摘要：目的 探討miR-150介導(dǎo)鼻咽癌放療抵抗，揭示miR-150作為癌基因作用。方法 Real-time PCR檢測(cè)miR-150在鼻咽癌細(xì)胞系中的含量；將miR-150 模擬物轉(zhuǎn)染CNE-2，miR-150 抑制劑轉(zhuǎn)染CNE-2R，采用MTS檢測(cè)其對(duì)CNE-2細(xì)胞生長的影響。結(jié)果 miR-150在CNE-2R 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。特異性miR-150抑制劑具有逆轉(zhuǎn)CNE-2R細(xì)胞的輻射抗性作用，而轉(zhuǎn)染miR-150 模擬物可增強(qiáng)CNE- 2細(xì)胞的輻射抗性。過表達(dá)miR-150可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的生長。結(jié)論 miR-150參與了鼻咽癌細(xì)胞的放射抵抗，miR-150可能成為一種新的用于合理治療鼻咽癌的治療策略。

關(guān)鍵詞：鼻咽癌；放療抵抗；miR-150

鼻咽癌是一種具有較強(qiáng)局部侵襲力以及早期轉(zhuǎn)移特點(diǎn)的惡性腫瘤。由于其解剖位置特殊且對(duì)放射線較為敏感，放射治療是鼻咽癌最重要的治療方法。然而，放療抵抗仍然是鼻咽癌治療中的一大難題[1]。MicroRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子廣泛參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程。在多種腫瘤中均伴隨有miRNA表達(dá)的失調(diào)，一些miRNA家族顯示出類似癌基因或抑癌基因的功能。研究腫瘤相關(guān)miRNA的切入點(diǎn)一般是通過高通量的芯片篩選。迄今為止，僅有兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)組對(duì)鼻咽癌組織進(jìn)行了miRNA分子差異表達(dá)譜分析，分別發(fā)現(xiàn)了9個(gè)和35個(gè)在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中差異表達(dá)的miRNA，其中有3個(gè)miRNA 分子具有共同變化趨勢(shì)：miRNA 29c、miRNA 34b和miRNA 34c。與正常對(duì)照鼻咽上皮相比，miRNA-29c在鼻咽癌中下調(diào)3～5倍。目前對(duì)miR-150在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的研究尚無人涉足[2]。尤其在鼻咽癌輻射抵抗中所發(fā)揮的作用至今鮮有報(bào)道。

本文通過將抗輻射的鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2R與CNE-2對(duì)比發(fā)現(xiàn)，miR-150在CNE-2R中表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)miR-150可抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長，該研究結(jié)果表明miR-150是評(píng)估鼻咽癌放療敏感性的潛在生物標(biāo)志物，將有助于合理制定鼻咽癌治療策略。

1 材料與方法

1.1主要材料 miR-150 模擬物及scramble購自Ambion公司。

1.2建立CNE-2R與細(xì)胞培養(yǎng) 建立放射抵抗的鼻咽癌細(xì)胞亞系CNE-2R。取指數(shù)生長期的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株，予以依次遞增的放療劑量1Gy，2Gy，4Gy，6Gy和8Gy照射，每個(gè)劑量至少照射三次，直到細(xì)胞增殖到80%再進(jìn)行下一個(gè)劑量的照射，該階段共12個(gè)月。

1.3 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖，根據(jù)CellTiter 96R〇AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Promega公司）說明書方法對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 Real-timePCR檢測(cè) 取適量細(xì)胞，提取用試劑盒（OMEGA Bio-Tek）提取純化miRNA，并利用miScript II RT Kit（QIAGEN）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒（QIAGEN）說明書進(jìn)行Real-time PCR。研究miR-150含量時(shí)，選取RUN6作為內(nèi)參。提取總RNA，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，將細(xì)胞計(jì)數(shù)并接種在6孔板中，確保在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，70%的細(xì)胞匯合。使用Lipofectamine2000（Invitrogen）將濃度均為100nM的miR-150 模擬物，miR-150抑制劑以及相應(yīng)對(duì)照物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染36h后，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-150與CNE-2R細(xì)胞放射抗性相關(guān) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-150在CNE-2R細(xì)胞系中的表達(dá)比在CNE-2細(xì)胞系中高出。在CNE-2R和CNE-2細(xì)胞系中分別進(jìn)行miR-150過表達(dá)與干擾的研究。運(yùn)用特異性miR-150抑制劑抑制CNE-2R中miR-150的功能以此觀察其生物學(xué)特性，通過MTT分析發(fā)現(xiàn)，加入特異性miR-150抑制劑后，CNE-2R放射敏感性明顯提高。而在對(duì)CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-150 模擬物 之后，CNE-2細(xì)胞的放射抗性顯著增加。

2.2過表達(dá)miR-150可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞生長 MTS結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-150組鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的增殖能力在48h、72h、96h后細(xì)胞的增殖能力逐漸增強(qiáng)，與對(duì)照組比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示外源高表達(dá)miR-150表達(dá)均能增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的增殖。

3 討論

鼻咽癌系鼻咽部惡性腫瘤，也是我國最常見的癌腫之一，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著人民健康。鼻咽癌有明顯的地域和種族分布特征，我國南方及東南亞地區(qū)鼻咽癌發(fā)病率高，歐美地區(qū)則少見，僅占全身惡性腫瘤的1%～2%。鼻咽癌發(fā)病隱秘，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生早，且其發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，治療效果也不理想，5年生存率仍徘徊在50%左右。因此，尋找鼻咽癌早期診斷的特異性分子標(biāo)志物對(duì)于實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的早期診斷和闡明其發(fā)病機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義。腫瘤的化療和放療抵抗是鼻咽癌臨床治療中的主要障礙。目前，盡管已經(jīng)建立了許多腫瘤化療或放療耐受的細(xì)胞模型，且進(jìn)行了大量的機(jī)制研究，但仍然存在許多尚待進(jìn)一步深入探討的問題。近年來，大量的研究表明miRNA的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及放化療耐受中起到了重要的作用。miRNA可作為癌癥的重要潛在的預(yù)后指標(biāo)或治療靶點(diǎn)。例如，miR-200b的表達(dá)在耐多西他賽的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中顯著下調(diào)[3]，miR-200可通過調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程從而逆轉(zhuǎn)膀胱癌對(duì)EGFR治療抵抗[4]，并且近期研究發(fā)現(xiàn)，通過在順鉑耐藥舌癌細(xì)胞中重新過表達(dá)miR-200b和miR-15b能夠減少BMI1表達(dá)使該細(xì)胞對(duì)化療重新敏感[5]。對(duì)于鼻咽癌，放射敏感性是鼻咽癌治療成功與否的關(guān)鍵，我們的研究發(fā)現(xiàn)miR-150與CNE-2R細(xì)胞放射抗性相關(guān)，且過表達(dá)miR-150可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的生長，然而關(guān)于miRNA在鼻咽癌放射抗性中的作用仍不清楚，需要更進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1]DeNittis AS， Liu L， Rosenthal DI， et al. Nasopharyngeal carcinoma treated with external radiotherapy， brachytherapy， and concurrent/adjuvant chemotherapy [J]. Am J Clin Oncol， 2002， 25 （1）： 93-95.

[2]HC Chen， GH Chen， YH Chen， et al. MicroRNA deregulation and pathway alterations in nasopharyngeal carcinoma[J].British Journal of Cancer， 2009， 100：1002-1011.

[3]Rui W， Bing F， Hai-Zhu S，et al.Identification of microRNA profiles in docetaxel-resistant human non-small cell lung carcinoma cells （SPC-A1） [J].J Cell Mol Med， 2010， 14（1-2）： 206-214.

[4]Adam L， Zhong M， Choi W， et al. miR-200 expression regulates epithelial-to-mesenchymal transition in bladder cancer cells and reverses resistance to epidermal growth factor receptor therapy [J]. Clin Cancer Res， 2009， 15（16）： 5060-5072.

[5]Sun L， Yao Y， Liu B， et al. MiR-200b and miR-15b regulate chemotherapy-induced epithelial-mesenchymal transition in human tongue cancer cells by targeting BMI1 [J]. Oncogene， 2012， 31（4）： 432-445.

編輯/安樺