物MsGID1b-F和MsGID1b-R(表1)，以‘中苜1號(hào)’cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL，ExTaq0.1 μL， 10×ExTaqBuffer 1 μL，dNTP Mixture 0.8 μL，引物各0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 5.1 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min 15 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min。1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)回收PCR產(chǎn)物，將回收的PCR產(chǎn)物連接pGEM-T Easy Vector(Promega公司)，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化科技有限公司)，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)后，陽(yáng)性克隆送上海英濰捷基有限公司測(cè)序。

表1 試驗(yàn)中所用引物序列

1.2.3 MsGID1b理化性質(zhì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析 采用DNAStar程序分析MsGID1b基因編碼蛋白的氨基酸組成、分子量及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)，SignalP-4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，SOPMA分析軟件預(yù)測(cè)MsGID1b氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析預(yù)測(cè)MsGID1b的親疏水性，PSORT Ⅱ 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位服務(wù)器(http://psort.hgc.jp/form.html)預(yù)測(cè)該蛋白在細(xì)胞中的定位。

用BlastP對(duì)MsGID1b蛋白序列進(jìn)行檢索分析，檢索該蛋白在其他物種中的同源序列，DNAMAN程序進(jìn)行多序列比對(duì)分析，應(yīng)用MEGA7通過(guò)鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4MsGID1b基因組織表達(dá)特異性分析 用Quick RNA Isolation Kit(北京華越洋生物技術(shù)有限公司)分別提取‘中苜1號(hào)’的根、莖、葉、初花期花朵(初花)、盛花期花朵(盛花)和莢果的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，將cDNA稀釋至5 ng/μL用于Real-time PCR。根據(jù)得到的MsGID1bORF序列設(shè)計(jì)特異性引物qMsGID1b-F1和qMsGID1b-R1(表1)，以紫花苜蓿β-actin基因作為內(nèi)參基因，用ABI 7500 Real-time PCR System(ABI公司)，參照SYBRPremixExTaq(TaKaRa公司)使用說(shuō)明書(shū)，采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下：第一步：95 ℃ 預(yù)變性2 min；第二步：95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)組織進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品進(jìn)行2個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用LIVAK K J等[26]的2-ΔΔCt方法分別計(jì)算MsGID1b在各組織中的表達(dá)量，繪制柱狀圖。

1.2.5MsGID1b基因在不同處理下的表達(dá)分析 將‘中苜1號(hào)’種子平鋪于有濾紙的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌水將濾紙浸濕后，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至種子發(fā)芽(24 ℃，16 h光照，8 h黑暗)，將發(fā)芽的種子移至1/2MS營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)25 d后，一部分幼苗分別用0.3 mol·L-1NaCl、15% PEG、0.1×10-3mol·L-1GA3和0.1×10-3mol·L-1ABA處理2、4、8、12和24 h，一部分幼苗黑暗處理12、24、48、72 h。 用Quick RNA Isolation Kit(北京華越洋生物技術(shù)有限公司)提取處理后的植株葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。同1.2.4中的方法進(jìn)行Real-time PCR和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的獲得及生物信息學(xué)分析

PCR擴(kuò)增得到1 285 bp的目的片段(圖1)，通過(guò)SnapGene軟件分析測(cè)序結(jié)果可知，該片段含有一個(gè)1 053 bp的開(kāi)放閱讀框(圖2)。使用BlastN工具對(duì)該序列進(jìn)行檢索，結(jié)果表明，該序列與蒺藜苜蓿MtGID1b、東方山羊豆GoGID和花生AhGID1核苷酸序列的相似性分別為98%、80%和76%，證實(shí)了該序列為紫花苜蓿的GID基因，且該基因在物種間進(jìn)化相對(duì)保守，故將其命名為MsGID1b。

對(duì)MsGID1b編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白包含350個(gè)氨基酸殘基，分子量為39.839

M. DL2000；1. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 紫花苜蓿MsGID1b基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M. DL2000；1. PCR amplified productFig.1 PCR amplified products of MsGID1b

kD，其中堿性氨基酸(K、R)43個(gè)，酸性氨基酸(D、E)44個(gè)，疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)124個(gè)，極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)86個(gè)，其蛋白等電點(diǎn)為7.01。TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖3)，由此推測(cè)該蛋白為非跨膜蛋白。SignalP-4.1Server信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，MsGID1b無(wú)信號(hào)肽(圖4)。SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果表明，MsGID1b氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有33.43% α-螺旋，10% β-轉(zhuǎn)角，21.71%的延伸鏈和34.86%的無(wú)規(guī)則卷曲(圖5)。ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為49.25，為不穩(wěn)定蛋白，總平均親水性值為-0.336，故推測(cè)其為親水性蛋白。

下劃線(xiàn)表示翻譯起始位點(diǎn)；* 表示終止密碼子圖2 紫花苜蓿MsGID1b基因的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Underline indicates translation initiation site; * indicates termination codonFig.2 cDNA sequence and induced amino acid sequence of MsGID1b

圖3 MsGID1b跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Transmembrane structure analysis of MsGID1b

圖4 MsGID1b信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of signal peptide of MsGID1b

藍(lán)色.α螺旋；紅色.延伸鏈；綠色.β轉(zhuǎn)角；橙色.無(wú)規(guī)則卷曲圖5 MsGID1b蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Blue. Alpha helix; Red. Extended strand; Green. Beta turn; Orange. Random coilFig.5 Prediction of secondary structure of MsGID1b

PSORTⅡ蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位服務(wù)器預(yù)測(cè)MsGID1b定位于細(xì)胞質(zhì)、微體和線(xiàn)粒體的可能性依次為45%、40.2%和10%。可能是因細(xì)胞質(zhì)為產(chǎn)生GAs的場(chǎng)所，而微體中含有大量合成GAs的氧化酶[27]。

利用BlastP進(jìn)行保守區(qū)預(yù)測(cè)和功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于α/β折疊水解酶超家族，與蒺藜苜蓿、大豆和花生氨基酸序列的相似性分別為99%、85%和82%。DNAMAN程序?qū)sGID1b及其他物種中的赤霉素受體同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白與其他物種中的赤霉素受體蛋白含有大量同源氨基酸序列，且含有HGG、GXSXG保守結(jié)構(gòu)域以及與GA、DELLA蛋白的結(jié)合作用位點(diǎn)(圖6)。利用MEGA7軟件鄰接法構(gòu)建MsGID1b與其他直系同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖7)，結(jié)果表明，該發(fā)育樹(shù)大致分為兩大分支，單子葉植物水稻、小麥、大麥、玉米、高粱為一支，雙子葉植物擬南芥、蘋(píng)果、花生、東方山羊豆、鷹嘴豆、大豆、蒺藜苜蓿和紫花苜蓿為一支， MsGID1b與雙子葉豆科植物赤霉素受體蛋白同屬一支，其中，與蒺藜苜蓿MtGID1b親緣關(guān)系最近。

MtGID1b. 蒺藜苜蓿(CAP64325.1)；AhGID1. 花生(AIY56606.1)；CaGID1B. 鷹嘴豆(XP_004493628.1)；GoGID. 東方山羊豆(ADO22685.1)；GmGID1B. 大豆(XP_003518940.1)；OsGID1. 水稻(XP_015639961.1)；AtGID1B. 擬南芥(NP_191860.1)；陰影表示同源氨基酸殘基；方框表示與GA或DELLA蛋白的結(jié)合位點(diǎn)；三角形標(biāo)注表示HGG和GXSXG結(jié)構(gòu)域圖6 MsGID1b與其他物種GID蛋白氨基酸序列比對(duì)MtGID1b. Medicago truncatula(CAP64325.1)；AhGID1. Arachis hypogaea(AIY56606.1)；CaGID1B. Cicer arietinum(XP_004493628.1)；GoGID. Galega orientalis(ADO22685.1)；GmGID1B. Glycine max(XP_003518940.1)；OsGID1. Oryza sativa Japonica Group(XP_015639961.1)；AtGID1B. Arabidopsis thaliana(NP_191860.1)；The homologous amino acid residues were indicated with shadow; Black frame contains binding sites of GA and DELLA protein; HGG and GXSXG conserved domains were indicated with triangle frameFig.6 Amino acid sequence alignment of MsGID1b with other related GID proteins

2.2 MsGID1b基因的組織表達(dá)特異性

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得Ct值計(jì)算MsGID1b在各組織的表達(dá)量。結(jié)果表明，MsGID1b在根、莖、葉、初花、盛花和莢果中均有表達(dá)。其中，根中表達(dá)量最高，花中的表達(dá)量次之，莢果中表達(dá)量最低(圖8，A)。這與擬南芥AtGID1B在各組織的表達(dá)模式相似[11]，由此可推測(cè)，MsGID1b對(duì)紫花苜蓿各個(gè)組織的生長(zhǎng)發(fā)育均發(fā)揮作用，尤其是對(duì)根和花的生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響。

節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值代表自舉值；標(biāo)尺上的數(shù)字代表遺傳距離MtGID1b. 蒺藜苜蓿(CAP64325.1)；CaGID1B. 鷹嘴豆(XP_004493628.1)； GmGID1B. 大豆(XP_003518940.1)；GoGID. 東方山羊豆(ADO22685.1)；AhGID1. 花生(AIY56606.1)；MdGID1b.蘋(píng)果(AFD32891.1)；MdGID1c. 蘋(píng)果(AFD32892.1)；AtGID1B.擬南芥(NP_191860.1)；MtGID1a. 蒺藜苜蓿(CAP64324.1)；AtGID1C. 擬南芥(NP_198084.1)；AtGID1A. 擬南芥(NP_187163.1)；TaGID1.小麥(CAP64334.1)；HvGse1.大麥(CAO98733.1)；OsGID1. 水稻(XP_015639961.1)；ZmGID1b. 玉米(CAP64328.1)；SbGID1. 高粱(CAP64329.1)；ZmGID1a. 玉米(CAP64327.1)圖7 MsGID1b蛋白與其他物種GID蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Numbers at nodes indicate bootstrap value derived from 1000 replicates; The scale bar indicates genetic distance MtGID1b. Medicago truncatula(CAP64325.1)；CaGID1B. Cicer arietinum(XP_004493628.1)； GmGID1B. Glycine max(XP_003518940.1)；GoGID. Galega orientalis(ADO22685.1)；AhGID1. Arachis hypogaea(AIY56606.1)；MdGID1b. Malus domestica(AFD32891.1)；MdGID1c. Malus domestica(AFD32892.1)；AtGID1B. Arabidopsis thaliana(NP_191860.1)；MtGID1a. Medicago truncatula(CAP64324.1)；AtGID1C. Arabidopsis thaliana(NP_198084.1)；AtGID1A. Arabidopsis thaliana(NP_187163.1)；TaGID1. Triticum aestivum(CAP64334.1)；HvGse1. Hordeum vulgare(CAO98733.1)；OsGID1. Oryza sativa Japonica Group(XP_015639961.1)；ZmGID1b. Zea mays(CAP64328.1)；SbGID1. Sorghum bicolor(CAP64329.1)；ZmGID1a. Zea mays(CAP64327.1)Fig.7 Phylogenetic tree of MsGID1b and other GID proteins

2.3 MsGID1b基因在不同處理下的表達(dá)

對(duì)不同處理下紫花苜蓿MsGID1b的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明：MsGID1b對(duì)干旱脅迫、鹽脅迫、赤霉素、脫落酸和黑暗處理均有明顯響應(yīng)。在黑暗處理下，MsGID1b表達(dá)量表現(xiàn)為升高，降低再升高的趨勢(shì)(圖8，B)。圖8，C顯示，在GA誘導(dǎo)下，MsGID1b響應(yīng)顯著，在2、4、8和12 h均有較高表達(dá)，在12 h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照的119倍，對(duì)GA處理的顯著表達(dá)可能與該基因編碼赤霉素受體有關(guān)。MsGID1b對(duì)ABA處理響應(yīng)迅速，在2 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，并迅速降低。在鹽脅迫下，MsGID1b的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加而逐漸升高，在8 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后快速降低。干旱脅迫對(duì)其誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，在處理2 h時(shí)，MsGID1b的表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的2 000倍，4 h時(shí)明顯降低，隨后保持穩(wěn)定(圖8，C)，由此推測(cè)，MsGID1b可能參與了紫花苜蓿的抗逆調(diào)控。

圖8 MsGID1b的組織表達(dá)特異性及不同處理下的表達(dá)模式Fig.8 Expression patterns of MsGID1b in different tissues and different treatments

3 討 論

赤霉素受體廣泛存在于植物中，它是赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子。前人在其他物種中成功克隆赤霉素受體基因并在相應(yīng)物種中進(jìn)行過(guò)表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)赤霉素受體基因?qū)χ仓甑纳锪坑酗@著影響。本研究通過(guò)同源克隆的方法分離了紫花苜蓿赤霉素受體基因MsGID1b，序列分析結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白屬于α/β折疊水解酶超家族，包含HSL超家族的HGG、GXSXG保守結(jié)構(gòu)域以及與GA、DELLA蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。不同物種赤霉素受體蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明，紫花苜蓿MsGID1b與蒺藜苜蓿、鷹嘴豆、大豆、東方山羊豆、花生等豆科植物赤霉素受體蛋白相似性很高，其中，與蒺藜苜蓿的相似性為99%，以上結(jié)果表明MsGID1b可能是紫花苜蓿中的一個(gè)赤霉素受體基因。目前，NCBI上已登記注冊(cè)2個(gè)蒺藜苜蓿赤霉素受體基因，玉米、蘋(píng)果、葡萄、陸地棉等物種中也已發(fā)現(xiàn)多個(gè)赤霉素受體基因，紫花苜蓿與蒺藜苜蓿親緣關(guān)系很近，且遺傳關(guān)系復(fù)雜，故推測(cè)紫花苜蓿中的赤霉素受體基因可能是多基因家族。

MsGID1b在紫花苜蓿不同組織中存在顯著的表達(dá)特異性。根中表達(dá)量最高，花中的表達(dá)量次之，莢果中表達(dá)量最低。這與IUCHI S等[28]得出的擬南芥AtGID1B在莖的伸長(zhǎng)中為微效基因，但在根的生長(zhǎng)和花的發(fā)育過(guò)程中為主效基因的結(jié)論一致。由此可以推測(cè)，MsGID1b參與了紫花苜蓿各組織的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，并在植株根生長(zhǎng)和花發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其具體功能還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。研究結(jié)果表明，GA3處理后，MsGID1b的表達(dá)量迅速升高，且一直維持較高水平，這可能是由于在外界赤霉素的刺激下，大量赤霉素受體與赤霉素結(jié)合，從而導(dǎo)致赤霉素受體基因表達(dá)量升高。這與李俊所得東方山羊豆在GA3處理下的結(jié)論一致[21]。資料表明，脫落酸可以誘導(dǎo)許多逆境蛋白基因的表達(dá)，當(dāng)植物受到滲透脅迫時(shí)，其體內(nèi)的脫落酸水平會(huì)急劇上升，同時(shí)出現(xiàn)若干個(gè)特殊基因的表達(dá)產(chǎn)物。倘若植物體并未受到干旱、鹽漬或寒冷引起的滲透脅迫，而只是吸收了相當(dāng)數(shù)量的脫落酸，其體內(nèi)也會(huì)出現(xiàn)這些基因的表達(dá)產(chǎn)物[29]。本研究中，在ABA處理下，MsGID1b在2 h時(shí)迅速升高后急速降低，并一直維持在較低水平，PEG模擬的干旱脅迫處理下，MsGID1b的表達(dá)趨勢(shì)與ABA處理下的一致，而NaCl模擬的鹽脅迫處理下，MsGID1b基因表達(dá)量在8 h時(shí)出現(xiàn)較大幅度的上升，并且NaCl和PEG處理下MsGID1b的表達(dá)量遠(yuǎn)高于ABA處理下的基因表達(dá)量，這與上述資料結(jié)論一致，由此可推測(cè)，MsGID1b基因可能參與植物的抗逆調(diào)控。

IUCHI等[28]通過(guò)單基因、雙基因和三基因的突變證實(shí)了AtGID1A、AtGID1B和AtGID1C等3個(gè)基因的功能特異性及功能冗余。每一個(gè)AtGID1蛋白都能與其相對(duì)應(yīng)的AtDELLA蛋白互作[11]，而GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過(guò)GID1與DELLA蛋白之間的互作，最終引起DELLA蛋白的降解來(lái)實(shí)現(xiàn)的[30-31]。為驗(yàn)證赤霉素受體基因是否能夠影響紫花苜蓿的生物量，還應(yīng)進(jìn)一步探索紫花苜蓿中每個(gè)GID基因的功能特異性和功能冗余，以及與其互作的DELLA蛋白。

綜上所述，本研究從紫花苜蓿中分離了1個(gè)赤霉素受體基因，初步探討了該基因在紫花苜蓿各組織及各處理下的表達(dá)模式，為紫花苜蓿赤霉素受體基因的后續(xù)功能研究奠定了基礎(chǔ)，并為紫花苜蓿分子育種提供了優(yōu)異候選基因。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of Gibberellin Receptor Gene inMedicagosativaL.

CHEN Min, MA Lin, JIA Congjun, LIU Xiqiang, GONG Pan, WANG Zan*

(Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Gibberellin receptor (GID) plays an important role in gibberellin signal transduction pathway, which directly affects plant growth and development. In this study, a gibberellin receptor gene,MsGID1b, was first isolated fromMedicagosativaby homologous cloning. Sequence analysis showed that MsGID1b contains 350 amino acid residues with 39.839 kD molecular weight, and has high nucleotide (98%) and amino acid (99%) similarity with its orthologous gene inMedicagotruncatula. Physical and chemical properties analysis defined that MsGID1b was a kind of hydrophilic protein without signal peptide and transmembrane structures. MsGID1b contains the binding site of GA, DELLA and some conserved domain of hormone-sensitive lipase family (HSL) like HGG and GXSXG. Spatio and temporal expression profile investigated by real-time PCR indicated thatMsGID1bexpressed comprehensively with its highest expression level in root.MsGID1bwas sensitive to GA3, ABA, NaCl, PEG and dark treatments. It maintained a high transcript level under GA3treatment, suggesting thatMsGID1bmight participate in the response of abiotic stress ofM.sativa.

MedicagosativaL.; GID1b; homologous cloning; expression pattern

1000-4025(2016)11-2159-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2159

2016-07-30;修改稿收到日期:2016-10-31

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-35-1)；國(guó)家國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng) (2015 DFR30570)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS10)

陳 敏(1993-)，女，在讀碩士研究生，主要從事牧草基因資源發(fā)掘與利用方面的研究。E-mail：carymin1993@163.com

*通信作者:王 贊，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事草類(lèi)植物種質(zhì)資源創(chuàng)新、重要性狀基因發(fā)掘與利用研究。E-mail：wangzan@caas.cn

Q785;Q786

A