摘要：R2D2蛋白廣泛分布于各種生物體中，R2D2是siRNA介導(dǎo)的RNA干擾途徑中的關(guān)鍵組分。R2D2含有一個(gè)串聯(lián)的dsRNA結(jié)合功能域，與Dcr-2在體內(nèi)形成雜合二聚體，在siRNA裝載入RISC時(shí)發(fā)揮作用。本研究克隆了褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l）R2D2基因（NLR2D2），結(jié)果表明，NLR2D2基因全長(zhǎng) 1 673 bp，含有一個(gè)長(zhǎng)1 005 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼335個(gè)氨基酸。NLR2D2蛋白與螞蟻親緣關(guān)系最近。利用qRT-PCR檢測(cè)NLR2D2基因在褐飛虱不同發(fā)育階段的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NLR2D2轉(zhuǎn)錄本在褐飛虱的所有發(fā)育階段都有表達(dá)，在1齡若蟲(chóng)中表達(dá)量最低，隨著生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)量逐漸升高。NLR2D2基因的序列特征和表達(dá)譜非常保守，為其功能的分析提供了信息。

關(guān)鍵詞：褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l）；R2D2基因；克?。槐磉_(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）16-4294-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.057

從原蟲(chóng)、真菌到植物，從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物，RNA干擾（RNA Interference，RNAi）廣泛存在于生物界中。RNA沉默依賴于21～30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的小RNA分子，分為3種類(lèi)型：小干擾RNA（Small interfering RNAs，siRNA）、微小RNA（MicroRNAs，miRNA）及Piwi相關(guān)的干擾RNA（Piwi-associated interfering RNAs，piRNAs）。Dicer-2（Dcr-2）、Argonaute-2（AGO2）和雙鏈RNA結(jié)合蛋白R(shí)2D2是siRNA介導(dǎo)的RNA干擾途徑中的3個(gè)關(guān)鍵組分。Dicer-2/R2D2復(fù)合物不僅產(chǎn)生siRNA，還能結(jié)合siRNA（依賴于R2D2的dsRNA結(jié)合區(qū)域），并促進(jìn)siRNA與siRISC的結(jié)合。在這個(gè)過(guò)程中R2D2可視為連接RNAi起始階段和效應(yīng)階段的橋梁。Dicer-2、R2D2除了作用于siRNA的產(chǎn)生外，還作用于siRNA的解旋，解旋的siRNA則可作用于啟動(dòng)siRISC[1]。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅敲除R2D2基因后，F(xiàn)HV的滴度顯著上升[2]，對(duì)果蠅DXV的感受性也極顯著提高（P<0.01）[3]。

褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l）屬同翅目飛虱科昆蟲(chóng)，又稱褐稻虱。褐飛虱是水稻主要害蟲(chóng)之一，在中國(guó)長(zhǎng)江流域和華南及西南廣大稻區(qū)發(fā)生頻繁、危害嚴(yán)重[4]。本研究從褐飛虱體內(nèi)分離得到R2D2基因，分析了R2D2基因的全長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)，并對(duì)其在發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)進(jìn)行分析，以期為研究其進(jìn)化提供新的資料，為研究褐飛虱R2D2基因的功能和在RNAi中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 褐飛虱品種（生物型Ⅱ）為武漢大學(xué)收藏，飼養(yǎng)在感蟲(chóng)水稻品種臺(tái)中1號(hào)（TN1）植株上，環(huán)境條件為（25±2） ℃，80%的相對(duì)濕度，光照培養(yǎng)16 h/d，黑暗培養(yǎng)8 h/d。

1.1.2 試劑 試驗(yàn)所用大腸桿菌E. coli DH5α、Ex Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T克隆載體、5′-Full RACE和3′-Full RACE試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。引物合成及序列測(cè)定由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 使用總RNA提取試劑盒RNAiso Plus提取褐飛虱發(fā)育時(shí)期的總RNA，將溶于無(wú)核酸酶水中的RNA置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 cDNA克隆 利用Apis mellifera的RLC蛋白（RISC-loading complex subunit tarbp2-like）（GenBank登錄號(hào)：552226）在褐飛虱的ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bphest.dna.affrc.go.jp/）中進(jìn)行TBLASTN查詢，找到褐飛虱的EST片段（GenBank登錄號(hào)：NLHT2093）。以該EST序列為模板設(shè)計(jì)RACE引物，以提取的總RNA為模板，使用RACE試劑盒分別合成5′和3′RACE cDNA。以合成的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行Outer PCR反應(yīng)和Inner PCR反應(yīng)，反應(yīng)引物見(jiàn)表1。Outer PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，20個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。Inner PCR反應(yīng)程序與以上程序相同，只是改為30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物利用寶生物工程（大連）有限公司試劑盒回收，與pMD18-T載體連接，陽(yáng)性克隆送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)R2D2基因轉(zhuǎn)錄差異 取-80 ℃保存不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期褐飛虱總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得褐飛虱的cDNA。在Roteogene 6000TM定量PCR儀（Corbett research）上進(jìn)行10 μL體系的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，以30～40個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94 ℃變性20 s， 55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s），每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，取平均值。以褐飛虱Actin作為參照基因，采用2-ΔΔCt方法[5]比較不同樣品基因表達(dá)水平。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 對(duì)5’ RACE序列和3’ RACE序列測(cè)序后拼接獲得cDNA全長(zhǎng)序列。用ExPASy Translate tool軟件（http：//web.expasy.org/translate/）進(jìn)行翻譯得到相應(yīng)cDNA編碼框的預(yù)測(cè)，再利用下列在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的功能域及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)：用Clustalw（http：//www.genome.jp/tools/clustalw/）進(jìn)行同源序列比對(duì)；用MEGA4.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的繪制；用ExPASy Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）進(jìn)行分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分析；用http：//npsa-pbil.ibcp.fr/進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱R2D2基因的克隆

以褐飛虱EST序列為模板設(shè)計(jì)RACE引物，克隆得到NlRLC基因的5’cDNA片段和3’cDNA片段（圖1），5’cDNA序列長(zhǎng)度約為693 bp，3’cDNA序列長(zhǎng)度約為679 bp。

2.2 R2D2蛋白質(zhì)分析鑒定

全長(zhǎng)序列經(jīng)過(guò)測(cè)序拼接后，全長(zhǎng)為1 673 bp （圖2），含有一個(gè)編碼335個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF），預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為37.4 ku，等電點(diǎn)為5.46。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，R2D2蛋白質(zhì)α螺旋占36.72%，延伸鏈占23.28%，隨機(jī)卷曲占40.00%（圖3）。

利用NCBI Conserved Domains Server分析表明，該開(kāi)放閱讀框包含2個(gè)DSRM（Double-stranded RNA binding motif）功能域（圖4）。第一個(gè)有66氨基酸，并定位于第5至70氨基酸上；第二個(gè)有66氨基酸，并定位于第106至171氨基酸上。同時(shí)還含有多個(gè)rnc（ribonuclease Ⅲ）結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 R2D2分子進(jìn)化分析

用NLR2D2編碼的氨基酸序列與蜜蜂A.mellifera（XP_001121349），螞蟻A.echinatior（EGI 67607），熊蜂王B.terrestris（XP_003395928），雄蜂B.impatiens（XP_003485505），金小蜂N(xiāo).vitripennis（XP_001601132），囊舌蟲(chóng)S.kowalevskii（XP_002739212），非洲爪蟾X.laevis（NP_001085574），安樂(lè)蜥A.carolinensis（XP_ 003216784），熱帶爪蟾X.tropicalis（NP_001025646）中的R2D2進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，R2D2與螞蟻、蜜蜂和熊蜂王中的R2D2聚類(lèi)在一起，親緣關(guān)系較近，而與其他昆蟲(chóng)的R2D2亞族成員親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)（圖5）。

2.4 褐飛虱R2D2基因不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

為了解R2D2基因在褐飛虱不同生長(zhǎng)發(fā)育階段蟲(chóng)體中轉(zhuǎn)錄情況，分別提取1齡至5齡若蟲(chóng)和雌雄成蟲(chóng)蟲(chóng)體的總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)該基因在褐飛虱不同發(fā)育階段蟲(chóng)體中的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著蟲(chóng)體的長(zhǎng)大，R2D2基因表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，同時(shí)在雄成蟲(chóng)的表達(dá)量較高（圖6）。

3 小結(jié)與討論

本研究克隆得到NLR2D2基因的全長(zhǎng)，并且將氨基酸序列與其他昆蟲(chóng)的R2D2進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與螞蟻的R2D2蛋白在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近。對(duì)褐飛虱R2D2蛋白序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)α螺旋占36.72%，延伸鏈占23.28%，隨機(jī)卷曲占40.00%。同時(shí)鑒定了NLR2D2基因在褐飛虱不同生長(zhǎng)發(fā)育階段蟲(chóng)體的轉(zhuǎn)錄情況，該基因在雄性成蟲(chóng)的表達(dá)量較高。因此，褐飛虱NLR2D2基因的表達(dá)特征表明，利用農(nóng)藥防治褐飛虱的最佳時(shí)期是早期。這些結(jié)果有利于開(kāi)發(fā)一些以NLR2D2基因?yàn)榘袠?biāo)的安全有效的殺蟲(chóng)劑，同時(shí)可以利用RNA干擾的方法來(lái)抑制R2D2蛋白的表達(dá)，達(dá)到控制害蟲(chóng)的目的。

參考文獻(xiàn)：

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