摘要：采用水浴加熱、酸化和鹽析相結(jié)合的方法對(duì)鬼針草（Bidens bipinnata）中葉蛋白質(zhì)進(jìn)行提取。單因子和多因子正交試驗(yàn)分析了料液比、氯化鈉加入量、pH、水浴溫度4個(gè)因素對(duì)葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率的影響。結(jié)果表明，影響葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率的因素依次為料液比>氯化鈉加入量>水浴溫度>pH，最佳工藝條件為料液比1∶20（g∶mL），氯化鈉加入量4%，pH 4，水浴溫度70 ℃。

關(guān)鍵詞：鬼針草（Bidens bipinnata）；粗蛋白質(zhì)；氯化鈉；提取工藝

中圖分類號(hào)：S567.21+9；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）16-4250-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.045

鬼針草（Bidens bipinnata）又名婆婆針，為菊科鬼針草屬一年生草本植物。鬼針草營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)、微量元素和維生素的含量高，其中粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)18.9%，富含17種人體必需的氨基酸；同時(shí)鬼針草對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求低，水濕地均可生長(zhǎng)，在西南各省資源量極為可觀，因而是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的葉蛋白資源[1-3]。近年來(lái)，隨著獸牧業(yè)的迅速發(fā)展及人均耕地面積的減少，蛋白質(zhì)資源緊缺現(xiàn)象日益嚴(yán)重，因此國(guó)外學(xué)者都非常重視葉蛋白（又稱植物濃縮蛋白）飼料的生產(chǎn)利用和開(kāi)發(fā)研究，并取得了較大進(jìn)展。當(dāng)前用于生產(chǎn)濃縮葉蛋白的主要原料有苜蓿、甘薯、紫云英等[4-9]，而對(duì)鬼針草葉蛋白的提取應(yīng)用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)利用貴州省黔西南地區(qū)豐富的鬼針草資源，采用水浴加熱、堿化和鹽析相結(jié)合的方法[10-13]對(duì)葉蛋白的提取工藝進(jìn)行研究，旨在為鬼針草葉蛋白飼料的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期鬼針草，于2014年7月23日刈割于貴州省黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園附近草地，為自然形成的單一鬼針草叢，收獲地上莖葉。刈割的鬼針草風(fēng)干粉碎后過(guò)60目篩，備用。測(cè)定鬼針草草粉原料中粗蛋白質(zhì)含量為17.6%。

1.2 試劑與儀器

試驗(yàn)試劑有氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉；試驗(yàn)儀器有CP64電子分析天平（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）、恒溫水浴鍋、組織搗碎機(jī)（上海汗諾儀器有限公司）、Starter 3C酸度計(jì)（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）、低速離心機(jī)、烘箱、K12全自動(dòng)定氮儀（上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn) 稱取鬼針草草粉10 g于錐形瓶中，按設(shè)定比例加入氯化鈉，預(yù)浸過(guò)夜，抽濾，得到綠色汁液，調(diào)節(jié)到設(shè)定pH，按設(shè)定溫度水浴加熱5 min，靜置1 h，抽濾得葉蛋白膏，65 ℃烘箱中烘干，得葉蛋白成品。稱質(zhì)量，并測(cè)定葉蛋白中粗蛋白質(zhì)的含量。①設(shè)定料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL，下同），加入氯化鈉2%，pH為2.0，水浴溫度70 ℃。②氯化鈉加入量設(shè)定為2%、4%、6%、8%、10%。料液比1∶15，調(diào)節(jié)pH為2.0，水浴溫度70 ℃。③pH設(shè)定為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0。料液比1∶15，加入氯化鈉2%，水浴溫度70 ℃。④水浴溫度設(shè)定為60、70、80、90、100 ℃。料液比1∶15，加入氯化鈉2%，pH為2.0。

1.3.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為簡(jiǎn)化試驗(yàn)，以鬼針草蛋白質(zhì)提取率為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)料液比、氯化鈉、pH、水浴溫度進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

鬼針草草粉和葉蛋白取物中的粗蛋白質(zhì)含量使用凱氏定氮法測(cè)定。3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

蛋白質(zhì)提取率=

■×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1可見(jiàn)，料液比對(duì)葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率的影響變化幅度較大。料液比大于1∶20時(shí)，葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率隨著料液比的減小而增加。料液比小于1∶20時(shí)，葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率基本上是隨著料液比的減少而減少。料液比1∶15、1∶25時(shí)葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率與料液比1∶20時(shí)葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率差異顯著。當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，蛋白提取率最高，達(dá)28.72%。

由圖2可見(jiàn)，氯化鈉加入量小于4%時(shí)葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率隨著氯化鈉加入量加大而增加。氯化鈉加入量大于4%，葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率隨著氯化鈉加入量加大而減少。氯化鈉加入量為2%、6%時(shí)葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率與4%葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率差異顯著。氯化鈉加入量為4%時(shí)，葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率最高，達(dá)26.12%。

由圖3可見(jiàn)，pH為2～4時(shí)葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率差異不明顯。pH為5時(shí)，葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率顯著下降，pH為6時(shí)葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率回升。當(dāng)pH為3時(shí)，葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率較高，為25.14%。

由圖4可見(jiàn)，水浴溫度小于70 ℃時(shí)，葉蛋白的的粗蛋白質(zhì)提取率隨著水浴溫度的加大而增加。水浴溫度大于70 ℃，葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率趨于穩(wěn)定，70～90 ℃時(shí)葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率差異不明顯。水浴溫度為80 ℃時(shí)葉蛋白的粗蛋白質(zhì)提取率最高，為25.31%。

2.2 正交試驗(yàn)

料液比、氯化鈉加入量、pH、水浴溫度按L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，按照極差R的大小可知影響蛋白質(zhì)提取率主次順序?yàn)锳>B>D>C，即料液比>氯化鈉加入量>水浴溫度>pH。在最優(yōu)條件A2B2C1D3即料液比1∶20，氯化鈉加入量4%，pH 2，水浴溫度為90 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率為29.61%。但在正交試驗(yàn)表中A2B2C3D1組合的蛋白質(zhì)提取率為30.06%，即料液比1∶20，氯化鈉加入量4%，pH 4.0，水浴溫度為70 ℃。

3 小結(jié)與討論

植物葉蛋白質(zhì)的提取方法很多，如直接加熱、酸化、堿化、鹽析、乙醇、聚乙二醇和丙酮有機(jī)沉淀、重金屬變性、等電法等。有資料顯示[14]植物葉蛋白質(zhì)提取酸化加熱法比堿化加熱法蛋白質(zhì)提取率更高。本試驗(yàn)采用了水浴加熱、堿化和鹽析相結(jié)合的方法對(duì)鬼針草葉蛋白進(jìn)行提取，試驗(yàn)采用的試劑無(wú)毒無(wú)害、食用安全，提取方法簡(jiǎn)單可行，且提取效果較好。而用其他方法提取，如乙醇、丙酮使用比例較大，只適合小劑量提取；重金屬鹽、聚乙二醇有毒性；而等電法則不易操作。

不同料液比、氯化鈉加入量、pH、水浴溫度對(duì)鬼針草蛋白質(zhì)提取率均有不同程度的影響。料液比太小，蛋白質(zhì)不能充分溶解；而料液比過(guò)大，影響沉淀效果，且使設(shè)備體積增大，降低生產(chǎn)效率。鹽在預(yù)浸時(shí)可增加鬼針草草粉中蛋白質(zhì)的溶解，在水浴加熱中則降低蛋白質(zhì)的溶解度，使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出。而酸化、水浴加熱可使蛋白質(zhì)變性沉淀從而增加蛋白質(zhì)的提取率。

鬼針草葉蛋白質(zhì)提取最佳工藝條件為料液比1∶20，氯化鈉加入量4%，pH 4，水浴溫度70 ℃。資料表明[14]鬼針草草粉的粉碎程度、預(yù)浸時(shí)間及水浴加熱時(shí)間也是影響鬼針草葉蛋白提取率的主要因素，本試驗(yàn)未予考慮，有待在以后的試驗(yàn)中進(jìn)一步探討。

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