摘要：目的 探討不同濃度及時(shí)間作用下高三尖杉酯堿對(duì)K562細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。方法 使用MTT法在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)不同濃度的高三尖杉酯堿對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響。使用流式細(xì)胞術(shù)在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)不同濃度的高三尖杉酯堿對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 各組濃度的高三尖杉酯堿對(duì)K562細(xì)胞增殖均有抑制作用，其差異與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），HHT 24 h的IC50濃度為0.48 ug/mL，48 h的IC50濃度為0.07 ug/mL，兩組作用時(shí)間的IC50濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。各組濃度的高三尖杉酯堿均可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，其差異與對(duì)應(yīng)的對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ①高三尖杉酯堿對(duì)K562細(xì)胞的增殖有抑制作用，呈時(shí)間及濃度依賴性；②高三尖杉酯堿亦可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，但與濃度和作用時(shí)間不呈正相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：高三尖杉酯堿；K562細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

高三尖杉酯堿（homoharringtonine，HHT）是一種從我國特有的植物海南粗榧（三尖杉屬）中提取分離出的生物堿，它是一種細(xì)胞周期非特異性的抗腫瘤藥。我國學(xué)者已證明HHT對(duì)白血病有顯著的療效[1-2]。為明確HHT在白血病細(xì)胞增殖及凋亡方面的作用，本實(shí)驗(yàn)以K562細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討高三尖杉酯堿對(duì)K562細(xì)胞株的增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 高三尖杉酯堿（杭州民生藥業(yè)），胎牛血清（美國GIBICO公司），RPMI1640培養(yǎng)基（北京索萊寶生物公司），DMSO（美國Amresco公司），MTT（北京全式金公司），Annexin V/7-AAD細(xì)胞凋亡試劑盒（美國BD公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞為慢性髓系白血病急變株，于液氮中凍存。將K562細(xì)胞株復(fù)蘇后，在培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃，5%CO2），根據(jù)生長狀態(tài)定期換液，將細(xì)胞培養(yǎng)至進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期。

1.3 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長期的K562細(xì)胞用培養(yǎng)液將細(xì)胞配成濃度為1×104/ml的細(xì)胞懸液并鋪種于96孔板內(nèi)，每孔鋪種細(xì)胞懸液體積為100 μl；在各實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度（50 ug/ml，5 ug/ml，0.5 ug/ml，0.05 ug/ml，0.005 ug/ml，0.0005 μg/ml）的高三尖杉酯堿，陰性組為細(xì)胞懸液，空白對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基，四周預(yù)留空白孔以PBS填充。鋪板后將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h或48 h。根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組吸光度依照如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，并分別計(jì)算24 h和48 h的IC50濃度。

細(xì)胞增殖抑制率=[1-（藥物組-空白組）/（陰性對(duì)照組-空白組）]×100%。

1.4 Annexin V-PE/7-AAD雙染法流式細(xì)胞術(shù) 實(shí)驗(yàn)分組如上所述。選取生長對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，配制成1×106/ml的細(xì)胞懸液，6孔板每孔加入2 ml的細(xì)胞懸液。各藥物實(shí)驗(yàn)組每孔加入對(duì)應(yīng)濃度梯度的藥物，對(duì)照組加入培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，12 h及24 h。Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測(cè)HHT作用K562細(xì)胞凋亡率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來分析。

2 結(jié)果

2.1高三尖杉酯堿對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組濃度的高三尖杉酯堿對(duì)K562均有抑制作用，呈濃度依賴性，不同濃度組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HHT作用于K562細(xì)胞24 h的IC50為0.48 ug/mL作用48 h的IC50為0.07 ug/mL，兩組作用時(shí)間的IC50濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。除50 ug/mL與5 ug/mL及（P>0.05）比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余組間藥物兩兩比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。HHT為0.005 μg/ml時(shí)，對(duì)K562細(xì)胞即可產(chǎn)生明顯的抑制作用，但當(dāng)濃度達(dá)0.5 ug/mL及以上時(shí)，增殖抑制率無顯著變化（P>0.05）。

2.2 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測(cè)高三尖杉酯堿對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響

HHT可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，且隨藥物濃度增加凋亡率增加并不顯著，早期+晚期凋亡最高可達(dá)8.32%。HHT作用K562細(xì)胞6 h后，各藥物濃度組與陰性對(duì)照組（見圖1）比較，凋亡率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05，見圖2）。HHT各濃度組間比較，凋亡均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05，見圖3）。

3 討論

近年來，關(guān)于HHT聯(lián)合細(xì)胞毒性藥物治療惡性腫瘤，并且表現(xiàn)出增強(qiáng)細(xì)胞毒性作用甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的報(bào)道逐漸增多，HHT也成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果提示高三尖杉酯堿對(duì)K562細(xì)胞的增殖有抑制作用，呈時(shí)間和濃度依賴性，同時(shí)HHT可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，但與濃度和作用時(shí)間不成正相關(guān)性。

HHT在血液腫瘤方面應(yīng)用廣泛，但有心臟毒性、骨髓抑制以及胃腸道反應(yīng)等毒副作用。骨髓抑制主要表現(xiàn)為可逆性的血小板和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)減少。其副作用的發(fā)生率與藥物劑量有關(guān)，同等輸注時(shí)間下，低劑量組患者不良反應(yīng)發(fā)生率低于高劑量組。本次實(shí)驗(yàn)提示HHT可通過抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗白血病效應(yīng)，而且HHT的IC50濃度與HHT對(duì)K562細(xì)胞作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果可為臨床上使用HHT提供指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔡真，林茂芳，Christan W，等.線粒體膜電位在高三尖杉酯堿誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Molt3凋亡中的作用[J].中華血液學(xué)雜志，2001，22（5）：238-240.

[2]李會(huì)波，賽音其木格，白院生.高三尖杉酯堿在血液病治療中的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2011，43（1）：63-65.

[3]Nemunaitis J，Mita A，Stephenson J，et al.Pharmacokinetic study of omacetaxine mepesuccinate administered subcutaneously to patients with advanced solid and hematologic tumors[J].Cancer Chemother Pharmacol，2013，71（1）：35-41.

[4]Kantarjian HM，Talpaz M，Santini V，et al.Homoharringtonine：history，current research，and future directions[J].Cancer，2001，92（6）：1591-1605.

[5]Cortes J，Lipton JH，Rea D，et al.Phase 2 study of subcutaneous omacetaxine mepesuccinate after TKI failure in patients with chronic-phase CML with T315I mutation[J].Blood，2012，120（13）：2573-2580.

編輯/肖慧