摘要：采用不同密度（12、20、32、40、52、60尾/m2）飼養(yǎng)克氏原螯蝦（Procambarus clarkill）[體重（2.4±0.2） g]2個月，分別計算其相對生長率、成活率、附肢完整率，測定其肝胰腺中酸性磷酸酶（ACP）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LZM）活性，旨在了解飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦生長、成活和抗病力的影響，尋找此規(guī)格克氏原螯蝦適宜的養(yǎng)殖密度。結(jié)果表明，隨著飼養(yǎng)密度的增加，克氏原螯蝦的生長率、成活率、附肢完整率及肝胰腺的ACP、T-SOD、LZM活性均顯著下降?？紤]到既要能充分利用水體資源又要獲得最大的生長率和成活率，綜合分析后認為，20尾/m2的飼養(yǎng)密度為此規(guī)格克氏原螯蝦適宜的飼養(yǎng)密度。

關(guān)鍵詞：飼養(yǎng)密度；克氏原螯蝦（Procambarus clarkill）；成活率；免疫酶

中圖分類號：S963.73；S966.12 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4237-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.042

養(yǎng)殖密度是影響水體生產(chǎn)力的重要因素。養(yǎng)殖者為了充分利用水體資源獲得更大的產(chǎn)量，往往進行高密度養(yǎng)殖。然而，養(yǎng)殖密度不僅是影響?zhàn)B殖容量的主要因素，還與水生生物的生長和存活率有密切聯(lián)系。鄧夢穎等[1]研究了養(yǎng)殖密度對克氏原螯蝦（Procambarus clarkill）幼蝦生長、攝食和餌料利用的影響，結(jié)果表明，隨著飼養(yǎng)密度的增加，克氏原螯蝦幼蝦的體長、特定生長率、平均日增重、成活率和蛻殼率都隨之減小且降幅明顯；飼料利用方面，平均攝食量和攝食率均與養(yǎng)殖密度呈反比，蛋白質(zhì)特定生長率和脂肪儲積率隨養(yǎng)殖密度增大呈減小趨勢。肖鳴鶴等[2]研究了養(yǎng)殖密度對克氏原螯蝦幼蝦生長、消化酶活力和生理生化指標的影響，結(jié)果表明，高密度養(yǎng)殖對克氏原螯蝦幼蝦生長和消化酶活力具有一定的負面影響，并隨著養(yǎng)殖密度的增大，克氏原螯蝦幼蝦肌肉中葡萄糖的含量呈下降趨勢，甘油三酯、總蛋白質(zhì)、尿素氮和膽固醇含量呈不斷增多的趨勢，肝胰腺葡萄糖、甘油三酯、總蛋白質(zhì)和尿素氮含量隨養(yǎng)殖密度的增大也呈不斷增多的趨勢。本試驗旨在研究養(yǎng)殖密度對克氏原螯蝦體內(nèi)免疫相關(guān)酶的影響，以期探討高密度養(yǎng)殖條件下克氏原螯蝦死亡率高的原因和機制以及較為適宜的養(yǎng)殖密度。

1 材料與方法

1.1 材料

克氏原螯蝦幼蝦購自南京高淳縣水產(chǎn)養(yǎng)殖公司；試驗飼料原料購自南京市水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖實驗基地。

酸性磷酸酶（ACP）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LZM）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗是在南京曉莊學院生態(tài)學省級重點建設(shè)學科水產(chǎn)動物生理生態(tài)研究室內(nèi)的18個水族箱中進行的。試驗設(shè)置6個養(yǎng)殖密度處理組，在相同的水族箱（底面積0.25 m2、水深0.3 m）中分別放養(yǎng)3、5、8、10、13、15尾幼蝦[體長（3.5±0.2） cm，體重（2.4±0.2） g]，每個處理組3個重復(fù)，對應(yīng)養(yǎng)殖密度分別為12、20、32、40、52、60尾/m2（表1）。

1.2.2 飼養(yǎng)方法 試驗用克氏原螯蝦先馴養(yǎng)7 d，待供試蝦適應(yīng)環(huán)境、生活正常后，挑選健康狀況良好、附肢齊全、大小基本相同的克氏原螯蝦稱重后隨機放入18個水族箱中。各箱隨機排列，并放置適量水草、假山石或帶孔的磚塊供克氏螯原蝦躲避和休息。

試驗期間及馴養(yǎng)期所用飼料為依據(jù)克氏原螯蝦幼蝦營養(yǎng)需要而制備的硬顆粒配合飼料（粒徑為1.2 mm）。配方為：魚粉5.0%、豆餅35.0%、菜餅5.0%、棉餅5.0%、次粉35.0%、麥麩5.0%、皮糠5.0%、磷酸氫鈣1.5%，沸石粉2.0%、鹽0.5%、預(yù)混料1.0%。試驗用水為曝氣后的自來水。試驗期間水溫為室內(nèi)自然溫度（21～28 ℃），全天24 h充氣增氧。各處理組分別在每天清晨和傍晚一日兩次投喂等量的飼料并做記錄，投喂量為每箱蝦體重的5%，每周調(diào)整一次。每次投喂前1 h吸凈前次糞便和殘飼后再投喂。每3 d換水1次，每次換水1/3，連續(xù)飼養(yǎng)2個月。飼養(yǎng)期結(jié)束前1 d禁食，飼養(yǎng)試驗結(jié)束時對每箱蝦計數(shù)，對每個個體量體長、稱體重，并觀察和記錄附肢是否完整。計算相對增長率、相對增重率、成活率和附肢完整率等指標。

相對增長率=（終均體長-初均體長）/初均體長×100%

相對增重率=（終均體重-初均體重）/初均體重×100%

成活率=成活尾數(shù)/總尾數(shù)×100%

附肢完整率=附肢完整尾數(shù)/總尾數(shù)×100%

1.2.3 測定方法 飼養(yǎng)試驗結(jié)束后用鑷子小心取出各試驗組蝦的肝胰腺，準確稱取部分組織的質(zhì)量，加9倍生理鹽水制成10%的組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取組織勻漿上清液再用生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿待測。

克氏原鰲蝦肝胰腺中ACP、T-SOD、LZM的檢測均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。ACP活力采用酚氧化分光光度法測定，其活力單位定義為：每克組織中蛋白質(zhì)在37 ℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1 U（U/g prot）；T-SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定，其活力單位定義為：每毫克組織中蛋白質(zhì)在每毫升反應(yīng)液中T-SOD抑制率達50%時對應(yīng)T-SOD的量為一個酶活力單位（U/mg prot）；LZM活力測定采用空白對照比濁法測定，LZM含量單位為U/mL；具體測定步驟按照說明書進行。各項指標的計算公式如下：

ACP活力=（測定管吸光度/標準管吸光度）×標準管含酚的量（0.003 mg）/組織中蛋白質(zhì)含量。

T-SOD活力=（對照管吸光度-測定管吸光度）/對照管吸光度/50%×反應(yīng)液總體積/取樣量/組織中蛋白質(zhì)含量。

LZM活力=（測定管透光度-空白管透光度）/（標準管透光度-空白管透光度）×標準管濃度（2 000 U/mL）×樣本稀釋倍數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計方法 試驗數(shù)據(jù)用ANOVA進行方差分析，Duncan’s進行多重比較。試驗結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦生長和成活率的影響

試驗結(jié)果（表2）表明，飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦生長和成活率有顯著影響。由表2可見，隨著克氏原螯蝦飼養(yǎng)密度的增大，平均每尾蝦的相對增長率、相對增重率和成活率均呈下降趨勢。在飼養(yǎng)密度為12尾/m2和20尾/m2時，相對增長率和相對增重率均較大，2組間沒有顯著差異，成活率均為100%。當飼養(yǎng)密度達到及超過32尾/m2時，其相對增長率和相對增重率均顯著降低，成活率也顯著下降。當飼養(yǎng)密度達到及超過52尾/m2時，附肢完整率也顯著下降。

2.2 飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦肝胰腺三種免疫酶活性的影響

飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦肝胰腺ACP、T-SOD和LZM活性的影響見表3。由表3可見，隨著克氏原螯蝦飼養(yǎng)密度的增大，其肝胰腺ACP、T-SOD、LZM活性均呈下降趨勢。在飼養(yǎng)密度為12尾/m2時，3種免疫酶的活性均為最大。當飼養(yǎng)密度達到20尾/m2時，ACP活性開始顯著下降，T-SOD和LZM活性雖有下降趨勢，但與Ⅰ組（密度12尾/m2組）相比差異不顯著；當飼養(yǎng)密度達到及超過32尾/m2時，3種免疫酶的活性均顯著降低。

3 討論

3.1 飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦生長和死亡率的影響

本試驗結(jié)果表明，隨著克氏原螯蝦飼養(yǎng)密度的增大，其相對生長率（相對增長率、相對增重率）和成活率均顯著下降。這與嚴維輝等[3]對克氏原螯蝦成蝦的研究結(jié)果一致，即隨著飼養(yǎng)密度的增大，克氏原螯蝦的單位產(chǎn)量、回捕率會下降，收獲規(guī)格（尾均重）會減小。劉國興等[4]研究結(jié)果表明，高密度養(yǎng)殖會使克氏原螯蝦飼料系數(shù)、殘肢率升高，生長率降低，水質(zhì)（總氮、總磷、氨氮、亞硝酸鹽氮升高）惡化。隨著個體的生長及種群密度的增大，引起死亡率增高的原因固然有水體環(huán)境質(zhì)量下降、食物得率降低的原因，但在實驗室飼養(yǎng)條件下（如本次試驗中，24 h充氣增氧、每3 d換水一次、每天按體重的5%投喂）這方面應(yīng)該不會是主要因素?？耸显r是一種領(lǐng)地意識極強的蝦類。嚴維輝等[5]對克氏原螯蝦不同放養(yǎng)密度下殘殺情況的試驗結(jié)果表明，隨著飼養(yǎng)密度的升高，克氏原螯蝦種群內(nèi)互相殘殺情況越嚴重，死亡率也就越高，種群增長量則呈下降趨勢。就本試驗過程中所觀察到的實際情況和收獲時對存活蝦所統(tǒng)計的附肢完整率都真實、準確地證實了這一點。由此可見，克氏原螯蝦種群內(nèi)斗爭還表現(xiàn)在對生存空間和領(lǐng)地的爭奪，為此種群內(nèi)不惜互相殘殺，而且隨著飼養(yǎng)密度的增大其爭斗越嚴重。這應(yīng)該是克氏原螯蝦隨著飼養(yǎng)密度的增大其相對生長率和成活率均呈顯著下降趨勢的重要因素。

3.2 飼養(yǎng)密度對克氏原螯蝦肝胰腺三種免疫酶活力的影響

甲殼類動物無特異性免疫系統(tǒng)，以非特異性免疫為主，溶菌酶（LZM）是吞噬細胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有機體防御的功能，在動物免疫研究中，溶菌酶活性是衡量動物體非特異性免疫的一個重要指標[6]。酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、淋巴液中的酚氧化酶原系統(tǒng)（POD）、超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、凝集素等是其機體中重要的免疫因子，以不同的方式抵御病原體的侵襲[7]，SOD是蝦體內(nèi)活性氧防御體系的重要組成部分，LZM、ACP的活性程度可以大體反映機體的免疫機能狀況[8]。周俊芳等[9]對凡納濱對蝦的研究表明，集約化養(yǎng)殖模式下的高密度因素對WSSV感染與疾病暴發(fā)起促進作用。在本試驗中沒有對死亡蝦體進行疾病的診斷和鑒定，但本試驗對各組蝦體內(nèi)的部分免疫酶活力進行了測定。結(jié)果表明，隨著克氏原螯蝦飼養(yǎng)密度的增大，其肝胰腺ACP、T-SOD、LZM活性均呈顯著下降趨勢，說明隨著飼養(yǎng)密度的增大，克氏原螯蝦機體的免疫力也在呈顯著下降趨勢，這可能也是隨著飼養(yǎng)密度的增大，克氏原螯蝦死亡率逐漸升高、成活率逐漸降低的另一個原因。

3.3 克氏原螯蝦適宜的飼養(yǎng)密度

適宜密度應(yīng)該是既能充分利用水體資源又能避免克氏原螯蝦種群內(nèi)互相殘殺現(xiàn)象發(fā)生，從而最大限度地發(fā)揮其生長潛能、提高其成活率的飼養(yǎng)密度。當然，適宜的飼養(yǎng)密度也應(yīng)該充分考慮到投放規(guī)格的大小。從本試驗結(jié)果看，克氏原螯蝦[體重（2.4±0.2） g]的適宜養(yǎng)殖密度應(yīng)該為20尾/m2左右。本試驗結(jié)果表明，飼養(yǎng)密度在這個水平時克氏原螯蝦的相對生長率、成活率和機體的免疫水平均較高，與12尾/m2的飼養(yǎng)密度水平差異不顯著；而當飼養(yǎng)密度達到32尾/m2及以上時，克氏原螯蝦的相對生長率、成活率和機體的免疫水平均顯著下降；所以克氏原螯蝦[體重（2.4±0.2） g]的適宜養(yǎng)殖密度為20尾/m2左右。養(yǎng)殖實踐證明，采用適宜的養(yǎng)殖密度是降低成本、增加效益的有效途徑，也是維持漁業(yè)水域生態(tài)環(huán)境平衡和穩(wěn)定、保持水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展的前提條件[10]。

4 小結(jié)

在本試驗設(shè)置的養(yǎng)殖密度梯度范圍內(nèi)，隨著密度的增加，克氏原螯蝦的相對生長率、成活率、附肢完整率及肝胰腺中的ACP、T-SOD、LZM活性均呈顯著下降趨勢?？紤]到既要能充分利用水體資源又要獲得最大的生長率和成活率，綜合分析后認為，20尾/m2的飼養(yǎng)密度為此規(guī)格克氏原螯蝦適宜的飼養(yǎng)密度。

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