摘要：從自然界土壤中采集到一株可降解芝麻餅殘油的菌種，經(jīng)16S rDNA測(cè)定其序列后通過(guò)GenBank進(jìn)行比對(duì)及聚類分析。結(jié)果表明，菌株16S rDNA長(zhǎng)度為1 496 bp，聚類分析顯示與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性達(dá)99%以上，該原始菌株經(jīng)過(guò)以Co60為惟一放射源的輻射誘變，獲得突變菌，編號(hào)為MT-26。經(jīng)測(cè)定，MT-26的酶活力可達(dá)725 U/mL，并對(duì)其進(jìn)行傳代試驗(yàn)，證明其具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：殘油降解；放射誘變；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）

中圖分類號(hào)：Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）16-4138-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.016

芝麻屬脂麻科，在中國(guó)是一種常見的經(jīng)濟(jì)作物，是香油類生產(chǎn)的原料。由于香油的品相要求，芝麻在取油工藝上通常使用傳統(tǒng)的壓榨法取油，以保留香油最純正的味道[1]，然而通過(guò)傳統(tǒng)壓榨法取油后的芝麻餅中往往含有相當(dāng)可觀的殘油量[2]。研究表明，芝麻油中的芝麻素是含量最高的木脂素[3]，由降解芝麻油而獲得的小分子脂類物質(zhì)對(duì)調(diào)節(jié)動(dòng)植物的生理代謝有比較顯著的作用[4，5]。本研究試圖對(duì)芝麻壓榨提油后剩余的餅粕中殘油加以利用，對(duì)其進(jìn)行降解獲得有應(yīng)用前景的小分子脂類，提高芝麻餅粕的附加值。筆者在自然界中廣泛篩選可有效降解芝麻餅殘油的菌株，并對(duì)其進(jìn)行誘變和條件優(yōu)化，為芝麻餅殘油降解菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品于2013年2月20日采集于湖南長(zhǎng)沙市芙蓉區(qū)東風(fēng)屠宰廠，將采集土壤壓碎，去除石塊、植物根莖，混合均勻，裝入聚乙烯自封袋中，于泡沫冰盒中運(yùn)輸及保存[5]。

初篩培養(yǎng)基：芝麻餅50 g/L，121 ℃滅菌25 min。顯色培養(yǎng)基：芝麻油20 g/L，F(xiàn)eSO4 0.1 g/L，葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO4 0.1 g/L，MgSO4 0.1 g/L，NaCl 1 g/L，溴甲酚紫0.02 g/L（1.6%溶液），pH自然。LB培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 1）菌株的初篩及分離純化：稱取適量處理后的土壤，加入90 mL培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶處理，置于37 ℃恒溫?fù)u床中24 h[6]。發(fā)酵液搖勻后取1 mL，加9 mL滅菌水稀釋至10-2，后依次稀釋至10-6作不同的濃度梯度，并取200 μL加入制備好的LB培養(yǎng)基中涂布均勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，將培養(yǎng)出的細(xì)菌用畫線法挑選形態(tài)不同的菌斑且較大的菌株進(jìn)行純化[7]。

2）產(chǎn)脂肪酶菌株的確認(rèn)：由于脂肪酶降解脂肪后的主要產(chǎn)物為小分子脂肪酸（普通小分子脂肪酸pH為4.8～5.3），本試驗(yàn)使用溴甲基紫作為培養(yǎng)基顯色劑，判斷菌株是否產(chǎn)生脂肪酶。將純化好的不同形態(tài)菌落接入篩選培養(yǎng)基，如在含溴甲酚紫的培養(yǎng)基中出現(xiàn)淡黃色顯色圈，而未接種的培養(yǎng)基內(nèi)溴甲酚紫不變色，即可初步判定該菌株具有產(chǎn)脂肪酶能力[8]。

1.2.2 酶活力及生物量的測(cè)定 脂肪酶活力測(cè)定采用對(duì)硝基苯法[9]，酶活為40 ℃下每分鐘分解釋放出1 μmol對(duì)硝基苯酚的酶量，定義為一個(gè)活力單位（U）。生物量測(cè)定使用平板計(jì)數(shù)法。

1.2.3 菌株的鑒定 挑取單菌落接于1 mL無(wú)菌水中，置于100 ℃沸水浴10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液2 μL作為PCR模板，16S rDNA引物5′-AGGCAGCAGTAGG GAATCTT-3′，5′-CGTGGCTTTC

TGGTTAGGT-3′擴(kuò)增產(chǎn)物交由華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的序列提交GenBank進(jìn)行比對(duì)，提取相似度最高的前5條序列使用MEGA5.05進(jìn)行分析。

1.2.4 菌株的誘變 將初篩具有較高酶活的菌株置于含溴甲酚紫的顯色LB培養(yǎng)基中，送湖南省輻射中心進(jìn)行放射量為60Gy的Co60放射誘變，將相同接種量的培養(yǎng)基用1 cm厚的均質(zhì)鉛板隔絕直接放射后進(jìn)行不同時(shí)間梯度的誘變。

1.2.5 發(fā)酵效果的測(cè)定 使用索式抽提法測(cè)定芝麻餅發(fā)酵前后的粗脂肪含量以測(cè)定發(fā)酵效果[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)初篩獲得的128株有顯色圈的菌株（圖1），經(jīng)精確測(cè)定菌落半徑與顯色圈半徑的比值后，挑選出30株菌株進(jìn)行酶活力與生物量的測(cè)定，結(jié)果見表1。由表1可以看出，菌株酶活為68.203～264.321 U/mL，生物量為12×107～98×107 個(gè)/mL，進(jìn)行測(cè)定后選擇8號(hào)菌株，并命名為MT菌進(jìn)行下一階段試驗(yàn)。

2.2 菌株的誘變

運(yùn)用Co60對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行放射誘變處理，由圖2可知，誘變4 h的菌株致死率達(dá)到80%，處理5 h致死率達(dá)到96%，為提高處理量和誘變效率，試驗(yàn)選擇5 h作為誘變計(jì)量進(jìn)行反復(fù)誘變。誘變篩選30株顯色圈較大的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

挑選顯色圈較大的30株菌株，在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，反應(yīng)條件為溫度37 ℃，振蕩速度120 r/min，采用對(duì)硝基苯酚法對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行測(cè)定，獲得OD405 nm并計(jì)算酶活和生物量，結(jié)果見表2。

由表2可知，30株菌株的生物量維持為 28.97×107～208.61×107個(gè)/mL，酶活力為121.89～725.23 U/mL，其中26號(hào)菌株酶活力最高可達(dá)到725.23 U/mL，較原始菌株酶活上升263.67%。因此在進(jìn)一步研究中選用菌株26，并命名為MT-26。

將MT-26菌株接種至試管斜面培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）傳代10次，并測(cè)定每次傳代酶活力（表3），1～10代的脂肪酶活力為718～736 U/mL，酶活力變化為3.84%，小于5%，說(shuō)明該菌株具有相對(duì)穩(wěn)定的遺傳性。

2.3 測(cè)序鑒定

將菌株MT-26的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后送至華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得MT-26菌株的16S rDNA的序列長(zhǎng)度為1 496 bp，其MEGA5.05聚類分析結(jié)果見圖4。

3 小結(jié)與討論

近年來(lái)隨著芝麻油的暢銷及芝麻產(chǎn)量的上升，其榨油副產(chǎn)物芝麻餅粕的產(chǎn)量也不斷增加，而傳統(tǒng)的處理芝麻餅粕的方法普遍用作動(dòng)物飼料或者植物基肥[11，12]。芝麻餅中富含豐富粗脂肪、粗蛋白等，直接使用效果較差，造成一定的資源浪費(fèi)[13]。本試驗(yàn)通過(guò)篩選獲得能夠降解芝麻餅粕中殘油的菌株，并對(duì)其誘變和培養(yǎng)條件進(jìn)行初步探索，以期提高芝麻油產(chǎn)品的附加值；通過(guò)對(duì)大量的菌種篩選，從富含油脂的土壤中分離篩選出一株可以降解芝麻餅中粗脂肪的菌株，對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行Co60放射誘變，獲取了一株可以穩(wěn)定遺傳的產(chǎn)脂肪酶菌株，命名為MT-26，基因比對(duì)結(jié)果顯示該菌株是一種枯草芽孢桿菌。由于芝麻餅既富含碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又含有多種無(wú)機(jī)鹽類物質(zhì)，試驗(yàn)中在進(jìn)行菌種篩選時(shí)僅使用芝麻餅與水作為搖瓶培養(yǎng)基，為特異性改造可降解芝麻餅粕的菌株作準(zhǔn)備。本研究獲得的誘變菌株MT-26酶活達(dá)到725.23 U/mL，較誘變前有明顯的提高，對(duì)誘變后的菌株進(jìn)行傳代測(cè)定，證明其有良好的遺傳穩(wěn)定性。下一步試驗(yàn)將對(duì)菌株MT-26進(jìn)行培養(yǎng)基條件優(yōu)化及小規(guī)模發(fā)酵條件的摸索和優(yōu)化。

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