摘要：篩選了適合榨菜（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）莖尖帶下胚軸材料組織培養(yǎng)的生長調節(jié)劑，并對適合榨菜組織培養(yǎng)的不同氮素總量及不同氮素配比進行了研究。結果表明，生長調節(jié)劑配比 1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA適合榨菜莖尖帶下胚軸材料生長；氮素在KNO3用量為950 mg/L、NH4NO3用量為412.5 mg/L時，組培苗長勢最優(yōu)，正常苗數(shù)最多。

關鍵詞：榨菜（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）；組織培養(yǎng)；氮素營養(yǎng)；生長

中圖分類號：S637.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4298-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.058

榨菜（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）芥菜種葉芥亞種大葉芥變種的變種，由野生芥菜（Brassica juncea）進化而來，是中國特產蔬菜，在蔬菜加工生產中占有重要的地位。

蕓薹屬作物在離體培養(yǎng)有較多研究，研究者對大白菜、青花菜和甘藍等作物的離體培養(yǎng)再生體系進行了較為深入的研究[1-5]。近年來，榨菜離體再生體系的研究也有了較大的進展，陳石頭等[6]用浙桐1號帶柄子葉獲得了高頻不定芽再生體系。沈進娟等[7]對涪陵3個地方品種榨菜做了詳細研究，藺市草腰子和郫縣榨菜2個品種不定芽誘導較為容易，而永安小葉品種不定芽再生困難。氮素營養(yǎng)作為離體培養(yǎng)中使用量最大的元素，主要有硝態(tài)氮和銨態(tài)氮兩種存在形式，兩種存在形式及其濃度對外植體培養(yǎng)有重要的影響。榨菜離體培養(yǎng)主要以MS培養(yǎng)基為主，對MS培養(yǎng)基中氮素比對榨菜組織培養(yǎng)影響的研究較少。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為永安小葉榨菜種子，試驗材料由渝東南農業(yè)科學院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得 挑選色澤飽滿圓潤的榨菜種子在流水下沖洗干凈，轉移到無菌操作機臺用70%的乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗2次，轉入0.1%的升汞溶液中進行浸泡處理10 min，無菌水沖洗5次，接種在1/2 MS培養(yǎng)基上，不添加蔗糖、生長調節(jié)劑，瓊脂濃度為5.5 g/L，pH 5.8，光照12 h/d，溫度（25±2） ℃。

1.2.2 不同生長調節(jié)劑配比對榨菜離體培養(yǎng)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，配合使用6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L），NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），蔗糖用量30 g/L，瓊脂濃度為5.5 g/L，pH 5.8。每瓶接種6個帶下胚軸莖尖，每個處理10瓶，光照12 h/d，溫度（25±2） ℃。生長調節(jié)劑處理水平方案見表1，不添加生長調節(jié)劑作為對照組（CK）。

1.2.3 氮素總量的變化對榨菜組培苗的影響 MS培養(yǎng)基中KNO3用量為1 900 mg/L，NH4NO3用量為1 650 mg/L，分別對KNO3和NH4NO3用量進行調整，各處理中硝酸鉀用量調整為1 900、950 mg/L，硝酸銨用量調整為1 650.0、1 237.5、825.0，412.5 mg/L， 8個處理。培養(yǎng)基中均含有30 g/L蔗糖、5.5 g/L瓊脂，生長調節(jié)劑水平由“1.2.2”條件中最佳生長調節(jié)劑比例配比，pH 5.8，光照12 h/d，溫度（25±2） ℃，每個處理15瓶，每瓶接種6個帶下胚軸莖尖。

1.2.4 不同氮源比對榨菜組培苗的影響 MS培養(yǎng)基中氮素總量為60 mmol/L，在保證氮素總量不變的情況下，調整硝態(tài)氮與銨態(tài)氮比。將銨態(tài)氮與硝態(tài)氮比例調整如下：n（NH4+-N）：n（NO3--N）=（0∶60， 10∶50，20∶40，30∶30，40∶20，50∶10，60∶0），按上述順序試驗編號為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7。其中，Y3中銨態(tài)氮與硝態(tài)氮比為MS培養(yǎng)基中的原始比，設定為對照組。試驗中硝酸鹽使用KNO3，銨鹽在Y1、Y2、Y3、Y4中使用NH4NO3，Y5、Y6、Y7中使用（NH4）2SO4，生長調節(jié)劑配比及用量使用“1.2.2”條件中最佳生長調節(jié)劑配比，蔗糖30 g/L，瓊脂5.5 g/L，pH 5.8，光照12 h/d，溫度（25±2） ℃，每瓶接種帶下胚軸莖尖6個，每個處理16瓶。

2 結果與分析

2.1 不同生長調節(jié)劑配比對榨菜離體培養(yǎng)的影響

本試驗采用的6-BA與NAA不同配比，研究不同生長調節(jié)劑配比對榨菜組培苗的影響。對照組在不添加任何生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基上均先出根，后出芽。試驗組全部先出芽，并未有根出現(xiàn)。由表2可以看出，在NAA濃度一定的情況下，隨著6-BA濃度的升高，榨菜再生的組培苗正常苗數(shù)量先增加后減少。其中，C3、C4號生長調節(jié)劑配比下正常苗數(shù)最多，C3、C4組培苗質量相比發(fā)現(xiàn)，C3中的組培苗基部愈傷團塊較小，C4中愈傷組織團塊較大，因此，C3的生長調節(jié)劑配比為榨菜莖尖再生的最佳生長調節(jié)劑配比（圖1）。

2.2 氮素總量的變化對榨菜組培苗的影響

MS培養(yǎng)基中富含有高濃度的無機鹽離子，特別是硝酸鹽和銨鹽含量較高。本試驗主要降低硝酸鹽和銨鹽用量，探索適合榨菜莖尖離體培養(yǎng)的氮素用量。由表3可以看出，KNO3用量分別在1 900和950 mg/L時，隨著NH4NO3用量的降低，榨菜再生植株正常苗數(shù)量均有一定的提高。其中，KNO3用量為950 mg/L，NH4NO3用量為412.5 mg/L時，玻璃化、水漬化苗最少，正常苗數(shù)達到86.67%，與其他處理達到顯著性差異（圖2）。

2.3 不同氮素比例對榨菜組培苗的影響

榨菜帶下胚軸莖尖接種后兩周進行觀察統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)Y5、Y6、Y7 3個處理出現(xiàn)不同程度的毒害現(xiàn)象（圖3），在含有較高的硝酸鹽、較低銨鹽的培養(yǎng)基上，正常苗數(shù)隨著硝酸鹽含量的增加、銨鹽含量的降低而大幅度提高。因此，榨菜莖尖外植體在富含高濃度硝酸鹽、低濃度銨鹽的條件下更容易生長。在接種4周后觀察發(fā)現(xiàn)，再生植株在含有較高濃度的硝酸鹽下也出現(xiàn)毒害作用，因此，榨菜帶下胚軸莖尖外植體培養(yǎng)過程中氮素應具備硝酸鹽和銨鹽合適的比例才適宜榨菜莖尖離體培養(yǎng)。

3 小結與討論

本試驗主要對于榨菜帶下胚軸莖尖組織培養(yǎng)中生長調節(jié)劑配比的篩選進行研究，探索了氮素總量的變化及氮素配比對榨菜帶下胚軸莖尖組織培養(yǎng)的影響。6-BA（1.5～2.0 mg/L）+NAA 0.3 mg/L生長調節(jié)劑配比適宜榨菜莖尖組織培養(yǎng)，而控制氮素總量能有效地控制莖尖培養(yǎng)中畸形苗、玻璃化苗、水漬化苗的產生，試驗得出KNO3用量為950 mg/L，NH4NO3用量為412.5 mg/L，帶下胚軸莖尖外植體長勢最好，因此得出最適合榨菜帶下胚軸莖尖外植體的培養(yǎng)基為MS（950 mg/L KNO3，412.5 mg/L NH4NO3，其余元素用量不變）+6-BA（1.5～2.0 mg/L）+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+5.5 g/L瓊脂。

研究結果表明，適當降低硝酸鹽含量、大幅度降低銨鹽含量有利于榨菜帶下胚軸莖尖的培養(yǎng)。單一使用銨鹽，再生植株全部死亡；單一使用硝酸鹽，2周左右再生植株生長正常，4周以后出現(xiàn)毒害現(xiàn)象，說明硝酸鹽和銨鹽在培養(yǎng)基中存在互作。單一使用硝酸鹽，隨著硝酸鹽的吸收，培養(yǎng)基pH逐漸增大，不利于榨菜生長；單一使用銨鹽，培養(yǎng)基pH迅速降低，對外植體產生毒害作用，說明在榨菜莖尖組織培養(yǎng)過程中植物對硝態(tài)氮的吸收強于對銨態(tài)氮的吸收。與Arnon[8]的結論相似。植物組織培養(yǎng)過程中在尚未分化出根的情況下，銨態(tài)氮通過組織細胞直接吸收，耐受范圍有限，而硝態(tài)氮通過被動吸收后，在胞質中的硝酸還原酶同化一部分硝態(tài)氮，從而擴大對硝態(tài)氮的吸收利用。

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