摘要：利用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用和內(nèi)標(biāo)定量技術(shù)建立了水體和斑馬魚體內(nèi)土臭素（Gsm）和二甲基異冰片（2-Mib）的分析方法，并利用該方法研究水體中Gsm和2-Mib在斑馬魚體內(nèi)的富集和暫養(yǎng)效果。結(jié)果表明，水體中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率范圍為97.2%～109.9%和88.5%～101.6%，斑馬魚中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率范圍為78.5%～87.2%和88.3%～91.4%；水體中不同濃度的Gsm和2-Mib能在魚體內(nèi)較快富集，魚體內(nèi)Gsm和2-Mib濃度和水體中的濃度成正相關(guān)；魚體內(nèi)Gsm和2-Mib的濃度和暫養(yǎng)時間成反相關(guān)，但降低較慢。水體中的Gsm和2-Mib通過魚鰓和體表迅速富集到魚體中，成為魚體土腥味來源的主要外源因子，清水暫養(yǎng)對土腥味物質(zhì)Gsm和2-Mib的去除有一定作用，但仍需配合其他去除方法使用效果更佳。

關(guān)鍵詞：土臭素；2-甲基異冰片；固相微萃取；氣質(zhì)聯(lián)用；暫養(yǎng)

中圖分類號：X174 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4272-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.051

魚類相比陸生動物能為人們提供更加營養(yǎng)安全的動物蛋白，但由于捕獲前特有的異味物質(zhì)直接影響魚類產(chǎn)品的品質(zhì)，使得產(chǎn)品價值大打折扣，對水產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來很大的負(fù)面影響[1]。魚類捕獲前異味化合物主要來源于水體和餌料，目前為止已報道導(dǎo)致魚體產(chǎn)生土腥味的最常見的兩種物質(zhì)為Gsm和2-Mib[2～6]，來源于水生微生物（如藍(lán)藻）的次生代謝產(chǎn)物，都具有雙環(huán)叔醇結(jié)構(gòu)。盡管Gsm和2-Mib在環(huán)境中的濃度很低，但由于其極低的異味閾值，因此仍是魚體異味產(chǎn)生的主要貢獻(xiàn)化合物[7，8]。本試驗結(jié)合固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用的方法建立水體和斑馬魚體中Gsm和2-Mib的內(nèi)標(biāo)法定量分析方法，并利用該方法結(jié)合斑馬魚暴露和暫養(yǎng)試驗分析Gsm和2-Mib在魚體內(nèi)的富集和暫養(yǎng)去除效果，為捕獲前魚體內(nèi)土腥味物質(zhì)的形成機制及控制措施提供方法與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用斑馬魚購自中國科學(xué)院水生生物研究所，Gsm和2-Mib標(biāo)品、1-氯癸烷、飽和食鹽水等其他試劑均為分析純。

7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀，DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器，CAR/DVB固相微萃取萃取頭和手柄。

1.2 方法

1.2.1 氣質(zhì)聯(lián)用儀條件 參照文獻(xiàn)[9-12]，色譜柱：DB-5MS彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：柱初溫30 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至60 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min，最后以20 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣流量1 mL/min；不分流；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度 150 ℃；電子能量 70 eV；離子質(zhì)量掃描范圍（m/z）45～350，設(shè)定Gsm和2-Mib的SIM定量離子。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取10 mL ddH2O和 3 g斑馬魚肉加入7 mL飽和食鹽水溶液的混合勻漿液，再分別加入5 ng 1-氯癸烷內(nèi)標(biāo)和混標(biāo)（Gsm和2-Mib）0.2、0.5、1、2、5、10和20 ng，將裝配好的CAR/DVB萃取頭插入頂空瓶中。在集熱式恒溫磁力攪拌器中60 ℃恒溫萃取50 min，取出萃取頭插入氣相進(jìn)樣口，熱解析5 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為Gsm和2-Mib與內(nèi)標(biāo)的濃度比，縱坐標(biāo)為Gsm和2-Mib與內(nèi)標(biāo)的峰面積比。

1.2.3 添加回收率 分別取10 mL ddH2O和3 g 斑馬魚肉加入7 mL飽和食鹽水溶液的混合勻漿液，再分別加入5 ng 1-氯癸烷內(nèi)標(biāo)和混標(biāo)（Gsm和2-Mib），使水溶液中Gsm和2-Mib的終濃度分別為0.1、0.3、0.5、1.0 μg/L（每個添加濃度3個平行），將裝配好的CAR/DVB萃取頭插入頂空瓶中。在集熱式恒溫磁力攪拌器中60 ℃恒溫萃取50 min，取出萃取頭插入氣相進(jìn)樣口，熱解析5 min。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度與實際添加濃度的比值，計算添加回收率。

1.2.4 斑馬魚暴露富集試驗 將4月齡斑馬魚養(yǎng)殖在混標(biāo)濃度分別為1 μg/L和0.1 μg/L的水樣中，暴露0、2、7 d后分別采集水樣和魚樣，利用建立的固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用的方法測定樣品中Gsm和2-Mib的濃度。

1.2.5 斑馬魚暫養(yǎng)試驗 將暴露7 d的斑馬魚暫養(yǎng)在不含Gsm和2-Mib的清水中，養(yǎng)殖0、2、7 d分別采集水樣和魚樣，利用建立的固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用的方法測定樣品中Gsm和2-Mib的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍、檢測限和添加回收率

利用混標(biāo)配制范圍為0.02～2.0 μg/L的系列濃度梯度，經(jīng)固相微萃取富集處理后進(jìn)氣質(zhì)分析，以信噪比S/N=3所對映的被測化合物濃度作為方法的檢出限（LOD）（表1）。

添加回收率試驗以Gsm和2-Mib的標(biāo)準(zhǔn)曲線為計算基礎(chǔ)，每個添加濃度設(shè)置5個平行，水樣中混標(biāo)的添加終濃度分別為0.1、0.3、0.5和1.0 μg/L，斑馬魚體中混標(biāo)的添加終濃度分別為0.3、0.5和1.0 μg/L。

從表2可看出，水樣中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率分別為97.2%～109.9%和88.5%～101.6%，并且5個平行添加濃度間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，表明建立的固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用方法重現(xiàn)性好，可用于實際水體樣品中Gsm和2-Mib的定量檢測分析。

從表3可以看出，斑馬魚樣中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率分別為78.5%～87.2%和88.3%～91.4%，比水樣中的回收率要低，可能跟魚樣中含脂量高相關(guān)。魚樣中5個平行添加濃度間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，表明建立的固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用方法重現(xiàn)性好，可用于實際斑馬魚樣品中Gsm和2-Mib的定量檢測分析。

2.2 Gsm和2-Mib在斑馬魚體內(nèi)的富集

本試驗分析了暫養(yǎng)過程中（0、2和7 d）水體和斑馬魚體內(nèi)Gsm和2-Mib的濃度變化情況。從圖1和圖2可以看出，水樣中Gsm和2-Mib的濃度隨暫養(yǎng)時間延長而逐漸降低，2 d內(nèi)水樣中Gsm和2-Mib的濃度明顯下降，低濃度時水樣中Gsm下降速率較2-Mib要快。

從圖3和圖4可以看出，斑馬魚暴露在不同濃度Gsm和2-Mib的水體中，2 d內(nèi)Gsm和2-Mib會迅速富集到斑馬魚體內(nèi)，并且Gsm的富集速率明顯比2-Mib要快。

2.3 Gsm和2-Mib的清水暫養(yǎng)結(jié)果

研究了暫養(yǎng)對斑馬魚體內(nèi)Gsm和2-Mib的去除效果，分析了暫養(yǎng)過程中（0、2和7 d）斑馬魚體內(nèi)Gsm和2-Mib的濃度變化情況。從圖5和圖6可以看出，不同濃度Gsm和2-Mib暴露7 d的斑馬魚經(jīng)清水暫養(yǎng)后，斑馬魚體內(nèi)Gsm和2-Mib的濃度隨暫養(yǎng)時間延長而逐漸降低，但去除較緩慢。

3 小結(jié)與討論

Gsm和2-Mib兩種土腥味物質(zhì)已有大量研究報道，但主要是有關(guān)水體異味化合物的研究[13，14]，特別是飲用水中的含量測定和脫除方法研究，近年來已有研究人員開展魚體內(nèi)Gsm和2-Mib測定方法的研究報道，如王國超等[15]利用微波蒸餾-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜方法建立了羅非魚體中Gsm和2-Mib的定量分析方法，薛勇等[16]利用微波蒸餾提取-固相微萃取富集-氣質(zhì)聯(lián)用的方法建立了鳙魚體內(nèi)Gsm和2-Mib的定量測定方法。但利用模型魚類研究魚體內(nèi)Gsm和2-Mib的富集和清水暫養(yǎng)的研究鮮有報道。

本試驗利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了水體和斑馬魚體中Gsm和2-Mib的內(nèi)標(biāo)定量分析方法。水樣中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率分別為97.2%～109.9%和88.5%～101.6%，并且5個平行添加濃度間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，檢測限均為5 ng/L；斑馬魚樣中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率分別為78.5%～87.2%和88.3%～91.4%，魚樣中5個平行添加濃度間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，檢測限分別為21.2 ng/L和11.5 ng/L；說明所建立的定量分析方法可用于實際水體和斑馬魚樣品中Gsm和2-Mib的定量檢測分析。魚體中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率都比水樣中要低，可能跟魚樣中含脂量高從而影響Gsm和2-Mib在萃取頭上的富集有關(guān)。

利用建立的方法通過暴露和清水暫養(yǎng)試驗研究了不同濃度Gsm和2-Mib在魚體內(nèi)的富集和暫養(yǎng)去除效果，斑馬魚暴露在不同濃度Gsm和2-Mib的水體中，2 d內(nèi)水體中Gsm和2-Mib的濃度迅速降低，斑馬魚體內(nèi)的Gsm和2-Mib濃度迅速升高；然后隨暴露時間的延長，水體中Gsm和2-Mib的濃度逐漸降低，斑馬魚體內(nèi)Gsm和2-Mib的濃度逐漸升高，并且Gsm的富集速率明顯比2-Mib要快，魚體內(nèi)異味化合物的濃度和暴露初始濃度成正相關(guān)。從而說明環(huán)境水體中的Gsm和2-Mib是魚體產(chǎn)生土腥味的主要外源化合物，通過鰓和魚體表進(jìn)入魚體富集。Gsm的富集速率和富集倍數(shù)明顯比2-Mib大，這也可能是文獻(xiàn)報道魚體中常能檢測到Gsm，而檢測不到2-Mib的客觀原因。

清水暫養(yǎng)試驗結(jié)果表明，隨暫養(yǎng)時間的延長，斑馬魚體內(nèi)的Gsm和2-Mib的濃度也逐漸降低，但去除效果不明顯，說明魚體中脂溶性的Gsm和2-Mib很難僅通過清水暫養(yǎng)來達(dá)到好的去除效果，需結(jié)合其他去除方法方能為人們提供優(yōu)質(zhì)安全可接受的動物蛋白源。

參考文獻(xiàn)：

[1] VARLET V，PROST C，SEROT T.Volatile aldehydes in smoked fish：Analysis methods，occurrence and mechanisms of formation[J].Food Chemistry，2007，105：1536-1556.

[2] 宋立榮，李 林，陳 偉，等.水體異味及其藻源次生代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展[J].水生生物學(xué)報，2004，28（4）：434-439.

[3] 江 健，王錫昌，陳西瑤.頂空固相微萃取與GC-MS聯(lián)用法分析淡水魚肉氣味成分[J].現(xiàn)代食品科技，2005，22（2）：219-222.

[4] 王錫昌，陳俊卿.頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用法分析鰱肉中風(fēng)味成分[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報，2005，14（2）：176-180.

[5] 徐立蒲.魚池中二甲基異莰醇和土臭味素的含量、來源及產(chǎn)生影響因素的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[6] JONSDOTTIR R，OLAFSDOTTIR G，CHANIE E，et al.Volatile compounds suitable for rapid detection as quality indicators of cold smoked salmon[J].Food Chemistry，2008，109（1）：184-195.

[7] 馬曉雁，高乃云，李青松，等.飲用水中異嗅物質(zhì)-土臭素及二甲基異冰片的測定方法[J].環(huán)境污染與防治，2006，28（8）：631-636.

[8] 伍瑞祥，吳 濤.淡水魚土腥味物質(zhì)及脫腥技術(shù)研究進(jìn)展[J].長江大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，8（10）：253-256.

[9] 羅妮娜，吳清盛，李 峰，等.頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測定水中嗅味化合物[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（2）：544-545，548.

[10] 譽絢儀，陳 鋒，華 勃.固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測定水中痕量土臭素和二甲基異崁醇[J].環(huán)境科技，2015，28（1）：48-53.

[11] EVA K，KATERINA R，JANA H，et al. Development of an SPME-GC-MS/MS procedure for the monitoring of 2-phenoxyethanol in anaesthetised fish[J].Talanta，2008，75（4）：1082-1088.

[12] NAKAMURA S D，DAISHIMA S K.Simultaneous determination of 22 volatile organic compounds，methyl-tert-butyl ether，1，4-dioxane，2-methylisoborneol and geosmin in water by headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta，2005，548：79-85.

[13] 宋帥帥，王曉波，田立平，等.固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測定水體中的土臭素和二甲基異冰片[J].供水技術(shù)，2014，8（3）：50-52.

[14] 林 麒，呂華東，許冬梅，等.吹掃捕集-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測定水中土臭素和二甲基異莰醇[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010， 20（11）：2763-2765.

[15] 王國超，李來好，郝淑賢，等.羅非魚肉中土臭素和2-甲基異莰醇的測定[J].食品科學(xué)，2011（22）：188-191.

[16] 薛 勇，王 超，于 剛，等.鳙魚肉中土腥味物質(zhì)的測定方法[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2010（5）：1094-1100.