摘要：篩選了適合榨菜（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）莖尖帶下胚軸材料組織培養(yǎng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，并對(duì)適合榨菜組織培養(yǎng)的不同氮素總量及不同氮素配比進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比 1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA適合榨菜莖尖帶下胚軸材料生長(zhǎng)；氮素在KNO3用量為950 mg/L、NH4NO3用量為412.5 mg/L時(shí)，組培苗長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)，正常苗數(shù)最多。

關(guān)鍵詞：榨菜（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）；組織培養(yǎng)；氮素營(yíng)養(yǎng)；生長(zhǎng)

中圖分類(lèi)號(hào)：S637.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）16-4298-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.058

榨菜（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）芥菜種葉芥亞種大葉芥變種的變種，由野生芥菜（Brassica juncea）進(jìn)化而來(lái)，是中國(guó)特產(chǎn)蔬菜，在蔬菜加工生產(chǎn)中占有重要的地位。

蕓薹屬作物在離體培養(yǎng)有較多研究，研究者對(duì)大白菜、青花菜和甘藍(lán)等作物的離體培養(yǎng)再生體系進(jìn)行了較為深入的研究[1-5]。近年來(lái)，榨菜離體再生體系的研究也有了較大的進(jìn)展，陳石頭等[6]用浙桐1號(hào)帶柄子葉獲得了高頻不定芽再生體系。沈進(jìn)娟等[7]對(duì)涪陵3個(gè)地方品種榨菜做了詳細(xì)研究，藺市草腰子和郫縣榨菜2個(gè)品種不定芽誘導(dǎo)較為容易，而永安小葉品種不定芽再生困難。氮素營(yíng)養(yǎng)作為離體培養(yǎng)中使用量最大的元素，主要有硝態(tài)氮和銨態(tài)氮兩種存在形式，兩種存在形式及其濃度對(duì)外植體培養(yǎng)有重要的影響。榨菜離體培養(yǎng)主要以MS培養(yǎng)基為主，對(duì)MS培養(yǎng)基中氮素比對(duì)榨菜組織培養(yǎng)影響的研究較少。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為永安小葉榨菜種子，試驗(yàn)材料由渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌苗的獲得 挑選色澤飽滿(mǎn)圓潤(rùn)的榨菜種子在流水下沖洗干凈，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌操作機(jī)臺(tái)用70%的乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗2次，轉(zhuǎn)入0.1%的升汞溶液中進(jìn)行浸泡處理10 min，無(wú)菌水沖洗5次，接種在1/2 MS培養(yǎng)基上，不添加蔗糖、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，瓊脂濃度為5.5 g/L，pH 5.8，光照12 h/d，溫度（25±2） ℃。

1.2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)榨菜離體培養(yǎng)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，配合使用6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L），NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），蔗糖用量30 g/L，瓊脂濃度為5.5 g/L，pH 5.8。每瓶接種6個(gè)帶下胚軸莖尖，每個(gè)處理10瓶，光照12 h/d，溫度（25±2） ℃。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理水平方案見(jiàn)表1，不添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為對(duì)照組（CK）。

1.2.3 氮素總量的變化對(duì)榨菜組培苗的影響 MS培養(yǎng)基中KNO3用量為1 900 mg/L，NH4NO3用量為1 650 mg/L，分別對(duì)KNO3和NH4NO3用量進(jìn)行調(diào)整，各處理中硝酸鉀用量調(diào)整為1 900、950 mg/L，硝酸銨用量調(diào)整為1 650.0、1 237.5、825.0，412.5 mg/L， 8個(gè)處理。培養(yǎng)基中均含有30 g/L蔗糖、5.5 g/L瓊脂，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平由“1.2.2”條件中最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑比例配比，pH 5.8，光照12 h/d，溫度（25±2） ℃，每個(gè)處理15瓶，每瓶接種6個(gè)帶下胚軸莖尖。

1.2.4 不同氮源比對(duì)榨菜組培苗的影響 MS培養(yǎng)基中氮素總量為60 mmol/L，在保證氮素總量不變的情況下，調(diào)整硝態(tài)氮與銨態(tài)氮比。將銨態(tài)氮與硝態(tài)氮比例調(diào)整如下：n（NH4+-N）：n（NO3--N）=（0∶60， 10∶50，20∶40，30∶30，40∶20，50∶10，60∶0），按上述順序試驗(yàn)編號(hào)為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7。其中，Y3中銨態(tài)氮與硝態(tài)氮比為MS培養(yǎng)基中的原始比，設(shè)定為對(duì)照組。試驗(yàn)中硝酸鹽使用KNO3，銨鹽在Y1、Y2、Y3、Y4中使用NH4NO3，Y5、Y6、Y7中使用（NH4）2SO4，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比及用量使用“1.2.2”條件中最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比，蔗糖30 g/L，瓊脂5.5 g/L，pH 5.8，光照12 h/d，溫度（25±2） ℃，每瓶接種帶下胚軸莖尖6個(gè)，每個(gè)處理16瓶。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)榨菜離體培養(yǎng)的影響

本試驗(yàn)采用的6-BA與NAA不同配比，研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)榨菜組培苗的影響。對(duì)照組在不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上均先出根，后出芽。試驗(yàn)組全部先出芽，并未有根出現(xiàn)。由表2可以看出，在NAA濃度一定的情況下，隨著6-BA濃度的升高，榨菜再生的組培苗正常苗數(shù)量先增加后減少。其中，C3、C4號(hào)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比下正常苗數(shù)最多，C3、C4組培苗質(zhì)量相比發(fā)現(xiàn)，C3中的組培苗基部愈傷團(tuán)塊較小，C4中愈傷組織團(tuán)塊較大，因此，C3的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為榨菜莖尖再生的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比（圖1）。

2.2 氮素總量的變化對(duì)榨菜組培苗的影響

MS培養(yǎng)基中富含有高濃度的無(wú)機(jī)鹽離子，特別是硝酸鹽和銨鹽含量較高。本試驗(yàn)主要降低硝酸鹽和銨鹽用量，探索適合榨菜莖尖離體培養(yǎng)的氮素用量。由表3可以看出，KNO3用量分別在1 900和950 mg/L時(shí)，隨著NH4NO3用量的降低，榨菜再生植株正常苗數(shù)量均有一定的提高。其中，KNO3用量為950 mg/L，NH4NO3用量為412.5 mg/L時(shí)，玻璃化、水漬化苗最少，正常苗數(shù)達(dá)到86.67%，與其他處理達(dá)到顯著性差異（圖2）。

2.3 不同氮素比例對(duì)榨菜組培苗的影響

榨菜帶下胚軸莖尖接種后兩周進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)Y5、Y6、Y7 3個(gè)處理出現(xiàn)不同程度的毒害現(xiàn)象（圖3），在含有較高的硝酸鹽、較低銨鹽的培養(yǎng)基上，正常苗數(shù)隨著硝酸鹽含量的增加、銨鹽含量的降低而大幅度提高。因此，榨菜莖尖外植體在富含高濃度硝酸鹽、低濃度銨鹽的條件下更容易生長(zhǎng)。在接種4周后觀察發(fā)現(xiàn)，再生植株在含有較高濃度的硝酸鹽下也出現(xiàn)毒害作用，因此，榨菜帶下胚軸莖尖外植體培養(yǎng)過(guò)程中氮素應(yīng)具備硝酸鹽和銨鹽合適的比例才適宜榨菜莖尖離體培養(yǎng)。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)主要對(duì)于榨菜帶下胚軸莖尖組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的篩選進(jìn)行研究，探索了氮素總量的變化及氮素配比對(duì)榨菜帶下胚軸莖尖組織培養(yǎng)的影響。6-BA（1.5～2.0 mg/L）+NAA 0.3 mg/L生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比適宜榨菜莖尖組織培養(yǎng)，而控制氮素總量能有效地控制莖尖培養(yǎng)中畸形苗、玻璃化苗、水漬化苗的產(chǎn)生，試驗(yàn)得出KNO3用量為950 mg/L，NH4NO3用量為412.5 mg/L，帶下胚軸莖尖外植體長(zhǎng)勢(shì)最好，因此得出最適合榨菜帶下胚軸莖尖外植體的培養(yǎng)基為MS（950 mg/L KNO3，412.5 mg/L NH4NO3，其余元素用量不變）+6-BA（1.5～2.0 mg/L）+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+5.5 g/L瓊脂。

研究結(jié)果表明，適當(dāng)降低硝酸鹽含量、大幅度降低銨鹽含量有利于榨菜帶下胚軸莖尖的培養(yǎng)。單一使用銨鹽，再生植株全部死亡；單一使用硝酸鹽，2周左右再生植株生長(zhǎng)正常，4周以后出現(xiàn)毒害現(xiàn)象，說(shuō)明硝酸鹽和銨鹽在培養(yǎng)基中存在互作。單一使用硝酸鹽，隨著硝酸鹽的吸收，培養(yǎng)基pH逐漸增大，不利于榨菜生長(zhǎng)；單一使用銨鹽，培養(yǎng)基pH迅速降低，對(duì)外植體產(chǎn)生毒害作用，說(shuō)明在榨菜莖尖組織培養(yǎng)過(guò)程中植物對(duì)硝態(tài)氮的吸收強(qiáng)于對(duì)銨態(tài)氮的吸收。與Arnon[8]的結(jié)論相似。植物組織培養(yǎng)過(guò)程中在尚未分化出根的情況下，銨態(tài)氮通過(guò)組織細(xì)胞直接吸收，耐受范圍有限，而硝態(tài)氮通過(guò)被動(dòng)吸收后，在胞質(zhì)中的硝酸還原酶同化一部分硝態(tài)氮，從而擴(kuò)大對(duì)硝態(tài)氮的吸收利用。

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