摘要：石油污染越來越多的在開采、運輸、加工等過程中進入環(huán)境，并在環(huán)境中長期積累且很難被消除，對生態(tài)系統(tǒng)及人類健康造成嚴重危害。研究證明，對石油污染采取微生物修復是行之有效和環(huán)境友好的，因此對微生物降解菌的研究成為當前熱點。介紹了石油污染現(xiàn)狀、微生物降解技術及途徑、微生物降解的影響因素等方面，總結微生物修復的研究進展，最后提出研究中存在的不足，并對新技術的運用以及對學科之間的交叉滲透提出了建議。

關鍵詞：石油污染；石油烴降解菌；微生物修復；微生物代謝機理

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）17-4353-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.17.001

Abstract： The oil pollution was increasingly released and long accumulated in the environment during petroleum mining， transportation， processing， etc.， which can be hard to be eliminated and had caused serious damages to the ecosystem and human health. Using microbial remediation to repair oil pollution have proved effective and environmentally friendly， thus microbial degradation bacteria became a hot spot to research today. Based on introduction of the oil pollution status， the techniques， pathways and influence factors of microbial degradation， the current research advances of microbial remediation were summarized， and the deficiencies existing in research were proposed， then some advices for the utilization of new technology and the cross penetration between disciplines were put forward.

Key words： petroleum pollution； hydrocarbon degrading bacteria； microbial remediation； mechanism of microbial metabolism

1 石油污染及其危害

土壤是人類賴以生存與發(fā)展的重要自然資源，但近年來石油對自然環(huán)境的污染越來越嚴重。石油污染主要來源于油田勘探、油氣開采和石油產(chǎn)品在運輸加工中發(fā)生的泄漏等事故[1]。據(jù)統(tǒng)計，中國的石化企業(yè)每年落地油產(chǎn)量達700萬t，煉油區(qū)的井口周圍是最嚴重污染區(qū)，而且污染范圍會隨著污染物積累以及雨水傳播而不斷擴大[2]。

在過去的10年中PAHs（Polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）作為分布最廣的一類多環(huán)芳烴類有機化合物，因其具有疏水親酯性、持久污染性、頑固穩(wěn)定性、誘變和致癌性等而備受關注[3]。美國環(huán)境保護署已將其中的16種多環(huán)芳烴列為優(yōu)先考慮污染物[4]。多環(huán)芳烴污染物在生態(tài)系統(tǒng)中長期積累會造成嚴重危害，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：會破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能，降低土壤的透氣性和滲水性，使土壤板結、肥力下降；會在水體表面形成油膜，造成水生生物的大量缺氧[5]；可直接進入并污染地下水源，影響居民用水和農(nóng)業(yè)灌溉[6]；可通過食物鏈的生物富集作用，嚴重危害人類健康。

2 石油烴類的微生物修復技術

2.1 石油成分

石油是一種具有特殊氣味和顏色的可燃性的油質液體物質，其主要成分是碳氫構成的烴類化合物，烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴約占石油成分的95%以上[7]。煤油、苯、汽油、石蠟和瀝青等都是由石油加工而來的。多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）是指具有兩個或兩個以上苯環(huán)的一類碳氫化合物，芳烴家族包括150多種成員，例如萘、蒽、菲、芘等，廣泛存在于石油中，難以被降解[8-11]。

2.2 降解石油烴類的微生物菌群

由于微生物具有強大的適應性、快速的繁殖能力、高效的新陳代謝能力，使得它們在治理PAHs污染中擔任著非常重要的角色[12]。自然界中廣泛存在著能降解石油的微生物種類，已發(fā)現(xiàn)的就有100多屬200多種，主要是細菌（假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等）、真菌（曲霉菌、青霉菌等）、放線菌（線菌屬、諾卡氏菌屬等）、酵母等。一般認為，細菌比其他菌屬的石油降解效果好[11]。Festa等[13]從一個長期受污染的土壤中獲得復合菲降解菌體（CON-Phe），通過檢測得到了鞘脂單胞菌屬（Sphingomonadaceae）、腸桿菌屬和假單胞菌屬。Kanaji等[10]從原油污染土壤中分離出來了一種能降解菲的新型菌株，被鑒定為假單胞菌sp.USTB-RU。路薇等[11]從石油污染土壤中分離獲得一株能夠以熒蒽為惟一碳源和能源而生長良好的菌株，鑒定其為銅綠假單胞菌屬，并命名為DN1。

2.3 石油烴類的微生物修復技術

生物修復是一種利用生物組織幫助消除被污染領域中的有害物質的技術，按修復對象的不同可分為植物修復、動物修復及微生物修復。微生物修復是指利用微生物的作用將土壤中有害有機污染物降解為無害小分子物質的過程[12]。微生物修復技術應用最為廣泛、效果最好，已被證實能有效減少或消除環(huán)境中PAHS污染物[13]。1972年生物修復技術首次被用來清除美國賓夕尼亞洲管線泄漏的汽油。1989年微生物修復技術被首次大規(guī)模在大面積被原油污染的美國阿拉斯加海域上使用[12]。2010年4月，墨西哥灣超過2億加侖的原油泄漏，一種嗜油菌在4個月內(nèi)消除了漏油的75%[14]。2010年7月，23t石油降解微生物被投放至大連灣輸油管道爆炸現(xiàn)場進行初期清理，這是有史以來最大規(guī)模地投施微生物降解石油污染并取得了良好效果的嘗試[15]。

微生物修復技術主要分為原位生物修復法和異位生物修復法。

2.3.1 原位修復技術 原位生物修復技術（In-situ bioremediation）是指被污染的土壤或水體不經(jīng)過搬動和轉移，直接在原地被生物法修復[16，17]。原位修復技術的成本相比異位修復要小得多，所以發(fā)展原位修復技術成為近年來的研究熱點。原位修復技術包括生物強化法、生物通風法等[15]。

生物強化法旨在提高微生物菌群的活性和強度。既可以是對污染地的土著降解菌進行生物培養(yǎng)，定期向污染土壤中加入N、P等營養(yǎng)鹽和H2O2等，為土著菌群提供繁殖代謝的適宜條件，使土壤微生物通過代謝將污染物降解；也可以是投施外來菌法，實際操作時，多在污染土地中打井渠，將配好的外來菌種溶液注入，使其充分進入污染土壤中，使其能更好更快地降解石油污染[18]。

生物通風法是指運用外力強行將空氣或者氧氣注入到污染土壤中，將揮發(fā)性有機污染物從土壤中解吸到空氣流中，引至地面上進行處理的原位土壤修復技術，氣流還能增加土壤中的物質交換及微生物的代謝，從而加速對石油烴類的降解[19]。此技術結合了土壤通風的物理過程和增強的生物降解過程，已成為一種應用廣泛的革新性原位修復技術。1997年Patrick等[20]在一個燃油污染現(xiàn)場運用了生物通風技術進行處理，并取得了良好效果。

2.3.2 異位修復技術 異位生物修復技術（On-situ bioremediation）則是指將被污染的環(huán)境中的污染土壤或水體運輸轉移到其他地方，再在專門場地上使用生物修復或其他方式將污染物轉化為無毒無害物質的過程[21]。異位生物修復方法有：堆肥法，即在適當條件下，將污染基質和適合的材料（木屑鋸末等）混合放置成堆，使污染基質中的微生物能大量繁殖并通過分解代謝將其轉化為穩(wěn)定腐殖質；土壤耕作，將污染基質轉移到特定的環(huán)境中，平衡其中的礦物元素含量、酸堿度及濕度等，并對其進行周期性的灌溉、翻土及施肥，使污染物被轉化降解，關月明等[22]發(fā)現(xiàn)，通過向地耕法污染基質中加入高效降解菌能很大程度上提高降解效率；生物反應器即一些可以移動的污染基質單元，分為活性污泥類和生物膜類兩種，生物反應器法是將污染土壤移至專門的反應器中，使污染土壤與合適的微生物、水、營養(yǎng)鹽添加物以及表面活性劑等充分混合，并一直將微生物降解條件調(diào)至最佳狀態(tài)，使污染物的降解速率和效率保持最高狀態(tài)。此反應器具有靈活性、易控性和高效性，是處理高濃度重油污染地的有效方法。孫玉華等[23]在處理石化企業(yè)污水中運用了膜生物反應器的處理方法，效果良好。周立輝等[24]使用撬裝式生物反應器對長慶油田石油污泥進行處理，證明此種生物反應器可以使微生物快速高效的降解石油污染物。

2.3.3 其他處理技術 植物-微生物修復技術，此技術是通過植物的生長代謝過程，直接或間接地將土壤有機污染物進行分離降解或者吸收轉化，植物根部的微生物降解菌也可分離降解有機污染物，二者可協(xié)同調(diào)節(jié)，共同清除污染物質[25]。史德青等[26]運用植物-微生物修復技術對濱一污水站的石油污泥進行處理，試驗表明，120 d后石油降解率可達34.09%，微生物數(shù)量明顯增加且代謝功能多樣性增強。

物化吸附-微生物降解技術。稠油中含有的膠質和瀝青質約占31%，是石油組分中最難被降解的有機物，被喻為微生物降解稠油的瓶頸。物化吸附-微生物降解技術，就是用活性焦、活性炭等的吸附作用，將這些物質吸附提出再利用微生物降解剩下的油污染物，能較大程度提高微生物降解效率。仝坤等[27]分析了活性焦吸附-生物降解去除稠油污染物中溶解性有機碳的歷程，結果表明此技術能有效去除油污中難以被降解的有機污染物。

電動-微生物耦合技術，通過外加電場影響微生物降解菌的生長特性，以提高降解菌降解石油污染物的能力。此技術被認為是目前石油降解修復領域中最具前景的技術之一[28]。孫先鋒等[29]利用外加電場對兩種石油降解菌進行了研究，試驗表明電場強度對降解菌的生長特性有一定影響，電場作用下的石油降解率都有很大提高。

2.4 微生物降解石油烴類的影響因素

一般將微生物修復的影響因素主要分為三種：環(huán)境因素、生物因素以及石油烴性質。

2.4.1 環(huán)境因素 環(huán)境因素包括溫度、水分、營養(yǎng)物質的供給、電子受體、pH值等。試驗表明，嘗試對某些環(huán)境條件進行改善優(yōu)化，烴類的生物降解速度就會大幅度提高[30-37]。

溫度對微生物降解的影響機理主要來自兩方面：一是溫度增加在一定程度上提高解吸速率常數(shù)和分配系數(shù)，從而提高被降解底物的生物有效性[35]；二是在一定的范圍內(nèi)，適當增加溫度可提高微生物的繁殖能力及其降解酶的活性，從而提高微生物的降解速率[37-45]。

微生物的生長繁殖尤其需要大量碳、氧、氮、磷、氫等營養(yǎng)元素。生物學家Zobell[46]曾在研究海洋細菌對原油和潤滑油降解過程中，適當添加了氮和磷營養(yǎng)鹽，結果發(fā)現(xiàn)其降解速率明顯升高。

微生物降解石油烴類的過程中，氧化分解所需電子受體的種類和濃度極大地影響著石油的降解速度。有氧環(huán)境中氧是僅有的或優(yōu)先的電子受體[36]；厭氧環(huán)境中，硝酸根離子、硫酸根離子、鐵離子及有機物分解的中間產(chǎn)物都可作為電子受體[43]。

每一種微生物都有其適應的pH值范圍，pH值過高或過低都會直接影響微生物降解酶的產(chǎn)生分泌及酶活性，進而影響菌群的生長繁殖及代謝過程[34]。

2.4.2 生物因素 環(huán)境中的菌種組成和比例對污染物的降解效果具有決定性作用。不同的降解菌對不同石油烴類的降解能力不同，自定義復合菌群對污染地的降解效果也許比單一菌種的降解效果要好得多。所以當污染地的土著微生物不能有效地降解石油污染，就會向污染土壤中添加相應的高適應性、高效能的外源菌種或菌群以提高微生物修復效率[25]。

2.4.3 石油烴性質 石油中的飽和烴、芳香烴、膠質和瀝青質等的含量和比例的不同使得每一種烴類的降解難易程度都不一樣[12]。污染地石油成分組成比例的不同會影響微生物對其中烴組分的降解能力。其中，低硫、高飽和烴的粗油最易降解，而高硫、高芳香族烴類化合物的純油最難降解[36]。蘇榮國等[40]從原油污染的土壤中篩選能降解多環(huán)芳烴的復合菌株，試驗發(fā)現(xiàn)，三環(huán)芳烴較四環(huán)芳烴易降解，五環(huán)的螢蒽類可被降解，瀝青質通過共氧化方式被也能被降解。

3 石油烴類的微生物降解途徑

3.1 石油烴類的有氧降解

好氧微生物和兼性微生物降解烴類污染物的代謝途徑需要分子氧的參與，如果氧氣含量不足，降解速度就會減緩，微生物的生長繁殖都會受到影響[12]。微生物通過有氧降解過程將多環(huán)芳烴化合物轉化為CO2和H2O，烴類的氫受體首先與氧結合為羥基生成醇，羥基經(jīng)脫氫酶氧化為醛基形成醛，醛基繼續(xù)被氧化為羧基形成脂肪酸或者酮，或者生成三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，再經(jīng)過一系列反應進入三羧酸循環(huán)，并最終分解成CO2和H2O[35]。

下面介紹幾種較常見的烴類化合物的降解途徑。

飽和烴包括正構烷烴、支鏈烷烴和環(huán)烷烴[2]。微生物先將烷烴末端H氧化為醇基，進一步氧化為醛基，最后氧化為羧基，進入三羧酸循環(huán)[38]。環(huán)烷烴首先被氧化為醇，再經(jīng)一些列反應生成二酸[39]。

苯環(huán)在雙加氧酶的作用下被氧化為順苯二氫二醇，進一步被氧化為鄰苯二酚，鄰苯二酚的氧化產(chǎn)物因切割方式不同而不同。鄰位切割產(chǎn)物含6個碳原子，間位切割產(chǎn)物含5個碳原子，但最后都會進入三羧酸循環(huán)[7，38]。

萘則首先被氧化為順二氫二醇萘，經(jīng)過第一次氧化開環(huán)生成1，2-二羥基萘，并進一步氧化反應生成二氫化苯并吡喃二羧酸鹽，再與氧結合生成二羥基苯亞甲基丙酮酸并進一步生成鄰苯二酚，再經(jīng)過第二次開環(huán)形成二羥基有機硅烷半醛，最后被降解成丙酮酸鹽和乙醛[40]。

聯(lián)苯苯環(huán)上1～10的位置上的氫原子均可被氯原子取代，可形成200多種多氯聯(lián)苯。惡臭假單胞菌LB400可分解最多達6個氯所取代的多氯聯(lián)苯，例如聯(lián)苯的降解，首先是聯(lián)苯的2，3號被氧化而形成2，3-二氫二醇聯(lián)苯，再經(jīng)過開環(huán)形成2-羥基-6-酮基-6-苯基-2，3-己二烯（HOPDA）并最終降解成苯甲酸[17，41]。

一般而言，不同的微生物及不同的化合物，都會影響有氧降解反應的初始位置。降解同種化合物的微生物種類不同，代謝途徑也會有差異。例如惡臭假單胞菌mt-2降解甲苯，甲苯的甲基首先被氧化為醇基，然后被氧化為醛基，進一步氧化形成羧基，再經(jīng)過一系列反應形成中間代謝產(chǎn)物鄰苯二酚并被最終分解為小分子物質。而惡臭假單胞菌F1降解甲苯的過程中，甲苯在雙加氧酶及氧分子及NADH的作用下生成順甲苯二氫二醇，進一步氧化形成3-甲基鄰苯二酚并最終進入三羧酸循環(huán)[41]。

3.2 石油烴類的厭氧降解

厭氧降解是指一些兼性厭氧微生物或者厭氧微生物在無氧環(huán)境中，通過氧化性較強的物質，例如硝酸鹽、硫酸鹽、三價鐵離子等，將有機物降解代謝的過程[38]。厭氧降解過程中，有機物被轉化為CH4、NH3等，此過程轉化速率慢、需要時間長。有研究表明，厭氧條件下經(jīng)培養(yǎng)233 d，烴類化合物的降解量不到5%。且厭氧生物降解對環(huán)境要求較嚴格，pH值需控制在6.7～7.4之間[38]。

4 石油烴微生物降解的研究進展

石油烴微生物降解的研究主要集中在以下幾方面。

一是對自然界中存在的降解效果好的微生物進行分離鑒定和開發(fā)利用。Elpiniki等[18]研究發(fā)現(xiàn)不同油種的海灣細菌復合菌群的群落結構和功能不盡相同。1999年Lebeault等研究了混合菌群降解飽和烷烴的過程[12]。2007年饒佳家等[41]從被污染土壤中分離出了一株能以甲苯為惟一碳源和能源的假單胞菌屬的菌株，試驗得到了這種菌株降解甲苯的最佳條件，并對其代謝途徑進行了初步研究。2011年唐杰等[30]采用傳統(tǒng)分離法分離出了不同土壤類型及不同土壤深度的微生物，并對微生物的數(shù)量、菌群結構及多樣性等進行了研究，得出土壤類型對菌群結構的影響比土壤深度對其的影響大。2011年海軍醫(yī)學研究所與復旦大學合作，在石油污染海水中成功分離培養(yǎng)出高效石油降解菌群并制備了菌劑。2013年Festa等[13]從一個長期受污染的土壤中獲得復合菲降解菌體（CON-Phe），這個復合降解菌體在含有1-羥基-2-萘甲酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，能降解掉培養(yǎng)基中58%的菲。2015年路薇等[11]從石油污染土壤中分離出了一株降解熒蒽菌株，鑒定為銅綠假單胞菌。

二是基于前人的研究，對降解菌的代謝途徑、代謝產(chǎn)物進行研究，并利用生物強化、生物添加等手段，增強降解菌的降解速率和適應性。1964年生物學家Zobell[46]在研究海洋細菌降解原油和潤滑油過程中，計算測出了氮磷營養(yǎng)鹽添加后石油烴的降解速率。2001年蘇榮國等[40]對微生物降解烷烴的途徑、機理等進行了分析，并總結了非生物因素比如溫度等對降解作用的影響。2008年馬強等[12]對微生物修復方法進行了討論，并對生物修復過程中的影響因素如電子受體、溫度、pH等進行了詳細介紹。2003年Rahman等[47]發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂對污泥中的正烷烴的降解具有促進作用。2013年宋華[17]對石油烴類污染物的生物處理技術進行了較全面的介紹，對石油烴降解的微生物種類及降解機理等進行了研究分析。

三是利用基因工程技術，在安全的前提下，對降解菌進行基因誘變及遺傳改造，造就一些自然界尚未發(fā)現(xiàn)的超級降解菌。Chapracarty等將4種假單胞菌屬的降解性質粒結合到一個菌株中，得到了一株能同時降解多種烴類的“超級細菌”，降解速率非?？?，是天然菌的好幾倍，這株菌獲得了專利權。2004年Wang等[48]在將棉花的分泌性漆酶于擬南芥中過量表達后，發(fā)現(xiàn)植物對酚類化合物的抗性明顯增強。此種轉基因植物在修復石油污染土壤的過程中能與高效降解菌或基因工程菌等發(fā)揮協(xié)同作用，加速烴類化合物的降解。2006年張小凡等[49]在實驗室構建了一株轉基因工程菌，且研究發(fā)現(xiàn)該轉基因工程菌能在30 d內(nèi)降解一半的菲。2014年謝云[50]利用轉基因技術篩選出了一株轉基因工程菌，命名為不動桿菌屬BS3-C230，且發(fā)現(xiàn)BS3-C230工程菌的底物降解特異性廣泛，具有較高酶活性和良好穩(wěn)定性，能同時高效降解原油中的烷烴和芳香烴組分。

四是注重各學科各技術的聯(lián)合修復。眾多研究表明，將生物化學物理等除污工藝相結合，互補協(xié)作，能達到非常理想的效果。2007年吳應琴[51]系統(tǒng)研究了增溶劑-腐殖酸對難溶有機污染物多環(huán)芳烴的增溶作用及機理，結果發(fā)現(xiàn)腐殖酸及皂角苷大大縮短了微生物降解蒽的時間，同時發(fā)現(xiàn)腐殖酸的濃度、蒽的初始濃度均影響著蒽的微生物降解速率。2011年Nora等[52]在原位化學氧化技術和微生物修復技術的聯(lián)合使用方面，認為兩者結合能更好地修復石油污染地。2013年章慧[53]通過試驗研究了菲降解菌產(chǎn)生的表面活性劑增強電動力學修復的效果，結果表明假單胞菌MZ01產(chǎn)生的表面活性劑協(xié)同鞘氨醇菌GY2B對電動力去除污土中菲時具有高效增強的效果，且電動力對土壤中菲降解菌的生長具有一定的促進作用。2015年吳昊等[54]通過對活化過硫酸鈉原位修復石油污染土壤的研究發(fā)現(xiàn)，原位化學氧化與微生物修復聯(lián)用，在處理石油污染時成本更低，效果更好，可行性高。

5 展望

雖然在微生物修復領域已經(jīng)取得了一些成果，但仍有許多問題需要重視，如沒有集中對高效降解菌進行篩選和鑒定，對于極端環(huán)境中降解菌的研究不夠深入，在創(chuàng)建耐有機溶劑的微生物方面的研究還不是很多，同時要將試驗研究成果完美高效地運用到實際操作中去。

在今后的研究中應加強分子生物學、物理化學等相關學科的交叉滲透，從各學科中找結合點，互補互助，積極嘗試新技術、新方法，尤其在分子雜交整合技術、質粒基因轉接技術、DNA改組技術、分子物理與生物工程技術等方面的研究和實際應用還需加強[55]，各學科的交叉聯(lián)合研究不夠深入是因為對于同時精通物理、化學和生物的石油修復工藝的人才比較缺乏，所以建議加強各學術間的聯(lián)合培養(yǎng)和共同合作，組織各學科人才積極廣泛的交流和探討，加強石油污染的聯(lián)合修復和積極推廣。2009年林學政等[56]從北極海洋石油污染沉積物中篩選出來的降解菌中含有發(fā)光桿菌屬，這說明形成既能高效降解石油污染又可隨時以發(fā)光度來顯示污染地毒性變化的石油降解菌是有可能的。就電場電流對微生物降解石油的積極作用而言，也許通過轉基因技術開發(fā)出能產(chǎn)生電流的石油降解菌，這樣不僅能提高降解速率，也可大大節(jié)約修復成本，而這方面的研究還鮮見相關報道。

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