摘要：從中原油田石油污染土壤中分離到一株新的石油降解菌HNAU-1，經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。該菌可以以石油為惟一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，10 d的降解率可達(dá)50.7%。單因素試驗(yàn)表明添加其他碳源（葡萄糖、淀粉和蔗糖）均可抑制該菌對(duì)石油的降解；以尿素為氮源，35 ℃（25～35 ℃范圍內(nèi)），pH 7.5，鹽度為0.5%，十二烷基硫酸鈉為表面活性劑均有利于菌株對(duì)石油的降解。

關(guān)鍵詞：微生物；降解；石油；優(yōu)化；篩選

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）16-4141-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.017

石油是原油和石油制品的總稱，是一種由多種烴類（正烷烴、支鏈烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴、多環(huán)芳烴）及少量非烴化合物和有機(jī)金屬組成的復(fù)雜混合物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年約有60萬(wàn)t的石油及其制品通過(guò)各種途徑進(jìn)入環(huán)境，污染土壤、地下水、河流、海洋[1]。石油烴在環(huán)境中的持久性很強(qiáng)，危害性也較大，不僅具有強(qiáng)烈的致癌、致畸和致突變毒性[2-5]，還能通過(guò)食物鏈在動(dòng)植物體內(nèi)逐級(jí)富集和放大，進(jìn)而對(duì)人體健康造成嚴(yán)重的威脅[6-8]。石油污染也因此引起人們的高度關(guān)注。

對(duì)于環(huán)境中的石油污染，目前有物理、化學(xué)和生物方法將其去除[9]。物理和化學(xué)方法雖然見(jiàn)效快，但是成本較高，而且容易造成二次污染，因此限制了其在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用。生物方法最常見(jiàn)的是采用微生物對(duì)石油進(jìn)行降解，該方法成本較低，而且不會(huì)造成二次污染，有望成為具有廣闊應(yīng)用前景的修復(fù)方法[10]。但是在中國(guó)生物方法并未得到廣泛的應(yīng)用，其原因是降解菌活性不高。本研究從中原油田土壤中篩選得到1株高效石油降解菌，并采用單因素試驗(yàn)對(duì)其降解石油的條件進(jìn)行了優(yōu)化，有望用于未來(lái)石油污染修復(fù)中。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

石油污染土壤采自中原油田，用于分離石油降解菌。

液體培養(yǎng)基成分為：（NH4）2SO4 0.5 g、NaNO3 0.5 g、MgS04·7H2O 0.2 g、KH2PO4 1.0 g、NaH2PO4·H2O 1.0 g、CaCl2 H2O 0.02 g，用去離子水配制成1 L液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加18 g/L瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min即可。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：葡萄糖5 g、NH4NO3 2 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、無(wú)水CaCl2 0.02 g、NaCl 5 g、FeCl3·6H2O 0.02 g，用去離子水配制成l L液體培養(yǎng)基，105 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株篩選

取1 g石油污染土壤分別添加到100 mL液體培養(yǎng)基中，避光培養(yǎng)（28 ℃，180 r/min）7 d后，轉(zhuǎn)接于新的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復(fù)5次。取0.1 mL培養(yǎng)液均勻涂布在含固體培養(yǎng)基的平板上，30 ℃避光培養(yǎng)，每天觀察菌落生長(zhǎng)情況。待菌落長(zhǎng)出，挑選形態(tài)不同的菌落轉(zhuǎn)接到新的含固體培養(yǎng)基的平板上，如此反復(fù)數(shù)次，直到形成形態(tài)單一的菌落，即為純化的菌株，4 ℃保存，備用[11]。

1.3 菌株鑒定

將純化后的菌株接種至無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d（28 ℃），觀察形態(tài)特征，采用DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）提取菌株總DNA；采用引物27F及1492R進(jìn)行石油降解菌的16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物由北京美億美生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入CenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)Blast進(jìn)行同源性比較。

1.4 石油降解率試驗(yàn)

取1 mL菌液（OD600 nm=0.8）接種至100 mL液體培養(yǎng)基中，建立降解體系并進(jìn)行培養(yǎng)（30 ℃、180 r/min），10 d后分析降解體系中石油含量，以不接菌的處理作為對(duì)照。

為研究不同反應(yīng)條件對(duì)菌株降解石油的影響，進(jìn)行以下5組單因素試驗(yàn)：

1）不同石油濃度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%。

2）不同溫度：25、30和35 ℃。

3）不同pH：pH 6.5、7.5和8.5。

4）不同鹽度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%。

5）不同表面活性劑：0.5%曲拉通X-100（TX-100）、0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.5%吐溫-80。

1.5 石油含量分析

采用重量法分析石油含量[12]。具體方法：在石油降解體系中加入20 mL石油醚，萃取培養(yǎng)基中的石油，重復(fù)操作3次；合并上層液，轉(zhuǎn)至分液漏斗，劇烈振蕩5 min，靜置，待分層后進(jìn)行分離。用石油醚洗滌三角瓶2～3次，再合并上層液。將其在58 ℃條件下蒸發(fā)，待石油醚完全蒸發(fā)，殘留石油組分置于干燥器中冷卻至恒重，稱量。計(jì)算石油的降解率公式為：

降解率=（m1-m2）/m×100%

式中，m為培養(yǎng)體系中初始石油質(zhì)量；m1為對(duì)照組的殘油質(zhì)量；m2為樣品的殘油質(zhì)量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

對(duì)分離到的石油降解菌HNAU-1進(jìn)行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)菌株邊緣整齊，表面濕潤(rùn)，紅棕色，半透明，細(xì)胞大小為（0.8～1.0） μm×（1.5～2.5） μm，有鞭毛，呈桿狀。提取該菌DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、16S rDNA測(cè)序，然后通過(guò)Blast檢索并與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌基因序列與Pseudomonas sp.相似度達(dá)97%（圖1），表明該菌屬于假單胞菌屬。

2.2 菌株的生長(zhǎng)及對(duì)石油的降解特性

以石油為惟一碳源研究菌株HNAU-1的生長(zhǎng)曲線和石油降解特性（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)OD600 nm在培養(yǎng)期內(nèi)呈逐步上升趨勢(shì)，在第10天達(dá)到最大值（1.23）。石油的降解率在培養(yǎng)期內(nèi)也呈逐步上升趨勢(shì)，在第10天達(dá)到最大值（50.7%），較芽孢桿菌屬H1對(duì)石油的降解率高（35%）[13]，由此可見(jiàn)，該菌株能以石油為惟一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，并具有較高的石油降解能力。

2.3 不同碳源對(duì)菌株降解石油的影響

通過(guò)比較不同碳源對(duì)菌株降解石油的影響（圖3）發(fā)現(xiàn)，不加外源碳源菌株對(duì)石油的降解率為48.7%，而在培養(yǎng)基中添加葡萄糖、蔗糖和淀粉時(shí)，均不同程度抑制了菌株對(duì)石油的降解。其中，葡萄糖的抑制作用最大，降解率僅為9.7%；其次為蔗糖和淀粉，降解率為24.7%和36.5%，這可能與不同碳源的生物可利用性有關(guān)，石油屬疏水性物質(zhì)，不易被微生物利用，而3種外源碳源均較石油容易被微生物利用，當(dāng)這些碳源耗盡時(shí)，石油才可被進(jìn)一步利用，從而被降解。3種外加碳源之中，葡萄糖最容易被利用，因此對(duì)石油的降解抑制作用最大。目前碳源對(duì)石油降解影響的資料較為少見(jiàn)，該現(xiàn)象提示當(dāng)采用微生物降解石油時(shí)，應(yīng)避免存在其他容易利用的碳源，否則會(huì)降低菌株對(duì)石油的降解率。

2.4 不同氮源對(duì)菌株降解石油的影響

通過(guò)比較不同氮源對(duì)菌株降解石油的影響（圖4），發(fā)現(xiàn)尿素作為氮源時(shí)，菌株對(duì)石油的降解率最高，達(dá)到54.9%，其次為硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨和蛋白胨，降解率分別為31.4%、30.7%、24.7%和18.0%。王鑫等[14]曾研究了不同氮源對(duì)微生物降解石油能力的影響，發(fā)現(xiàn)菌株R4和D3的最優(yōu)氮源為NaNO3，T4的最優(yōu)氮源為NH4NO3，可見(jiàn)對(duì)于不同菌株，最佳的氮源是不同的。陳梅梅等[15]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的最佳氮源為尿素，與本研究結(jié)果相似。

2.5 不同鹽度對(duì)菌株降解石油的影響

通過(guò)比較不同鹽度對(duì)菌株降解石油的影響（圖5），發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)基中鹽度的增加，菌株對(duì)石油的降解率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)基鹽度為0時(shí)，菌株對(duì)石油的降解率最低，僅為35.5%，當(dāng)鹽度增加到0.5%時(shí)，菌株對(duì)石油的降解率達(dá)到最大值（77.4%），其后隨著鹽度的增加，菌株對(duì)石油的降解率稍有降低，維持在62.5%～67.2%之間。表明適當(dāng)?shù)柠}度有利于菌株對(duì)石油的降解，以0.5%為宜。這可能與微生物的長(zhǎng)期生存環(huán)境有關(guān)，該菌株從中原油田附近土壤分離得到，該地區(qū)不僅受到石油污染，同時(shí)土壤中還有較高的鹽分，微生物可能已經(jīng)適應(yīng)了高鹽的生存環(huán)境。多數(shù)石油降解菌都具有耐鹽能力，例如假單胞菌屬DH-5、克雷伯氏菌屬DH-9和芽孢桿菌屬X-1均在2%的鹽度條件下對(duì)石油的降解率最高[16，17]；在石油污染土壤修復(fù)過(guò)程中，含鹽量也極大地影響著微生物修復(fù)效率，土壤中含鹽量為0.01%比含鹽量0.22%的石油的降解率增加了1.22倍[18]。菌株HNAU-1在0.5%～2.0%的含鹽范圍內(nèi)石油降解率均可達(dá)60%以上，因此尤其適合高鹽石油污染土壤的修復(fù)。

2.6 不同溫度對(duì)菌株降解石油的影響

通過(guò)比較不同溫度對(duì)菌株降解石油的影響（圖6），發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高（25～35 ℃），菌株對(duì)石油的降解率呈逐漸增加的趨勢(shì)，其中，以溫度達(dá)到35 ℃時(shí)降解率最高，為55.2%，而溫度為25 ℃時(shí)石油降解率最低，只有17.0%，表明該菌株最適溫度為35 ℃，而當(dāng)溫度過(guò)低，降解率會(huì)急劇降低，因此該菌株不適合低溫環(huán)境下對(duì)石油的修復(fù)。這與辛蘊(yùn)甜等[12]的研究結(jié)果相似。

2.7 不同pH對(duì)菌株降解石油的影響

通過(guò)比較不同pH對(duì)菌株降解石油的影響（圖7），發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)（pH 6.5～8.5，為北方土壤常見(jiàn)的pH），隨著pH的升高，降解率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH 6.5時(shí)，降解率只有10.8%，當(dāng)pH 7.5時(shí)，降解率最大，達(dá)到50.3%，之后當(dāng)pH繼續(xù)升高，降解率開(kāi)始下降，當(dāng)pH 8.5時(shí)，降解率僅為37.6%。表明該菌株對(duì)pH較為敏感，過(guò)高或過(guò)低的pH均會(huì)抑制其對(duì)石油的降解，最適pH為7.5。而辛蘊(yùn)甜等[12]分離到的芽孢桿菌降解石油最適pH為7.0，表明不同菌株最適的pH不同，應(yīng)與菌株所處的環(huán)境有關(guān)。

2.8 不同表面活性劑對(duì)菌株降解石油的影響

通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)不同表面活性劑對(duì)菌株降解石油的影響不同（圖8）。不添加表面活性劑菌株對(duì)石油的降解率為34.6%，添加TX-100（曲拉通X-100）和SDS（十二烷基硫酸鈉）均顯著提高了菌株對(duì)石油的降解率，分別達(dá)到63.6%和67.3%，而添加Tween-80顯著抑制了菌株對(duì)石油的降解，降解率僅為16.8%。添加表面活性劑是改進(jìn)菌株對(duì)疏水性底物利用的重要措施，張麗芳等[19]研究了4種表面活性劑對(duì)微生物降解石油的影響，發(fā)現(xiàn)較低濃度的表面活性劑促進(jìn)石油降解，而當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)抑制石油降解，可能與表面活性劑本身的毒性有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)的Tween-80抑制了石油的降解，可能是由于菌株對(duì)Tween-80的耐受性低造成的。

3 小結(jié)

從中原油田石油污染土壤中分離到一株石油降解菌HNAU-1，經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定為假單胞菌屬，該菌可以以惟一碳源代謝石油，外加葡萄糖、淀粉和蔗糖均能抑制該菌對(duì)石油的降解，采用該菌降解石油，其最佳降解條件為：以尿素為氮源，35 ℃（25～35 ℃范圍內(nèi)），pH 7.5，鹽度為0.5%，SDS為表面活性劑，這些結(jié)果為進(jìn)一步采用該菌用于石油土壤修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 袁紅莉，楊金水，王占生.降解石油微生物菌種的篩選及降解特性[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2003，23（2）：157-161.

[2] 岳戰(zhàn)林，蔣平安.石油類污染物的特性及環(huán)境行為[J].石化技術(shù)與應(yīng)用，2006，24（4）：307-308.

[3] 張 巍，竇 森.石油污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)[J].北方環(huán)境， 2010，22（2）：28-30.

[4] 張士萍，鄭廣宏，王 磊.石油污染的修復(fù)與處理技術(shù)[J].四川環(huán)境，2007，26（4）：76-82.

[5] 常慧萍.石油烴污染土壤的生物修復(fù)[J].生物學(xué)雜志，2008， 25（1）：55-56.

[6] 趙玉霞，楊 珂.石油污染土壤修復(fù)技術(shù)研究綜述[J].環(huán)境科技， 2009，22（Z1）：60-63.

[7] 張學(xué)佳，紀(jì) 巍，康志軍.石油類污染物對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境的危害[J].化工科技，2008，16（6）：60-65.

[8] 馬 強(qiáng)，張旭紅，林愛(ài)軍.土壤石油烴污染的植物毒性及植物-微生物聯(lián)合降解[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2009，3（3）：544-548.

[9] 劉五星，駱永明，王殿璽.石油污染場(chǎng)地土壤修復(fù)技術(shù)及工程化應(yīng)用[J].環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù)，2011，23（3）：47-51.

[10] 劉五星，駱永明，滕 應(yīng)，等.石油污染土壤的生物修復(fù)研究進(jìn)展[J].土壤，2006，38（5）：634-639.

[11] 崔麗虹，郭 萍，李寶明，等.石油烴降解菌的篩選與鑒定[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2009（9）：143-147.

[12] 辛蘊(yùn)甜，趙曉祥.石油降解菌的降解性能及降解動(dòng)力學(xué)研究[J].安全與環(huán)境學(xué)報(bào)，2013，13（5）：21-25.

[13] 辛蘊(yùn)甜.石油降解菌的降解性能、固定化及降解動(dòng)力學(xué)研究[D].上海：東華大學(xué)，2013.

[14] 王 鑫，王學(xué)江，卜云潔，等.外加氮源強(qiáng)化石油降解菌降解性能[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，42（6）：924-929.

[15] 陳梅梅，鄧 皓，宋佳宇，等.嗜鹽菌的篩選及原油降解性能[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2014，8（1）：372-377.

[16] 姚 瑤，鄭青松，劉兆普，等.2株石油降解菌生長(zhǎng)和降解石油條件的優(yōu)化[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2001，27（5）：48-53.

[17] 張 娜，鄭青松，劉 玲，等.產(chǎn)表面活性劑石油降解菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34（4）：133-137.

[18] 秦 曉，李德生，唐景春，等.含鹽量對(duì)石油污染土壤生物修復(fù)的影響[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，37（2）：108-112.

[19] 張麗芳，肖 紅，魏德洲.表面活性劑對(duì)土壤石油污染物微生物降解的影響[J].遼寧化工，2002，31（12）：509-513.