摘要：從自然環(huán)境中篩選出1株可同時分泌纖維素酶和木聚糖酶的菌株，并對其降解小麥（Triticum aestivum L.）秸稈的特性進行分析。結(jié)果表明，ZH-19菌株可同時高產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶。經(jīng)形態(tài)特征和ITS保守區(qū)測序分析確定該菌株為Penicillium thiersii。菌株降解小麥秸稈的過程中，纖維素酶活和木聚糖酶酶活分別在第6天和第7.5天達到其最大值，分別為145.54、93.20 U/mL；纖維素比半纖維素降解的速率要快，表明在小麥秸桿降解過程中，可能需要纖維素酶、半纖維素酶的協(xié)同作用，才能實現(xiàn)對木質(zhì)纖維素的最大降解。

關(guān)鍵詞：小麥（Triticum aestivum L.）秸稈；發(fā)酵；木質(zhì)纖維素；降解；機理

中圖分類號：Q813 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）17-4584-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.17.056

Abstract： A novel strain of Penicillium thiersii ZH-19 producing cellulase and xylanase was isolated from natural environment and its characterization of degrading wheat（Triticum aestivum L.） straw were studied. The results showed that ZH-19 could produce cellulase and xylanase. This strain was Penicillium thiersii which identified by morphology and ITS sequence. The cellulase activity reached the maximum of 145.54 U/mL at the 6th day， while xylanase activity reached the maximum level of 93.20 U/mL at the 7.5th day during the degradation process of wheat straw by P. thiersii ZH-19. Further investigation revealed that hemi-cellulose in the wheat straw was preferably degraded，and followed by cellulose，however，cellulose was degraded rapidly than that of hemi-cellulose. It indicated that the degradation process of wheat straw by P. thiersii ZH-19 possibly needed the cooperation of cellulase and xylanase.

Key words： wheat（Triticum aestivum L.） straw；Penicillium thiersii；cellulase；xylanase；degradation

木質(zhì)纖維素是自然界中最豐富的可再生資源，全球年產(chǎn)量約為1 000億t[1]，其中11%（約110億t）由農(nóng)業(yè)產(chǎn)生。中國是世界上的農(nóng)業(yè)大國，據(jù)估計，每年中國農(nóng)作物秸稈總產(chǎn)量大于7.8億t，其中玉米秸稈2.4億t，稻谷秸稈1.8億t，小麥秸稈1.1億t，花生和薯類和其他廢棄物等2億t[2]。中國作物秸稈資源豐富，品種多、數(shù)量大、分布廣但不均勻，這為研究和充分利用木質(zhì)纖維素提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，秸稈產(chǎn)量隨季節(jié)變化較大，且價值低、體積大、不便運輸。秸稈的自然降解過程又極其緩慢，充分、有效地利用這類資源相當(dāng)困難，導(dǎo)致60%以上的秸稈未被有效利用，隨處堆放或就地焚燒，造成了極大的環(huán)境污染和嚴(yán)重的資源浪費[3]。秸稈主要含有半纖維素、纖維素、木質(zhì)素和可溶性固形物。其中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分別約為40%～50%、25%～25%和10%～20%，當(dāng)前，如何將纖維素轉(zhuǎn)化為可利用的能源產(chǎn)品一直是研究者重點關(guān)注的領(lǐng)域。

纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協(xié)同作用，分解纖維素產(chǎn)生寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖[4]。木聚糖是植物半纖維素的主要成分，是一種多聚五碳糖，且多以異質(zhì)多糖形式存在，與纖維素分子之間存在氫鍵連接和物理混合。木聚糖酶是一類降解木聚糖分子的復(fù)雜酶系，包括內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、酚酸酯酶等[5]。

產(chǎn)纖維素酶和半纖維酶的菌很多，近年來報道的有曲霉、木霉、青霉、裂褶菌、芽孢桿菌等。陳和秀等[6]以甘蔗渣和麩皮為固體發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化得到一株曲霉的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件。Senthilkumar等[7]、Gutierrez-Correa等[8]通過研究分別得到費舍爾曲霉（Aspergillus fischeri）、里氏木霉（Trichoderma reesei）和黑曲霉（Aspergillus niger）混合菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的最適條件。綜合以上研究發(fā)現(xiàn)，固態(tài)發(fā)酵得到的纖維素酶和半纖維酶的酶活均較低[9]。本研究從多年存放的小麥（Triticum aestivum L.）秸稈和枯爛樹葉中篩選獲得了一株具有良好降解小麥秸稈的菌株P(guān)enicillium thiersii，并對其降解小麥秸稈的特性進行了研究，以期為纖維素轉(zhuǎn)化為可利用的能源產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥秸稈和枯爛樹葉分別取自河南孟州和江蘇連云港的農(nóng)家或農(nóng)田，均為露天自然堆放1年以上。木聚糖、木糖、葡萄糖、結(jié)晶纖維素和其他主要化學(xué)試劑等購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；麩皮在當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I。

1.2 培養(yǎng)基

用于篩選細菌的培養(yǎng)基為肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏 10 g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 5 g/L， pH 7.0～7.2。

用于篩選真菌的培養(yǎng)基為查氏培養(yǎng)基：KNO3 3 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L，自然pH。

用于篩選酵母的培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，自然pH。

分離篩選培養(yǎng)基：1 mol/L NaOH預(yù)處理的小麥秸稈10 g/L，瓊脂15 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：1 mol/L NaOH預(yù)處理的小麥秸稈20 g/L、蛋白胨5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L，自然pH。

1.3 秸稈降解菌的分離

在采集的小麥秸稈和樹葉等樣品中加入無菌水振蕩，取適量涂布于秸稈分離篩選瓊脂平板。挑取單菌落至培養(yǎng)基平板上劃線純化分離3次，得到純菌種。將菌種轉(zhuǎn)至相應(yīng)液體搖瓶培養(yǎng)基，于第0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5天分別測定小麥秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率以及木聚糖酶、纖維素酶的酶活。

1.4 菌種鑒定

直接觀察菌株在PDA平板上的生長變化；從平板上挑菌體少許，涂于載玻片上，置于顯微鏡下觀察。

分子鑒定：提取真菌的基因組DNA，采用真菌5.8S rDNA通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCT GCCG-3′）及ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[10]擴增菌株整個ITS序列（內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化、過PCR柱純化，與pGEM-T連接后，轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，提取質(zhì)粒并純化后提交生工生物工程（上海）股份有限公司。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件去載體后，將所得的ITS rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，利用Blastn工具進行序列比對，對菌株進行鑒定。應(yīng)用Clustal X（Version 1.83）軟件進行同源性分析，用Treeview（Version 3.2）軟件構(gòu)建進化樹。

1.5 酶活測定

小麥秸稈發(fā)酵液經(jīng)5 400 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。CMC酶活力的測定參考文獻[11]。

纖維素酶活公式：

X為纖維素酶活（U/mL）；W為葡萄糖生成量（mg）；V為反應(yīng)液中酶液加入量；5.56為1 mg的葡萄糖的微摩爾數(shù)（1 000/180=5.56）；N為樣品稀釋倍數(shù)；T為反應(yīng)時間。

木聚糖酶活力測定參考文獻[11]。木聚糖酶活公式：

X為木聚糖酶（U/mL）；W為木糖生成量（mg）；V為反應(yīng)液中酶液加入量；5.56為1 mg的木聚糖的微摩爾數(shù)（1 000/150=6.67）；N為樣品稀釋倍數(shù)；T為反應(yīng)時間。

采用Van Soest法測定纖維素、半纖維素與木質(zhì)素含量，按照文獻[12]方法，并略加改動：即①用18%H2SO4代替37%濃鹽酸配制地衣酚試劑；②用3%SDS代替Van Soest方法配制的中性洗滌劑。

1.6 還原糖含量的測定

在試管中加入1 mL上清液（可適當(dāng)稀釋），3.0 mL DNS試劑，將待測樣品放入沸水浴中反應(yīng)5 min，用水定容至25 mL，空白管以1 mL水代替1 mL酶液，然后以空白管較零，在540 nm下測定吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出還原糖的含量[13]。

1.7 紅外掃描樣品

定時取出發(fā)酵液5 400 r/min離心10 min，所獲得的殘渣在50 ℃下烘干至恒重，然后取約4 mg殘渣于研缽中，并加少量的KBr，研磨充分，進行壓片[14]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS10.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，每處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解小麥秸稈菌株的篩選

從采集的小麥秸稈樣本中篩選出具有一定秸稈降解能力的菌株29株，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)測定對比各菌株降解纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的能力，最終確定菌株ZH-19降解秸稈能力最高，對小麥秸稈中的纖維素和半纖維素降解率分別達到87.91%±5.24%和66.54%±7.56%。

2.2 菌株ZH-19的鑒定

如圖1所示，菌株ZH-19的菌落在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，直徑約50 mm，中間有臍狀突起而其他部分平坦；質(zhì)地絨狀；分生孢子大量產(chǎn)生；菌落中心呈灰綠色，菌落反面為黃褐色。

以菌株ZH-19基因組DNA為模板，采用通用引物ITS1和ITS4擴增整個ITS序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后插入pGEM-T載體中，對擴增產(chǎn)物進行測序。將序列提交到Genebank數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫登記號為DQ532125。將其ITS基因序列在Genebank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，與其相似性較高序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，從相似性分析和系統(tǒng)進化樹可以看出，Penicillium thiersii NRRL 28147與菌株ZH-19的ITS序列的相似性達100%，表明二者親緣性最近。因此，綜合形態(tài)鑒定和分子鑒定，將菌株ZH-19命名為Penicillium thiersii ZH-19。

2.3 P. thiersii ZH-19降解小麥秸稈

2.3.1 纖維素酶、半纖維素酶和還原糖的變化 從圖3可知，從發(fā)酵開始到第4.5天，小麥秸稈還原糖濃度逐漸下降，到第4.5天降到最小值，為165.33 μg/mL，之后還原糖濃度先上升后下降，直到第9天后趨于平穩(wěn)，還原糖濃度不再變化。1.5 d之前菌體密度較低，對培養(yǎng)基原有還原糖消耗較低，且種子培養(yǎng)基內(nèi)帶有部分纖維素酶和木聚糖酶，將秸桿分解為還原糖。隨著培養(yǎng)過程的發(fā)展，菌體生長加快，消耗糖較大，因此還原糖濃度逐漸下降至最低；從第4.5天開始，由于菌體消耗的糖和產(chǎn)生的還原糖維持平衡，還原糖的濃度保持不變。

0～7.5 d培養(yǎng)期間，P. thiersii ZH-19菌株所產(chǎn)生的纖維素酶和木聚糖酶活性總體上均處于上升階段。其中，纖維素酶活性在培養(yǎng)第6天時達到最大，為145.54 U/mL；而木聚糖酶在第7.5天時達到最大，為93.54 U/mL，之后二者活性均呈逐漸降低的趨勢。結(jié)果表明，在前6 d培養(yǎng)過程中，P. thiersii ZH-19菌株處于有利于菌體生長、酶表達和分泌的有利條件，第7.5天后，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、pH變化等因素影響，導(dǎo)致菌體生長以及酶活保持能力均有一定程度的下降。

2.3.2 纖維素和半纖維素含量的變化 由圖4可知，小麥秸桿中纖維素含量明顯高于半纖維素含量。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，纖維素和半纖維素含量呈降低的趨勢；第7.5天，二者含量下降至6.57%±0.53%、1.72%±0.72%。之后，纖維素和半纖維素的含量變化不明顯。從圖4中也可看出，纖維素含量下降的速率要明顯快于半纖維素，由此可推測P. thiersii ZH-19菌株優(yōu)先降解纖維素。這也與其產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶活變化情況一致。

2.3.3 P. thiersii ZH-19降解小麥秸稈后樣品的FT-IR分析 圖5為第0、6、10.5天P. thiersii ZH-19菌株降解小麥秸稈的FT-IR圖譜。由圖5可知，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，3 328 cm-1左右，2 358 cm-1左右、1 432～1 593 cm-1、1 318 cm-1和989～1 112 cm-1的相對峰值增強以及譜峰向低波數(shù)方向移動，表明小麥秸桿中碳水化合物（纖維素和半纖維素）在逐步分解，大分子的長鏈烴切斷成小分子的短鏈烴，木質(zhì)纖維素中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)逐漸被裂解成為鏈狀化合物，從而使羥基、亞甲基基團及羧基數(shù)量不斷增加，再次證實了P. thiersii可降解秸桿中纖維素和半纖維素。

3 小結(jié)

從自然環(huán)境中篩選出1株可同時分泌纖維素酶和木聚糖酶的菌株，通過形態(tài)學(xué)分析和ITS保守區(qū)進行測序，該菌株被鑒定為Penicillium thiersii ZH-19，其序列在GenBank上登記號為DQ235784。通過酶活測定、秸稈中纖維素和半纖維素含量測定以及FT-IR分析發(fā)現(xiàn)，篩選的P. thiersii ZH-19在降解小麥秸稈過程中，纖維素優(yōu)先被降解，同時，該降解過程可能由纖維素酶、半纖維素酶協(xié)同作用下實現(xiàn)對木質(zhì)纖維素的最大降解。今后將進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分，提高酶活性，克隆相關(guān)的功能基因，深入研究其酶學(xué)性質(zhì)，為開發(fā)新型纖維素酶和木聚糖酶制劑奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] DEUTSCHMANN R， DEKKER R F H. From plant biomass to bio-based chemicals： Latest developments in xylan research[J]. Biotechnology Advances，2012，30：1627-1640.

[2] 中華人民共和國國家統(tǒng)計局.中國統(tǒng)計年鑒2011[M].北京：中國統(tǒng)計出版社，2011.

[3] MENON V，RAO M. Trends in bioconversion of lignocellulose：Biofuels，platform chemicals biorefinery concept[J].Progress in Energy and Combustion Science，2012，38（4）：522-550.

[4] KASANA R C，GULATI A.Cellulases from psychrophilic microorganisms：A review[J].J Basic Microbiol，2011，51（6）：572-579.

[5] JUTURU V，WU J C.Microbial Exo-xylanases：A Mini Review[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2014，174（1）：81-92.

[6] 陳和秀，龍敏南，徐方成，等.木聚糖酶生產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].中國生物工程雜志，2007，27（11）：41-44.

[7] SENTHILKUMAR S R，ASHOKKUMAR B， CHANDRA R K， et al. Optimization of medium composition for alkali-stable xylanase production by Aspergillus fischeri Fxn 1 in solid-state fermentation using central composite rotary design[J].Bioresou Technol，2005，96：1380-1386.

[8] GUTIERREZ-CORREA M，TENGERDY R P. Xylanase production by fungal mixed culture solid substrate fermentation on sugar cane bagasse[J].Biotechnol Letters，1998，20（1）：45-47.

[9] HECK J X，SOARES L H，AYUB M A Z.Optimization of xylanase and mannanase production by Bacilluscirculans strain BL53 on solid-state cultivation[J].Enzyme Microb Technol，2005，37： 417-423.

[10] 中國科學(xué)院上海植物生理研究所.二株高活力纖維素分解菌N2-78和EA3-867的獲得及其特性的比較[J].微生物學(xué)學(xué)報，1978，18（1）：27-28.

[11] 費迪波，馮觀泉，袁 超.飼用木聚糖酶活測定方法的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2004，16（2）：53-58.

[12] 王玉萬，徐文玉.木質(zhì)纖維素固體基質(zhì)發(fā)酵物中半纖維素，纖維素和木質(zhì)素的定量分析程序[J].微生物學(xué)通報，1987（14）：81-86.

[13] 齊香君，茍金霞，韓戌珺.3，5-二硝基水楊酸比色法測定溶液中還原糖的研究[J].纖維素科學(xué)與技術(shù)，2004，12（3）：17-20.

[14] 吳景貴，曾廣賦，汪冬梅，等.示差光譜分析在作物殘體腐解研究中的應(yīng)用[J].光譜學(xué)與光譜分析，1999，19（1）：47-49.