摘要：于2014年11月和2015年3月從天津轄區(qū)分別采集了淡水水樣和海水水樣，分別利用BG11和f/2培養(yǎng)基，采用平板分離法對水樣中的微藻進行了分離。將分離得到的菌株擴大培養(yǎng)后提取基因組DNA，經聚合酶鏈式反應（PCR）擴增18S rDNA，將PCR 產物測序后與NCBI基因數據庫比對確定品種。試驗分離得到菌株179株，其中有143株經序列比對，確定分屬于綠藻門6個不同的屬，建立了系統發(fā)育樹，同時初步建立了天津水域冬、春兩季微藻種質資源庫。

關鍵詞：微藻；分離；鑒定；天津水域；冬、春兩季

中圖分類號：Q949.21 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）17-4506-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.17.038

Abstract： Water samples were collected from both freshwater and seawater in Tianjin in Novermber 2014 and March 2015. Microalgae strains in the water samples were isolated by BG11 or f/2 media. Genomic DNA of each strain was extracted after cultivation and 18S rDNA was amplified by PCR and sequenced. By blasting the sequencing results in the NCBI GenBank database，the genus of those microalgae were identified. A total of 179 strains were isolated，wherein 143 fell into six genera of Chlorophyta. A phylogenetic tree was built based on the sequencing results. Moreover，a preliminary collection of native microalgae in Tianjin was established.

Key words： microalgae； isolation； identification； Tianjin waters； winter and spring

微藻廣泛存在于地球上的湖泊、河流、沼澤等淡水環(huán)境中，種類繁多、個體微小，具有很強的光合效率和生長速率[1]。微藻細胞富含蛋白質、藻多糖、β-胡蘿卜素等營養(yǎng)成分和化工原料，還含有鐵、銅、鋅等多種無機元素，其本身在農業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品、環(huán)境監(jiān)測、污水處理、生物技術等領域具有非常重要的開發(fā)利用價值[2-6]；而且一些特殊種類的微藻可生產包括生物柴油、生物乙醇在內的多種形式的可再生燃料，可以通過厭氧發(fā)酵得到甲烷，或者通過光生物反應產生生物氫，是值得研究和開發(fā)的重要新能源——生物燃料的原材料之一[7-17]。

天津市東臨渤海，海岸線長153 km，流經天津市的一級河道有19條，總長1 095.1 km，二級河道79條，總長4 578 km，水資源極其豐富。遼闊的水域成為微藻生長的理想空間。此外，天津市是東亞季風盛行的地區(qū)，屬暖溫帶半濕潤季風性氣候，年平均氣溫14 ℃，夏半年受太平洋副熱帶暖高壓影響，氣溫平均在20 ℃以上，相對有利于微藻的生長。但是冬、春兩季氣溫較低，目前關于天津冬、春季微藻種類的研究少有報道。為此，本研究將采樣時間定為冬、春季，以期對天津水域微藻種群有更全面的了解。

在經歷了實驗室分離純化步驟之后，微藻外部形態(tài)結構遭到不同程度的破壞；同時，實驗室培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)條件與生長環(huán)境不完全與自然環(huán)境相同，部分微藻形態(tài)學特征已發(fā)生改變，所以僅依靠微藻形態(tài)學特征來進行分類鑒定已不能滿足要求。本研究主要采用分子生物學手段對微藻進行種類鑒定，通過與美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）建立的DNA序列數據庫中已有同源序列進行比對，構建系統進化樹，確定所采集到微藻的分類地位及其與其他藻種的進化關系。

1 材料與方法

試驗所用樣品采集自天津水域，采樣地點分別位于新港船閘橋（北緯39°1′1″，東經117°41′48″）、天津港（北緯38°59′24″，東經117°42′50″）、北塘海鮮市場（北緯39°6′3″，東經117°43′28″）、天津大學（北緯39°6′28″，東經117°9′54″）。

1.1 材料

1.1.1 試驗試劑 植物基因組提取試劑盒（Generay，中國上海），普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN，中國北京），即用型Taq酶PCR試劑盒（Generay，中國上海），Pst I內切酶（Generay，中國上海），Taq I內切酶（捷瑞，中國上海）、瓊脂糖（Biowest），1×TAE電泳緩沖液，GeneFinder核酸染料，上樣緩沖液，MarkerV，高保真DNA聚合酶（Pyrobest DNA polymerase），BG11培養(yǎng)基，f/2培養(yǎng)基等。

1.1.2 試驗儀器 光學顯微鏡（Nikon eclipse Ni，日本），高壓滅菌鍋（Hirayama HVE-50，日本），超凈工作臺（AirTech JW-CJ-2FD，中國蘇州），高速冷凍離心機（Hettich UNIVERSAL 320R，德國），高速離心機（Eppendorf5418R，德國），PCR儀（Biometra Standard Gradient 96，德國），電泳儀（六一儀器DYY-6C，中國北京），凝膠成像分析儀（WD-9413B），光照培養(yǎng)箱（SPX-GBH，中國上海），可調微量移液器（Eppendorf），電熱恒溫水浴鍋。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 在每個采樣點表層取1瓶水樣，裝于已滅菌的500 mL藍蓋試劑瓶中，于2 h內運回實驗室。淡水樣品采樣日期為2014年11月，海水樣品采樣日期為2015年3月。

1.2.2 分離 所采集到的樣品微藻濃度較低，需要在實驗室進行預培養(yǎng)。取10 mL水樣加入已滅菌的裝有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，根據樣品來源，海水和淡水分別選擇BG11和f/2培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，白色日光燈光照度約為2 000 lx，光暗周期為12 h∶12 h。當微藻細胞達到適當濃度，取50 mL離心分離，12 000 r/min離心5 min，濃縮至約5 mL。在超凈臺上將每個樣品培養(yǎng)液的濃縮液涂布于對應的含1%瓊脂的BG11固體培養(yǎng)基或f/2固體培養(yǎng)基上，每個樣品各涂布3個平板，每個平板涂布量均為100 μL。將平板用Parafilm？誖封口后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[18-20]。培養(yǎng)條件同上。

培養(yǎng)約2周后，平板中長出菌落，在超凈臺上采用四分劃線法分離，劃線后用Parafilm？誖膜封口，置于光照培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上。

1.2.3 擴大培養(yǎng) 培養(yǎng)約2周后， 平板中長出單菌落，在超凈臺上用已滅菌的牙簽挑取各平板中的單菌落， 每個采樣點各挑取菌落約40個，接種于含100 mL已滅菌的對應液體培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，每天搖動錐形瓶若干次。

1.2.4 形態(tài)學觀察 取適宜濃度的純種藻細胞培養(yǎng)液20 μL，滴在無菌的載玻片上，從液滴的一側小心地蓋上蓋玻片，避免產生氣泡。將載玻片置于顯微鏡下觀察[21]，若藻細胞運動能力較強，可在空氣中放置一段時間，待水分減少，藻細胞運動緩慢或者不再運動時再進行細致觀察。通過顯微鏡所連接的拍照系統進行拍照，記錄藻細胞的形態(tài)結構[18-20]。

1.2.5 基因組DNA的提取和18S rDNA分析 待錐形瓶中微藻生長至對數生長期（OD680 nm≈0.8）時，取50 mL藻液4 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，剩余藻液轉移至2 mL離心管，12 000 r/min離心3 min，用移液器小心移去上清液后，將濃縮的藻液加入裂解管中，在勻質機上振蕩30 s，5 min后再振蕩30 s后進行研磨。研磨結束后用植物基因組DNA提取試劑盒提取微藻DNA。由于藻細胞數量較多，且分類地位不是很明確，試驗確定18S rRNA引物序列為519f/1406r（519forward：5′-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3′，1406reverse：5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′），所用引物由深圳華大基因科技股份有限公司合成。采用25 μL的PCR擴增反應體系（混合酶13 μL、模板DNA（10～25 ng）1 μL、10 mmol/L正向引物1 μL、10 mmol/L反向引物1 μL、ddH2O 9 μL）。PCR擴增反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓100 V，電泳時間20～30 min[18-20]。測序工作由深圳華大基因科技股份有限公司完成。

1.2.6 序列分析和系統進化樹建立 將DNA測序結果與NCBI數據庫中的已有序列進行Blast比對，確定藻種。使用MEGA 5.10軟件，通過Blast與GenBank中已存的基因進行對比，設置算法自檢程序Bootstrap設為1 000次，用最大似然法（Maximal Likelyhood）算法建樹。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學觀察結果

在實驗室培養(yǎng)條件下，能夠正常生長的大部分是個體較小的藻種，通過形態(tài)難以準確判斷它們的所屬類別及其所處的分類地位。在40×10顯微鏡下觀察并拍照，共觀察到8種細胞形態(tài)（圖1、圖2）。

2.2 藻種系統發(fā)育分析

表1列出了藻種的系統分類及每個屬的藻種所對應的鏡檢圖。利用MEGA 5.10軟件對DNA測序結果繪制的系統進化樹見圖3。試驗所測的DNA序列在GenBank中的序列號分別是：分離自淡水的藻種KR632631、KR632632、KR632633、KR632634，分離自海水的藻種KR758763、KR758764。

測序結果顯示，在所有測定的藻種中有164個屬于綠藻門，其中37個藻種屬于柵藻科，分屬尖帶藻屬（Acutodesmus）、柵列藻屬（Scenedesmus）兩個屬；最多的種類是小球藻屬（Chlorella），有43個，同樣屬于綠球藻目小球藻科，另外16個藻種被確定為月牙藻屬（Selenastrum），22個藻種被確定為扇帶藻屬（Pectinodesmus）；還有25個藻種樣品被確定為卵囊藻科（Oocystaeeae）的擬新月藻屬（Closteriopsis）；然而，有12個藻種（圖1a）只能鑒定到屬于綠藻綱，Blast比對結果為綠藻綱（Chlorophyceae），還有24個藻種（圖1f）未顯示所屬種類。

分離得到的179個藻種中，小球藻屬最多，有43個，占總數的24.0%，柵列藻屬（Scenedesmus）與擬新月藻屬（Closteriopsis）各25個藻種，各占總數的14.0%；扇帶藻屬（Pectinodesmus）22個藻種，占總數的12.3%；月牙藻屬（Selenastrum）16個藻種，占總數的8.9%；尖帶藻屬（Acutodesmus）12個藻種，占總數的6.7%。

3 小結與討論

本研究從天津市采集海水和淡水水樣，分別用BG11和f/2培養(yǎng)基分離微藻，對微藻進行顯微觀察，并用分子生物學技術對其進行鑒定，確定其藻種后建立了系統進化樹，分離所得到的179個藻種中有143個藻種有準確的鑒定結果，分屬2個目3個科6個屬。本研究初步開展了天津本地微藻藻種的分析鑒定工作，為天津本地微藻生物產業(yè)的發(fā)展奠定了一定基礎。

本試驗采用適宜大多數微藻生長的BG11和f/2培養(yǎng)基，分離所得到的藻種較少，且均屬于綠藻門綠藻綱，較為單一，其原因可能如下。

1）采用平板分離法。有研究表明，固體培養(yǎng)基中的瓊脂會抑制除綠藻外其他藻種的生長。

2）培養(yǎng)基選擇較為單一。篩選出來的藻種不夠豐富，尚未發(fā)現硅藻和甲藻。如果選取幾種不同的培養(yǎng)基同時進行試驗，可以增加篩選結果的豐富度。如邵聰聰等[22]用廣譜SE培養(yǎng)基及專門篩選單細胞微藻的Khul培養(yǎng)基篩選出16個不同屬種的綠藻；李珍寧[23]采用D1培養(yǎng)基篩選出包括小球藻、柵藻和月牙藻在內的8種綠藻和2種脆桿硅藻；周應科[24]用形態(tài)學方法分離出36種硅藻和35種綠藻；薛林貴等[25]確定了AB培養(yǎng)基中含有豐富微量元素和維生素B12，藍藻在其中生長迅速，能在短時間內達到較高生物量。

3）冬季采樣。冬季湖水中的微藻多樣性和種群密度均有所下降，對分離結果有一定影響。許瑾等[26]僅采取BG11培養(yǎng)基對華南地區(qū)淡水微藻進行篩選，分離出包括柵藻屬、盤星藻屬、月牙藻屬、纖維藻屬、小球藻屬、綠球藻屬等在內的12種淡水微藻；郝宗娣等[27]分離熱帶淡水產油微藻得到了衣藻屬和空星藻屬共15個藻種。

4）優(yōu)勢種抑制了其他物種。從分離結果來看，柵藻科占總采樣數的37.5%，個體數量多，生物量較大，分布普遍，占有競爭優(yōu)勢，在采樣地成為優(yōu)勢種，從而抑制了其他物種的生長發(fā)育。

參考文獻：

[1] NAESSENS M， TRAN-MINH C. Whole-cell biosensor for determination of volatile organic compounds in the form of aerosols[J]. Analytica Chimica Acta，1998，364（1-3）：153-158.

[2] KEBEDE-WESTHEAD E，PIZARRO C，MULBRY W W. Treatment of swine manure effluent using freshwater algae： Production，nutrient recovery，and elemental composition of algal biomass at four effluent loading rates[J].Journal of Applied Phycology，2006，18（1）：41-46.

[3] RAJA R，HEMAISWARYA S，KUMAR N A，et al. A perspective on the biotechnological potential of microalgae[J].Critical Reviews in Microbiology，2008，34（2）：77-88.

[4] WANG B，LI Y Q，WU N，et al. CO2 bio-mitigation using microalgae[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2008， 79（5）：707-718.

[5] SPOLAORE P，CASSAN C J，DURAN E，et al. Commercial applications of microalgae[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2006，101（2）：87-96.

[6] 傅曉娜，姚 剛.微藻污水處理與生物質能耦合技術綜述[J].綠色科技，2011（11）：100-104.

[7] KAPDAN I K，KARGI F. Bio-hydrogen production from waste materials[J].Enzyme and Microbial Technology，2006，38（5）：569-582.

[8] AHLUWALIA S S，GOYAL D. Microbial and plant derived biomass for removal of heavy metals from wastewater[J]. Bioresource Technology，2007，98（12）：2243-2257.

[9] PRATOOMYOT J，SRIVILAS P，NOIRAKSAR T. Fatty acids composition of 10 microalgal species[J].Songklanakarin Journal of Science and Technology，2005，27（6）：1179-1187.

[10] HOSSAIN A B M S，SALLEH A，BOYCE A N，et al. Biodiesel fuel production from algae as renewable energy[J]. American Journal of Biochemistry and Biotechnology，2008，49（1）：250-254.

[11] ROSENBERG J N，OYLER G A，WILKINSON L，et al. A green light for engineered algae：Redirecting metabolism to fuel a biotechnology revolution[J].Current Opinion in Biotechnology， 2008，19（5）：430-436.

[12] 孔維寶，華紹烽，宋 昊，等.利用微藻生產生物柴油的研究進展[J].中國油脂，2010，35（8）：51-56.

[13] 黃雄超.微藻油脂的提取及制備生物柴油的研究[D].福建泉州：華僑大學，2012.

[14] YANG X W，DAI X，ZHANG R，et al. Long-chain alcohols derived from the microalgae monoraphidium[J].Advances in Energy Research，2013，1（2）：107-116.

[15] YANG X，DAI X，GUO H，et al. Petrodiesel-like straight chain alkane and fatty alcohol production by the microalga Chlorella sorokiniana[J].Bioresource Technology，2013，136：126-130.

[16] DAROCH M，SHAO C，LIU Y，et al. Induction of lipids and resultant FAME profiles of microalgae from coastal waters of Pearl River Delta[J].Bioresource Technology，2013，146：192-199.

[17] GUO H，DAROCH M，LIU L，et al. Biochemical features and bioethanol production of microalgae from coastal waters of Pearl River Delta[J].Bioresource Technology，2013，127：422-428.

[18] 張桂和，徐碧玉，王 珺.幾種海洋微藻基因組DNA的分離提取及PCR檢測[J].熱帶海洋學報，2007，26（1）：68-72.

[19] 周銀環(huán)，劉東超.微藻的分離技術及其應用[J].河北漁業(yè)， 2007（5）：43-45.

[20] 李芳芳，隋正紅，龔春霞，等.5種沙漠微藻的分離鑒定及其18S rDNA保守區(qū)片段差異分析[J].石河子大學學報（自然科學版），2012，30（3）：265-270.

[21] 趙曉燕，張新建，任 艷，等.濟南53種淡水藻的形態(tài)鑒定及總脂含量測定[J].安徽農業(yè)科學，2010，38（23）：12432-12433.

[22] 邵聰聰，劉 瑛，DAROCH M，等.深圳灣水域微藻的分離及分子生物學鑒定[J].廣東農業(yè)科學，2013，40（13）：135-138.

[23] 李珍寧.淡水藻的分離純化與培養(yǎng)及藻體內生化成分的測定研究[D].武漢：華中農業(yè)大學，2010.

[24] 周應科.縉云山黛湖硅藻綠藻的分離培養(yǎng)及其初步鑒定[D].重慶：西南大學，2008.

[25] 薛林貴，常思靜，石小霞，等.青海湖藍藻的分離與鑒定[J].廣東農業(yè)科學，2010，37（10）：4-7.

[26] 許 瑾，張成武，李愛芬，等.華南地區(qū)淡水產油微藻藻株的分離與篩選[J].可再生能源，2011，29（1）：66-71.

[27] 郝宗娣，劉平懷，楊 勛，等.熱帶淡水產油微藻的分離篩選與鑒定[J].水生生物學報，2013，37（3）：547-552.