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        纖維素酶/木聚糖酶產(chǎn)生菌株的篩選及其降解小麥秸稈的研究

        2016-12-31 00:00:00趙鵬翔崔鳳杰卜令習(xí)蔣建新
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年17期

        摘要:從自然環(huán)境中篩選出1株可同時(shí)分泌纖維素酶和木聚糖酶的菌株,并對(duì)其降解小麥(Triticum aestivum L.)秸稈的特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明,ZH-19菌株可同時(shí)高產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶。經(jīng)形態(tài)特征和ITS保守區(qū)測(cè)序分析確定該菌株為Penicillium thiersii。菌株降解小麥秸稈的過程中,纖維素酶活和木聚糖酶酶活分別在第6天和第7.5天達(dá)到其最大值,分別為145.54、93.20 U/mL;纖維素比半纖維素降解的速率要快,表明在小麥秸桿降解過程中,可能需要纖維素酶、半纖維素酶的協(xié)同作用,才能實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)纖維素的最大降解。

        關(guān)鍵詞:小麥(Triticum aestivum L.)秸稈;發(fā)酵;木質(zhì)纖維素;降解;機(jī)理

        中圖分類號(hào):Q813 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2016)17-4584-04

        DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.17.056

        Abstract: A novel strain of Penicillium thiersii ZH-19 producing cellulase and xylanase was isolated from natural environment and its characterization of degrading wheat(Triticum aestivum L.) straw were studied. The results showed that ZH-19 could produce cellulase and xylanase. This strain was Penicillium thiersii which identified by morphology and ITS sequence. The cellulase activity reached the maximum of 145.54 U/mL at the 6th day, while xylanase activity reached the maximum level of 93.20 U/mL at the 7.5th day during the degradation process of wheat straw by P. thiersii ZH-19. Further investigation revealed that hemi-cellulose in the wheat straw was preferably degraded,and followed by cellulose,however,cellulose was degraded rapidly than that of hemi-cellulose. It indicated that the degradation process of wheat straw by P. thiersii ZH-19 possibly needed the cooperation of cellulase and xylanase.

        Key words: wheat(Triticum aestivum L.) straw;Penicillium thiersii;cellulase;xylanase;degradation

        木質(zhì)纖維素是自然界中最豐富的可再生資源,全球年產(chǎn)量約為1 000億t[1],其中11%(約110億t)由農(nóng)業(yè)產(chǎn)生。中國(guó)是世界上的農(nóng)業(yè)大國(guó),據(jù)估計(jì),每年中國(guó)農(nóng)作物秸稈總產(chǎn)量大于7.8億t,其中玉米秸稈2.4億t,稻谷秸稈1.8億t,小麥秸稈1.1億t,花生和薯類和其他廢棄物等2億t[2]。中國(guó)作物秸稈資源豐富,品種多、數(shù)量大、分布廣但不均勻,這為研究和充分利用木質(zhì)纖維素提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。然而,秸稈產(chǎn)量隨季節(jié)變化較大,且價(jià)值低、體積大、不便運(yùn)輸。秸稈的自然降解過程又極其緩慢,充分、有效地利用這類資源相當(dāng)困難,導(dǎo)致60%以上的秸稈未被有效利用,隨處堆放或就地焚燒,造成了極大的環(huán)境污染和嚴(yán)重的資源浪費(fèi)[3]。秸稈主要含有半纖維素、纖維素、木質(zhì)素和可溶性固形物。其中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分別約為40%~50%、25%~25%和10%~20%,當(dāng)前,如何將纖維素轉(zhuǎn)化為可利用的能源產(chǎn)品一直是研究者重點(diǎn)關(guān)注的領(lǐng)域。

        纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱,它們協(xié)同作用,分解纖維素產(chǎn)生寡糖和纖維二糖,最終水解為葡萄糖[4]。木聚糖是植物半纖維素的主要成分,是一種多聚五碳糖,且多以異質(zhì)多糖形式存在,與纖維素分子之間存在氫鍵連接和物理混合。木聚糖酶是一類降解木聚糖分子的復(fù)雜酶系,包括內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、酚酸酯酶等[5]。

        產(chǎn)纖維素酶和半纖維酶的菌很多,近年來報(bào)道的有曲霉、木霉、青霉、裂褶菌、芽孢桿菌等。陳和秀等[6]以甘蔗渣和麩皮為固體發(fā)酵培養(yǎng)基,優(yōu)化得到一株曲霉的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件。Senthilkumar等[7]、Gutierrez-Correa等[8]通過研究分別得到費(fèi)舍爾曲霉(Aspergillus fischeri)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和黑曲霉(Aspergillus niger)混合菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的最適條件。綜合以上研究發(fā)現(xiàn),固態(tài)發(fā)酵得到的纖維素酶和半纖維酶的酶活均較低[9]。本研究從多年存放的小麥(Triticum aestivum L.)秸稈和枯爛樹葉中篩選獲得了一株具有良好降解小麥秸稈的菌株P(guān)enicillium thiersii,并對(duì)其降解小麥秸稈的特性進(jìn)行了研究,以期為纖維素轉(zhuǎn)化為可利用的能源產(chǎn)品提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        小麥秸稈和枯爛樹葉分別取自河南孟州和江蘇連云港的農(nóng)家或農(nóng)田,均為露天自然堆放1年以上。木聚糖、木糖、葡萄糖、結(jié)晶纖維素和其他主要化學(xué)試劑等購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;麩皮在當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購買。

        1.2 培養(yǎng)基

        用于篩選細(xì)菌的培養(yǎng)基為肉湯培養(yǎng)基:牛肉膏 10 g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 5 g/L, pH 7.0~7.2。

        用于篩選真菌的培養(yǎng)基為查氏培養(yǎng)基:KNO3 3 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L,自然pH。

        用于篩選酵母的培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L,自然pH。

        分離篩選培養(yǎng)基:1 mol/L NaOH預(yù)處理的小麥秸稈10 g/L,瓊脂15 g/L。

        發(fā)酵培養(yǎng)基:1 mol/L NaOH預(yù)處理的小麥秸稈20 g/L、蛋白胨5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L,自然pH。

        1.3 秸稈降解菌的分離

        在采集的小麥秸稈和樹葉等樣品中加入無菌水振蕩,取適量涂布于秸稈分離篩選瓊脂平板。挑取單菌落至培養(yǎng)基平板上劃線純化分離3次,得到純菌種。將菌種轉(zhuǎn)至相應(yīng)液體搖瓶培養(yǎng)基,于第0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5天分別測(cè)定小麥秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率以及木聚糖酶、纖維素酶的酶活。

        1.4 菌種鑒定

        直接觀察菌株在PDA平板上的生長(zhǎng)變化;從平板上挑菌體少許,涂于載玻片上,置于顯微鏡下觀察。

        分子鑒定:提取真菌的基因組DNA,采用真菌5.8S rDNA通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCT GCCG-3′)及ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[10]擴(kuò)增菌株整個(gè)ITS序列(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列,PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化、過PCR柱純化,與pGEM-T連接后,轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,提取質(zhì)粒并純化后提交生工生物工程(上海)股份有限公司。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件去載體后,將所得的ITS rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫,利用Blastn工具進(jìn)行序列比對(duì),對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。應(yīng)用Clustal X(Version 1.83)軟件進(jìn)行同源性分析,用Treeview(Version 3.2)軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

        1.5 酶活測(cè)定

        小麥秸稈發(fā)酵液經(jīng)5 400 r/min離心15 min,上清液即為粗酶液。CMC酶活力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]。

        纖維素酶活公式:

        X為纖維素酶活(U/mL);W為葡萄糖生成量(mg);V為反應(yīng)液中酶液加入量;5.56為1 mg的葡萄糖的微摩爾數(shù)(1 000/180=5.56);N為樣品稀釋倍數(shù);T為反應(yīng)時(shí)間。

        木聚糖酶活力測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]。木聚糖酶活公式:

        X為木聚糖酶(U/mL);W為木糖生成量(mg);V為反應(yīng)液中酶液加入量;5.56為1 mg的木聚糖的微摩爾數(shù)(1 000/150=6.67);N為樣品稀釋倍數(shù);T為反應(yīng)時(shí)間。

        采用Van Soest法測(cè)定纖維素、半纖維素與木質(zhì)素含量,按照文獻(xiàn)[12]方法,并略加改動(dòng):即①用18%H2SO4代替37%濃鹽酸配制地衣酚試劑;②用3%SDS代替Van Soest方法配制的中性洗滌劑。

        1.6 還原糖含量的測(cè)定

        在試管中加入1 mL上清液(可適當(dāng)稀釋),3.0 mL DNS試劑,將待測(cè)樣品放入沸水浴中反應(yīng)5 min,用水定容至25 mL,空白管以1 mL水代替1 mL酶液,然后以空白管較零,在540 nm下測(cè)定吸光度,根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出還原糖的含量[13]。

        1.7 紅外掃描樣品

        定時(shí)取出發(fā)酵液5 400 r/min離心10 min,所獲得的殘?jiān)?0 ℃下烘干至恒重,然后取約4 mg殘?jiān)谘欣徶?,并加少量的KBr,研磨充分,進(jìn)行壓片[14]。

        1.8 數(shù)據(jù)分析

        采用SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,每處理3次重復(fù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 降解小麥秸稈菌株的篩選

        從采集的小麥秸稈樣本中篩選出具有一定秸稈降解能力的菌株29株,經(jīng)搖瓶培養(yǎng)測(cè)定對(duì)比各菌株降解纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的能力,最終確定菌株ZH-19降解秸稈能力最高,對(duì)小麥秸稈中的纖維素和半纖維素降解率分別達(dá)到87.91%±5.24%和66.54%±7.56%。

        2.2 菌株ZH-19的鑒定

        如圖1所示,菌株ZH-19的菌落在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d,直徑約50 mm,中間有臍狀突起而其他部分平坦;質(zhì)地絨狀;分生孢子大量產(chǎn)生;菌落中心呈灰綠色,菌落反面為黃褐色。

        以菌株ZH-19基因組DNA為模板,采用通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增整個(gè)ITS序列,PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后插入pGEM-T載體中,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將序列提交到Genebank數(shù)據(jù)庫,數(shù)據(jù)庫登記號(hào)為DQ532125。將其ITS基因序列在Genebank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì),與其相似性較高序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示,從相似性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出,Penicillium thiersii NRRL 28147與菌株ZH-19的ITS序列的相似性達(dá)100%,表明二者親緣性最近。因此,綜合形態(tài)鑒定和分子鑒定,將菌株ZH-19命名為Penicillium thiersii ZH-19。

        2.3 P. thiersii ZH-19降解小麥秸稈

        2.3.1 纖維素酶、半纖維素酶和還原糖的變化 從圖3可知,從發(fā)酵開始到第4.5天,小麥秸稈還原糖濃度逐漸下降,到第4.5天降到最小值,為165.33 μg/mL,之后還原糖濃度先上升后下降,直到第9天后趨于平穩(wěn),還原糖濃度不再變化。1.5 d之前菌體密度較低,對(duì)培養(yǎng)基原有還原糖消耗較低,且種子培養(yǎng)基內(nèi)帶有部分纖維素酶和木聚糖酶,將秸桿分解為還原糖。隨著培養(yǎng)過程的發(fā)展,菌體生長(zhǎng)加快,消耗糖較大,因此還原糖濃度逐漸下降至最低;從第4.5天開始,由于菌體消耗的糖和產(chǎn)生的還原糖維持平衡,還原糖的濃度保持不變。

        0~7.5 d培養(yǎng)期間,P. thiersii ZH-19菌株所產(chǎn)生的纖維素酶和木聚糖酶活性總體上均處于上升階段。其中,纖維素酶活性在培養(yǎng)第6天時(shí)達(dá)到最大,為145.54 U/mL;而木聚糖酶在第7.5天時(shí)達(dá)到最大,為93.54 U/mL,之后二者活性均呈逐漸降低的趨勢(shì)。結(jié)果表明,在前6 d培養(yǎng)過程中,P. thiersii ZH-19菌株處于有利于菌體生長(zhǎng)、酶表達(dá)和分泌的有利條件,第7.5天后,由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、pH變化等因素影響,導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)以及酶活保持能力均有一定程度的下降。

        2.3.2 纖維素和半纖維素含量的變化 由圖4可知,小麥秸桿中纖維素含量明顯高于半纖維素含量。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加,纖維素和半纖維素含量呈降低的趨勢(shì);第7.5天,二者含量下降至6.57%±0.53%、1.72%±0.72%。之后,纖維素和半纖維素的含量變化不明顯。從圖4中也可看出,纖維素含量下降的速率要明顯快于半纖維素,由此可推測(cè)P. thiersii ZH-19菌株優(yōu)先降解纖維素。這也與其產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶活變化情況一致。

        2.3.3 P. thiersii ZH-19降解小麥秸稈后樣品的FT-IR分析 圖5為第0、6、10.5天P. thiersii ZH-19菌株降解小麥秸稈的FT-IR圖譜。由圖5可知,隨著發(fā)酵天數(shù)的增加,3 328 cm-1左右,2 358 cm-1左右、1 432~1 593 cm-1、1 318 cm-1和989~1 112 cm-1的相對(duì)峰值增強(qiáng)以及譜峰向低波數(shù)方向移動(dòng),表明小麥秸桿中碳水化合物(纖維素和半纖維素)在逐步分解,大分子的長(zhǎng)鏈烴切斷成小分子的短鏈烴,木質(zhì)纖維素中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)逐漸被裂解成為鏈狀化合物,從而使羥基、亞甲基基團(tuán)及羧基數(shù)量不斷增加,再次證實(shí)了P. thiersii可降解秸桿中纖維素和半纖維素。

        3 小結(jié)

        從自然環(huán)境中篩選出1株可同時(shí)分泌纖維素酶和木聚糖酶的菌株,通過形態(tài)學(xué)分析和ITS保守區(qū)進(jìn)行測(cè)序,該菌株被鑒定為Penicillium thiersii ZH-19,其序列在GenBank上登記號(hào)為DQ235784。通過酶活測(cè)定、秸稈中纖維素和半纖維素含量測(cè)定以及FT-IR分析發(fā)現(xiàn),篩選的P. thiersii ZH-19在降解小麥秸稈過程中,纖維素優(yōu)先被降解,同時(shí),該降解過程可能由纖維素酶、半纖維素酶協(xié)同作用下實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)纖維素的最大降解。今后將進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分,提高酶活性,克隆相關(guān)的功能基因,深入研究其酶學(xué)性質(zhì),為開發(fā)新型纖維素酶和木聚糖酶制劑奠定基礎(chǔ)。

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