摘要:篩選了適合榨菜(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)莖尖帶下胚軸材料組織培養(yǎng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,并對(duì)適合榨菜組織培養(yǎng)的不同氮素總量及不同氮素配比進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比 1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA適合榨菜莖尖帶下胚軸材料生長(zhǎng);氮素在KNO3用量為950 mg/L、NH4NO3用量為412.5 mg/L時(shí),組培苗長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu),正常苗數(shù)最多。
關(guān)鍵詞:榨菜(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee);組織培養(yǎng);氮素營(yíng)養(yǎng);生長(zhǎng)
中圖分類(lèi)號(hào):S637.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2016)16-4298-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.058
榨菜(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)是十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)芥菜種葉芥亞種大葉芥變種的變種,由野生芥菜(Brassica juncea)進(jìn)化而來(lái),是中國(guó)特產(chǎn)蔬菜,在蔬菜加工生產(chǎn)中占有重要的地位。
蕓薹屬作物在離體培養(yǎng)有較多研究,研究者對(duì)大白菜、青花菜和甘藍(lán)等作物的離體培養(yǎng)再生體系進(jìn)行了較為深入的研究[1-5]。近年來(lái),榨菜離體再生體系的研究也有了較大的進(jìn)展,陳石頭等[6]用浙桐1號(hào)帶柄子葉獲得了高頻不定芽再生體系。沈進(jìn)娟等[7]對(duì)涪陵3個(gè)地方品種榨菜做了詳細(xì)研究,藺市草腰子和郫縣榨菜2個(gè)品種不定芽誘導(dǎo)較為容易,而永安小葉品種不定芽再生困難。氮素營(yíng)養(yǎng)作為離體培養(yǎng)中使用量最大的元素,主要有硝態(tài)氮和銨態(tài)氮兩種存在形式,兩種存在形式及其濃度對(duì)外植體培養(yǎng)有重要的影響。榨菜離體培養(yǎng)主要以MS培養(yǎng)基為主,對(duì)MS培養(yǎng)基中氮素比對(duì)榨菜組織培養(yǎng)影響的研究較少。
1 材料與方法
1.1 供試材料
供試材料為永安小葉榨菜種子,試驗(yàn)材料由渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 無(wú)菌苗的獲得 挑選色澤飽滿(mǎn)圓潤(rùn)的榨菜種子在流水下沖洗干凈,轉(zhuǎn)移到無(wú)菌操作機(jī)臺(tái)用70%的乙醇浸泡30 s,無(wú)菌水沖洗2次,轉(zhuǎn)入0.1%的升汞溶液中進(jìn)行浸泡處理10 min,無(wú)菌水沖洗5次,接種在1/2 MS培養(yǎng)基上,不添加蔗糖、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,瓊脂濃度為5.5 g/L,pH 5.8,光照12 h/d,溫度(25±2) ℃。
1.2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)榨菜離體培養(yǎng)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基,配合使用6-BA(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L),NAA(0.1、0.2、0.3 mg/L),蔗糖用量30 g/L,瓊脂濃度為5.5 g/L,pH 5.8。每瓶接種6個(gè)帶下胚軸莖尖,每個(gè)處理10瓶,光照12 h/d,溫度(25±2) ℃。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理水平方案見(jiàn)表1,不添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為對(duì)照組(CK)。
1.2.3 氮素總量的變化對(duì)榨菜組培苗的影響 MS培養(yǎng)基中KNO3用量為1 900 mg/L,NH4NO3用量為1 650 mg/L,分別對(duì)KNO3和NH4NO3用量進(jìn)行調(diào)整,各處理中硝酸鉀用量調(diào)整為1 900、950 mg/L,硝酸銨用量調(diào)整為1 650.0、1 237.5、825.0,412.5 mg/L, 8個(gè)處理。培養(yǎng)基中均含有30 g/L蔗糖、5.5 g/L瓊脂,生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平由“1.2.2”條件中最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑比例配比,pH 5.8,光照12 h/d,溫度(25±2) ℃,每個(gè)處理15瓶,每瓶接種6個(gè)帶下胚軸莖尖。
1.2.4 不同氮源比對(duì)榨菜組培苗的影響 MS培養(yǎng)基中氮素總量為60 mmol/L,在保證氮素總量不變的情況下,調(diào)整硝態(tài)氮與銨態(tài)氮比。將銨態(tài)氮與硝態(tài)氮比例調(diào)整如下:n(NH4+-N):n(NO3--N)=(0∶60, 10∶50,20∶40,30∶30,40∶20,50∶10,60∶0),按上述順序試驗(yàn)編號(hào)為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7。其中,Y3中銨態(tài)氮與硝態(tài)氮比為MS培養(yǎng)基中的原始比,設(shè)定為對(duì)照組。試驗(yàn)中硝酸鹽使用KNO3,銨鹽在Y1、Y2、Y3、Y4中使用NH4NO3,Y5、Y6、Y7中使用(NH4)2SO4,生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比及用量使用“1.2.2”條件中最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比,蔗糖30 g/L,瓊脂5.5 g/L,pH 5.8,光照12 h/d,溫度(25±2) ℃,每瓶接種帶下胚軸莖尖6個(gè),每個(gè)處理16瓶。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)榨菜離體培養(yǎng)的影響
本試驗(yàn)采用的6-BA與NAA不同配比,研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)榨菜組培苗的影響。對(duì)照組在不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上均先出根,后出芽。試驗(yàn)組全部先出芽,并未有根出現(xiàn)。由表2可以看出,在NAA濃度一定的情況下,隨著6-BA濃度的升高,榨菜再生的組培苗正常苗數(shù)量先增加后減少。其中,C3、C4號(hào)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比下正常苗數(shù)最多,C3、C4組培苗質(zhì)量相比發(fā)現(xiàn),C3中的組培苗基部愈傷團(tuán)塊較小,C4中愈傷組織團(tuán)塊較大,因此,C3的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為榨菜莖尖再生的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比(圖1)。
2.2 氮素總量的變化對(duì)榨菜組培苗的影響
MS培養(yǎng)基中富含有高濃度的無(wú)機(jī)鹽離子,特別是硝酸鹽和銨鹽含量較高。本試驗(yàn)主要降低硝酸鹽和銨鹽用量,探索適合榨菜莖尖離體培養(yǎng)的氮素用量。由表3可以看出,KNO3用量分別在1 900和950 mg/L時(shí),隨著NH4NO3用量的降低,榨菜再生植株正常苗數(shù)量均有一定的提高。其中,KNO3用量為950 mg/L,NH4NO3用量為412.5 mg/L時(shí),玻璃化、水漬化苗最少,正常苗數(shù)達(dá)到86.67%,與其他處理達(dá)到顯著性差異(圖2)。
2.3 不同氮素比例對(duì)榨菜組培苗的影響
榨菜帶下胚軸莖尖接種后兩周進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)Y5、Y6、Y7 3個(gè)處理出現(xiàn)不同程度的毒害現(xiàn)象(圖3),在含有較高的硝酸鹽、較低銨鹽的培養(yǎng)基上,正常苗數(shù)隨著硝酸鹽含量的增加、銨鹽含量的降低而大幅度提高。因此,榨菜莖尖外植體在富含高濃度硝酸鹽、低濃度銨鹽的條件下更容易生長(zhǎng)。在接種4周后觀察發(fā)現(xiàn),再生植株在含有較高濃度的硝酸鹽下也出現(xiàn)毒害作用,因此,榨菜帶下胚軸莖尖外植體培養(yǎng)過(guò)程中氮素應(yīng)具備硝酸鹽和銨鹽合適的比例才適宜榨菜莖尖離體培養(yǎng)。
3 小結(jié)與討論
本試驗(yàn)主要對(duì)于榨菜帶下胚軸莖尖組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的篩選進(jìn)行研究,探索了氮素總量的變化及氮素配比對(duì)榨菜帶下胚軸莖尖組織培養(yǎng)的影響。6-BA(1.5~2.0 mg/L)+NAA 0.3 mg/L生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比適宜榨菜莖尖組織培養(yǎng),而控制氮素總量能有效地控制莖尖培養(yǎng)中畸形苗、玻璃化苗、水漬化苗的產(chǎn)生,試驗(yàn)得出KNO3用量為950 mg/L,NH4NO3用量為412.5 mg/L,帶下胚軸莖尖外植體長(zhǎng)勢(shì)最好,因此得出最適合榨菜帶下胚軸莖尖外植體的培養(yǎng)基為MS(950 mg/L KNO3,412.5 mg/L NH4NO3,其余元素用量不變)+6-BA(1.5~2.0 mg/L)+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+5.5 g/L瓊脂。
研究結(jié)果表明,適當(dāng)降低硝酸鹽含量、大幅度降低銨鹽含量有利于榨菜帶下胚軸莖尖的培養(yǎng)。單一使用銨鹽,再生植株全部死亡;單一使用硝酸鹽,2周左右再生植株生長(zhǎng)正常,4周以后出現(xiàn)毒害現(xiàn)象,說(shuō)明硝酸鹽和銨鹽在培養(yǎng)基中存在互作。單一使用硝酸鹽,隨著硝酸鹽的吸收,培養(yǎng)基pH逐漸增大,不利于榨菜生長(zhǎng);單一使用銨鹽,培養(yǎng)基pH迅速降低,對(duì)外植體產(chǎn)生毒害作用,說(shuō)明在榨菜莖尖組織培養(yǎng)過(guò)程中植物對(duì)硝態(tài)氮的吸收強(qiáng)于對(duì)銨態(tài)氮的吸收。與Arnon[8]的結(jié)論相似。植物組織培養(yǎng)過(guò)程中在尚未分化出根的情況下,銨態(tài)氮通過(guò)組織細(xì)胞直接吸收,耐受范圍有限,而硝態(tài)氮通過(guò)被動(dòng)吸收后,在胞質(zhì)中的硝酸還原酶同化一部分硝態(tài)氮,從而擴(kuò)大對(duì)硝態(tài)氮的吸收利用。
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