摘要：以江漢油田石油污染土壤為對(duì)象，篩選出一株產(chǎn)表面活性物質(zhì)的菌株，其代謝產(chǎn)物排油活性好、降低水體表面張力效果明顯，但乳化性能不明顯。經(jīng)過5次傳代培養(yǎng)，結(jié)果表明其具有較好的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)鑒定為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。菌株最佳生長(zhǎng)溫度為30 ℃，降解試驗(yàn)表明該細(xì)菌對(duì)柴油具有良好的降解作用，且細(xì)菌生長(zhǎng)與柴油的降解過程具有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：生物表面活性劑；菌株篩選；柴油污染；降解

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）17-4520-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.17.041

Abstract： An optimum strain was chosen from the petroleum contaminated soil in Jianghan oilfield， and its metabolites showed good oil discharge activity and obvious reducing effect of the water surface tension， but the emulsifying properties was not obvious. Five times of subculture showed that the strain has good genetic stability， which was identified as Pseudomonas fluorescens by identification system. Further study showed that the optimum growth temperature of the strain was 30 ℃. By diesel degradation experiments， this study confirmed that the strain has good ability of diesel degradation and furthermore the degradation process and the strain growth has a certain relationship.

Key words： biosurfactant；strain screening；diesel contamination； degradation

目前石油烴及重金屬已經(jīng)成為土壤及其含水層最主要的污染物[1-4]，而有機(jī)污染物往往是疏水性物質(zhì)，如三氯乙烯、多環(huán)芳烴和多氯聯(lián)苯等都難溶于水，生物利用性低，難溶性已成為制約土壤及水體有機(jī)污染物降解的瓶頸問題[5，6]。已有的研究表明，表面活性劑的加入可增加有機(jī)污染物在水相中的傳遞速率，是一種行之有效的生物降解強(qiáng)化手段，具有極大的利用潛力。在有機(jī)污染物的生物降解中，表面活性劑主要通過以下3個(gè)方面的作用提高有機(jī)污染物的生物可利用性：乳化作用、提高假相溶解度、增強(qiáng)降解微生物膜的通透性[7，8]。與化學(xué)合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑具有3個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)：更強(qiáng)的生物降解性能、更低的生物毒性以及更好的環(huán)境兼容性。

生物表面活性劑作為表面活性劑的一種特殊類型，是由微生物（主要是細(xì)菌和酵母）對(duì)糖類、油類以及烷烴等有機(jī)物分解代謝的生化產(chǎn)物[9]，按成分可分為糖脂、脂肽、磷脂、脂肪酸、中性脂肪等幾類[10-12]。產(chǎn)生物表面活性劑的微生物非常廣泛，包括細(xì)菌、真菌以及放線菌和古菌[13-18]，而要開發(fā)新的生物表面活性劑，獲得高效的工程菌株，首先必須對(duì)產(chǎn)生物表面物質(zhì)的菌株進(jìn)行廣泛的篩選。為此，本研究對(duì)江漢油田石油污染土壤浸出液的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)及分離，根據(jù)各菌株發(fā)酵液對(duì)表面張力降低的程度、排油活性及乳化性能指標(biāo)進(jìn)行篩選，并測(cè)試對(duì)柴油的降解效果，旨在篩選出具有良好的降解性能且遺傳穩(wěn)定性好、具備一定工程運(yùn)用潛力的菌株。

1 材料與方法

1.1 采集點(diǎn)及樣品性質(zhì)

樣品采自湖北省江漢油田煉油廠油井附近被污染的土壤，采樣點(diǎn)為3處油井，分別編為1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)，含水率分別為20%、21%、29%，有機(jī)質(zhì)含量分別為2.37%、2.12%、3.23%。

1.2 菌種富集

將配制好的保存在冰箱中的土壤浸出液取其上清液10 mL接種到100 mL已滅菌的富集培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min的全溫振蕩器搖床上振蕩培養(yǎng)3～5 d。富集培養(yǎng)基配方為：KCl 0.11 g，（NH4）2SO4 10.0 g， NaCl 1.1 g， KH2PO4 3.4 g， K2HPO4 4.4 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.5×10-5 g，EDTA 1.0 g，酵母浸粉0.5 g，液體石蠟5 mL，去離子水定容至1 L，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

1.3 菌種分離

1.3.1 富集培養(yǎng)菌液稀釋 移取1 mL富集培養(yǎng)的培養(yǎng)液至裝有99 mL無菌水的三角瓶中，混合均勻后即為10-2稀釋液，再依次稀釋制成10-3、10-4、10-5和10-6的梯度稀釋液。

1.3.2 涂布分離 分別取稀釋好的菌液各0.2 mL，均勻涂布在倒有血平板培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。

1.3.3 菌株純化 為了得到純菌株，需要對(duì)挑選的菌落進(jìn)行多次劃線培養(yǎng)，并用斜面培養(yǎng)基進(jìn)行劃線培養(yǎng)，看其傳代生長(zhǎng)情況。最后對(duì)傳代培養(yǎng)長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株進(jìn)行粗篩。

1.4 菌株初篩

選擇劃線培養(yǎng)長(zhǎng)勢(shì)良好的9個(gè)菌株移入發(fā)酵培養(yǎng)基（配方為葡萄糖20 g、（NH4）2SO4 20 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4 2 g、Na2HPO4 2 g、CaCl2 0.005 g、去離子水定容至1 L、pH 7.2～ 7.4、121 ℃滅菌20 min）進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定其發(fā)酵液對(duì)純凈水表面張力的影響，同時(shí)分別測(cè)定發(fā)酵液的排油活性及乳化性能，初步確定菌株在代謝過程中有無表面活性物質(zhì)產(chǎn)生。

1.4.1 表面張力測(cè)定 采用白金板法測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)3 d后發(fā)酵上清液的表面張力，每種菌株的上清液每隔1 mL作一個(gè)梯度，觀察其表面張力隨著上清液的增加下降趨勢(shì)是否明顯。

1.4.2 排油活性測(cè)定 將各菌株發(fā)酵液3 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行排油試驗(yàn)。于培養(yǎng)皿中加入30 mL去離子水，滴加1 mL（4～5滴）經(jīng)蘇丹紅染色后的液體石蠟，液體石蠟呈圓形漂浮在水面，在油膜中心滴加1 mL發(fā)酵液的上清液，中心油膜被擠向四周形成一個(gè)圓圈，測(cè)定排油圈直徑。

1.4.3 乳化性能測(cè)定 分別用食用油和柴油進(jìn)行乳化試驗(yàn)。將發(fā)酵液與柴油或食用油各4 mL混合，充分振蕩5 min后，油水形成均勻的白色乳化液，將乳化液倒入量筒中于室溫條件下靜止放置，在不同時(shí)間測(cè)定兩相體積變化。

1.5 遺傳穩(wěn)定性

根據(jù)以上表面張力、排油活性及乳化性能的測(cè)定結(jié)果，選擇效果較好的菌株分別測(cè)定傳代后的排油活性及其對(duì)表面張力的影響，以挑選出遺傳穩(wěn)定性好的菌株。

1.6 菌株鑒定

根據(jù)前期粗篩結(jié)果，選擇產(chǎn)表面活性物質(zhì)量大、活性強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定性好的菌株，在個(gè)體形態(tài)和生理生化特征研究基礎(chǔ)上，利用VITEK全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.7 對(duì)柴油的降解效果

對(duì)鑒定出的菌株對(duì)柴油的降解效果進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)采用6個(gè)錐形瓶，瓶中分別加入45 mL不含葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌處理后，再分別加入5 mL菌懸液和0.5 mL柴油，每隔12 h取一次樣。取樣時(shí)將培養(yǎng)液倒入離心管，在低速冷凍離心機(jī)中以5 000 r/min離心20 min，取其上清液放入4 ℃冰箱內(nèi)保存，同時(shí)測(cè)定每一次取樣時(shí)樣品培養(yǎng)液的OD600 nm。待72 h后所有的樣品保存好，用TOC分析儀測(cè)定樣品中的TOC含量?？紤]到TOC分析儀的檢測(cè)限范圍，測(cè)定時(shí)將樣品稀釋100倍，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離

在血平板培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)后，選擇菌落清晰、長(zhǎng)勢(shì)較好且區(qū)分明顯的菌落，并且在其附近沒有其他菌落的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。3處土壤樣品土壤浸出液涂布培養(yǎng)后各挑取12個(gè)不同形態(tài)的菌落，對(duì)挑選出來的36個(gè)單菌落進(jìn)行劃線分離純化培養(yǎng)，經(jīng)過多次劃線分離培養(yǎng)得到30株純化菌株。

2.2 菌株粗篩

對(duì)挑選出來的30株菌株進(jìn)行表面張力測(cè)定，其中9株菌株降低表面張力效果明顯，對(duì)這9株菌株的排油活性測(cè)定結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，5號(hào)菌株的排油活性最佳。

圖2是9株菌株乳化活性測(cè)定結(jié)果。從圖2可以看出，柴油和食用油與水的交界面乳化層都不明顯，而且隨著時(shí)間的推移，兩相體積也未發(fā)生明顯變化，表明所篩選菌株的代謝產(chǎn)物中無產(chǎn)生物乳化活性物質(zhì)的潛力。

2.3 遺傳穩(wěn)定性

選取排油活性與表面張力降低較好的1、4、5、6和8號(hào)菌株，分別用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行5次傳代培養(yǎng)，并將每一代的培養(yǎng)液用“2.2”的方法測(cè)其表面張力和排油活性。在測(cè)每一代的表面張力和排油活性時(shí)，每一代接種3個(gè)培養(yǎng)瓶在相同條件下同時(shí)培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后同時(shí)離心測(cè)定表面張力和排油活性，然后取3次數(shù)據(jù)的平均值。試驗(yàn)結(jié)果（圖3、圖4）表明，5號(hào)菌株的表面張力和排油活性傳代性能最穩(wěn)定。

2.4 菌株鑒定

根據(jù)5號(hào)菌株的個(gè)體形態(tài)和生化觀測(cè)結(jié)果，選擇NFC鑒定卡，利用VITEK全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，鑒定后對(duì)照伯杰氏手冊(cè)可以確定5號(hào)菌株為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），具體見表1。

2.5 對(duì)柴油的降解效果

為了獲得5號(hào)菌株對(duì)柴油最佳的降解效果，首先確定5號(hào)菌株的最佳生長(zhǎng)溫度。如圖5所示，5號(hào)菌株在30 ℃時(shí)生長(zhǎng)最佳，因此將5號(hào)菌株對(duì)柴油降解試驗(yàn)的溫度設(shè)為30 ℃。

圖6顯示加入5號(hào)菌株以及未加入細(xì)菌溶液TOC含量的變化。從圖6可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過12 h的培養(yǎng)，加入5號(hào)菌株和空白對(duì)照的TOC濃度均略有降低；24 h后，細(xì)菌降解組的TOC濃度很快降低至10.33 mg/L，而對(duì)照TOC濃度基本維持不變；最終經(jīng)過72 h的培養(yǎng)，細(xì)菌降解組TOC濃度降為4.84 mg/L，而對(duì)照TOC濃度為9.34 mg/L（以上濃度均為稀釋100倍后測(cè)試數(shù)據(jù)）?？傮w來看，柴油的自然揮發(fā)及降解不明顯，而加入5號(hào)菌株明顯提高了柴油的降解速率。

與柴油的降解效果相對(duì)應(yīng)，試驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了不同時(shí)間溶液的OD600 nm，用于表征細(xì)菌濃度的變化。從圖7可以看出，細(xì)菌降解組溶液OD600 nm起始為0.082，12 h之后上升為0.093，24 h之后達(dá)到峰值0.144，而36 h之后降低為0.100，此后一直到72 h均維持在0.8～0.9的水平，與細(xì)菌生長(zhǎng)的適應(yīng)期、指數(shù)期及穩(wěn)定期對(duì)應(yīng)，反映了P. fluorescens菌在柴油降解過程中的生長(zhǎng)周期規(guī)律，也印證了P. fluorescens菌降解柴油的過程同時(shí)也是細(xì)菌利用柴油作為碳源生長(zhǎng)的過程。與細(xì)菌降解組對(duì)應(yīng)，對(duì)照由于沒有加入細(xì)菌，OD600 nm一直處于0.3～0.4的低水平，無明顯波動(dòng)。

3 小結(jié)

以江漢油田石油污染土壤為對(duì)象，篩選出一株產(chǎn)表面活性物質(zhì)的菌株，其代謝產(chǎn)物具有排油活性好、降低水體表面張力效果明顯的特征，但乳化性能不明顯。經(jīng)過5次傳代培養(yǎng)，表明其具有較好的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)確定為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。菌株最佳生長(zhǎng)溫度為30 ℃，降解試驗(yàn)表明該細(xì)菌對(duì)柴油具有良好的降解能力，且細(xì)菌生長(zhǎng)與柴油的降解過程具有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明該細(xì)菌具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] SOLANO-SERENA F，MARCHAL R，CASAR？魪GOLA S，et al. A Mycobacterium strain with extended capacities for degradation of gasoline hydrocarbons[J].Applied and Environmental Microbiology，2000， 66（6）：2392-2399.

[2] GUHA S，JAFFE P R. Biodegradation kinetics of phenanthrene partitioned into the micellar phase of nonionic surfactants[J]. Environmental Science Technology，1996，30（2）：605-611.

[3] LIN S C. Biosurfactant： recent advances[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology，1996，63：109-120.

[4] 丁竹紅，胡 忻，尹大強(qiáng).螯合劑在重金屬污染土壤修復(fù)中運(yùn)用研究進(jìn)展[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2009，18（2）：777-782.

[5] MULLIGAN C N.Environmental applications for biosurfactants[J]. Environmental Pollution，2009，133（2）：183-198.

[6] KANGA S H，BONNER J S，PAGE C A，et al. Solubilization of naphthalene and methyl-substituted naphthalenes from crude oil using biosurfactants[J].Environmental Science and Technology， 2007，31（2）：556-561.

[7] BRAGG J R，PRINCE R C，HARNER E J，et al. Effectiveness of bioremediation for the Exxon Valdez oil spill[J].Nature， 1994，368：413-418.

[8] MULLIGAN C N，GIBBS B F. Recovery of biosurfactants by ultrafiltration[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology，1990，47（1）： 23-29.

[9] WANG L M，LIU P W，MA C C，et al. Application of rhamnolipid and surfactin for enhanced diesel biodegradation--effects of pH and ammonium addition[J].Journal of Hazardous Materials，2009，164（2-3）：1045-1050.

[10] ABDEL-MAWGOUD A M，ABOULWAFA M M，HASSOUNA N A.Characterization of rhamnolipid produced by Pseudomonas aeruginosa isolate Bs20[J].Appl Biochem Biotechnol，2009， 157（2）：329-345.

[11] ROONEY A P，PRICE N P J，RAY K J，et al. Isolationand characterization of rhamnolipid-producing bacterial strains from a biodiesel facility[J].FEMS Microbiol Lett，2009，295（1）： 82-87.

[12] SHIN J D，LEE J，KIM Y B， et al. Production and characterization of methyl ester sophorolipids with 22-carbon-fatty acids[J].Bioresource Technology，2010，101（9）：3170-3174.

[13] ISHIGAMI Y，OSMAN M，NAKAHARA H，et al. Significance of b-sheet formation for micellization and surface adsorption on surfactin[J].Colloids and Surfaces，1995，4（6）：341-348.

[14] DAS K， MUKHERJEE A K. Characterization of biochemical properties and biological activities of biosurfactants produced by Pseudomonas aeruginosa mucoid and non-mucoid strains isolated from hydrocarbon-contaminated siol samples[J].Applied Microbial and Cell Physiology，2005，69（2）：192-199.

[15] LOTFABADA T B，SHOURIANC M，ROOSTAAZADA R，et al.An efficient biosurfactant-producing bacterium Pseudomonas aeruginosa MR01，isolated from oil excavation areas in south of Iran[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2009，69（2）： 183-193.

[16] 蔣 磊，楊慧群，陶語(yǔ)若.生物表面活性劑及其在生物降解中的應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（17）：3457-3461.

[17] COOPER D G，PADDOCK D A. Production of a biosurfactant from Torulopsis bombicola[J].Applied and Environmental Microbiology，1984，47（1）：173-176.

[18] HUE N，SERANI L，LAPRE O.Structural investigation of cyclic peptidolipids from Bacillus subtilis by high energy tandem mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry，2001，15（3）：203-209.