冷容，范永紅，李娟，楊仕偉，劉雪姣，趙守忠

（重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，涪陵，408000）

寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系的選育與主要性狀鑒定

冷容，范永紅，李娟，楊仕偉，劉雪姣，趙守忠

（重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，涪陵，408000）

以莖瘤芥不育系JL154-5A為不育源，寬柄芥優(yōu)良自交系為轉(zhuǎn)育父本，通過雜交和連續(xù)回交的方法選育出4個具有代表性、不育性狀穩(wěn)定、經(jīng)濟性狀良好的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系DJA、K6A、HK-1A、K46A，對不育系的主要特征和農(nóng)藝性狀表現(xiàn)進行了調(diào)查，并用SSR分子標(biāo)記進行了系統(tǒng)觀察鑒定，確證是一批可以利用的寬柄芥優(yōu)良胞質(zhì)雄性不育系。

寬柄芥；胞質(zhì)雄性不育系；選育；性狀；鑒定

寬柄芥（Brassica junceavar.latipa）屬芥菜類蔬菜的一個變種[1]，俗稱筍殼菜、青菜、寬板菜等，是聞名于世的四川酸（泡）菜的主要原料，也是市民鮮食或農(nóng)戶常作飼用的蔬菜種類之一。因其葉柄及中肋寬大肥厚、質(zhì)地脆嫩，且有一定辛辣味，煮湯或涮火鍋味道尤美，具去熱、御風(fēng)濕、利五臟、補天陽、促進血液循環(huán)之功效[2]，所以頗受世人喜愛。但目前，國內(nèi)外還未見有關(guān)寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系的選育與研究的報道，限制了該作物雜種優(yōu)勢利用工作的開展。本項研究從2010年8月開始，利用重慶市渝東南農(nóng)科院范永紅等[3]培育出的莖瘤芥（榨菜）胞質(zhì)雄性不育系JL154-5A為不育源，以寬柄芥中的優(yōu)良品種為轉(zhuǎn)育父本，通過雜交和連續(xù)回交等方式，培育出4個具代表性、不育性狀穩(wěn)定、經(jīng)濟性狀良好且各具特色的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系，為較大規(guī)模開展寬柄芥雜交一代新品種的選育、實現(xiàn)“三系”配套，進而為提高酸（泡）菜原料作物的產(chǎn)量及品質(zhì)提供了條件和可能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

①不育源 重慶市渝東南農(nóng)科院范永紅等[3]培育出的莖瘤芥胞質(zhì)雄性不育系JL154-5A。

②轉(zhuǎn)育父本 2011年3月，在田間系統(tǒng)鑒定并確證JL154-5A不育性狀的基礎(chǔ)上，選擇4個具代表性的不同性狀、不同生態(tài)類型、不同熟性的寬柄芥優(yōu)良自交系（DJ、K6、HK-1、K46）作轉(zhuǎn)育父本。

③觀察鑒定的不育系及其保持系 DJA、K6A、HK-1A、K46A和DJB、K6B、HK-1B、K46B。

④SSR分子標(biāo)記鑒定材料 選取經(jīng)回交7代且特征及性狀表現(xiàn)穩(wěn)定的各不育系及對應(yīng)保持系的幼嫩葉片組織。

1.2 試驗方法

①以莖瘤芥不育系JL154-5A作母本，寬柄芥優(yōu)良自交系作父本進行常規(guī)雜交，后代擇取典型單株與父本連續(xù)回交8代，選育不育性狀穩(wěn)定、經(jīng)濟性狀良好的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系。

②在雜交和各回交世代，花期進行單株套袋自交，考察其自花授粉的結(jié)實性。

③對回交7代（不育系）及其父本（保持系），隨機抽選3～5株典型單株在盛花期分別觀察測定花冠、雄蕊、雌蕊和蜜腺的形狀及大小，并對其開花特性進行系統(tǒng)觀察。

④對回交7代（不育系）及其父本（保持系）的花粉，用0.5%的氯化三苯四氮唑（TTC）液在38℃恒溫下染色50 min，測定其生活力。

⑤對不育系和保特系，在重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院（海拔273 m）進行正季種植，常規(guī)管理，各材料現(xiàn)蕾時，每材料選取5株典型單株，按《芥菜類蔬菜田間試驗觀察記載項目及標(biāo)準(zhǔn)》，系統(tǒng)觀察其形態(tài)特征和主要性狀表現(xiàn)。

⑥不育系SSR分子標(biāo)記鑒定，選用十字花科蕓薹屬網(wǎng)公布的600對SSR引物，均由生工生物工程有限公司代理合成，并采用CTAB法提取全基因組DNA，然后分別進行PCR反應(yīng)、電泳及銀染等。

2 結(jié)果與分析

2.1 寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系的選育

2010年10月將莖瘤芥不育系JL154-5A在重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗地進行播種育苗移栽，2011年3月在開花期對不育系花器官構(gòu)造、不育性狀表現(xiàn)進行了觀察鑒定，確證為不育性徹底、性狀穩(wěn)定的不育系后，以莖瘤芥不育系JL154-5A作母本，選取4個優(yōu)良寬柄芥自交系（每自交系3株單株），與之分別成對雜交，得到F1代。2011年8月夏繁，從F1代中選擇3株典型單株作母本，用上述對應(yīng)的自交系回交，同時母本單株自交測定其結(jié)實性。連續(xù)4 a（2011-2014年）的春季和夏季，繼續(xù)用寬柄芥自交系作輪回父本與之回交，同時母本單株套袋自交，測定其育性。到2015年5月選育出了不育度達100、不育株率為100%，經(jīng)濟性狀良好且穩(wěn)定的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系及保持系4個。

2.2 寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系形態(tài)特征及主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

2014年9月至2015年2月，對已經(jīng)完成回交轉(zhuǎn)育并經(jīng)育性鑒定達不育系標(biāo)準(zhǔn)的4個不育系和保持系，集中在渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院同一生態(tài)條件下栽培，對其形態(tài)特征和主要農(nóng)藝性狀進行了系統(tǒng)觀察鑒定（表1）。

經(jīng)連續(xù)7代回交轉(zhuǎn)育后的寬柄不育株系，在葉形、葉緣、中脈顏色、葉片刺毛蠟粉、單株有效葉片數(shù)等方面，均與對應(yīng)的保持系表現(xiàn)相同或相近，但在株高、開展度、單株鮮質(zhì)量、中肋寬及厚度等方面，與對應(yīng)的保持系有不同程度的差異，即不育系比對應(yīng)保持系的植株高2～4 cm，開展度大4～9 cm，單株鮮質(zhì)量大100～300 g等，同時，不育系的營養(yǎng)生長期比對應(yīng)保持系長3～5 d。

2.3 寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系花器官特征及性狀表現(xiàn)

2014年3～5月，在繼續(xù)進行寬柄芥不育系回交轉(zhuǎn)育的同時，對不育系和相應(yīng)保持系的花器官形態(tài)特征、開花特性及花期變化進行了系統(tǒng)觀察（表2）。

①不育系的花器官特征 調(diào)查發(fā)現(xiàn)，保持系的花冠由4片花瓣組成，呈“十”字形，黃色或淺黃色，雄蕊6枚、4強2弱；雌蕊單生，柱頭表面多乳突，花藥和花絲的長度稍大于花柱的長度，花藥較飽滿；蜜腺發(fā)育良好，3～4個，圓形，綠色或淺綠色，個別深綠色。

經(jīng)連續(xù)回交7代轉(zhuǎn)育的寬柄芥不育系花器官與對應(yīng)的保持系相比較，在形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)上的差別為：盛花時不育系花瓣表現(xiàn)為半開或全開，呈不規(guī)則的“十”字形；每朵花雄蕊5～6枚，但花藥干癟、纖瘦，有棱或多棱；花絲比保持系短0.87～1.45 mm；雌蕊單生，柱頭表面多有乳突，子房外觀形態(tài)和大小與保持系基本相同；蜜腺發(fā)育良好，與對應(yīng)的保持系沒有明顯差異。

②不育系的開花特點 經(jīng)連續(xù)7代回交轉(zhuǎn)育的寬柄芥不育系，幾乎每朵花的柱頭在花蕾成熟之前就伸出蕾外2.1～3.1 mm，形成特殊的花柱異長期，此時人工授以正常的芥菜花粉能夠正常結(jié)實結(jié)籽，平均結(jié)實率達90%以上。柱頭外露2～3 d后，花瓣才全展開或半展開，呈不規(guī)則的“十”字形，再經(jīng)2～3 d花瓣脫落，柱頭表面變黑。而對應(yīng)的保持系花蕾沒有異長期，每個花蕾從萼片裂開到花瓣展開僅3～4 h就呈“十”字形，再經(jīng)1～2 d花瓣脫落。在植株的開花順序、每天的開花時間等方面，不育系與對應(yīng)的保持系沒有明顯的差別。

表2 寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系花器官特征及開花特點

③不育系的花期 與對應(yīng)的保持系相比，經(jīng)連續(xù)7代回交轉(zhuǎn)育的寬柄芥不育系的始花期一般推遲2～3 d，盛花期和終花期相應(yīng)推遲3～5 d，整個花期持續(xù)20～27 d，長的達29 d以上，即不育系的花期比保持系長5～6 d。

2.4 寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系的育性

①雄蕊的育性 a.自然生態(tài)氣候條件下的育性。2011-2015年，在對寬柄芥雄性不育株系的每個世代進行回交轉(zhuǎn)育的同時，對中選單株進行了套袋自交測定，除發(fā)現(xiàn)個別材料的回交世代株系有單株自交結(jié)實指數(shù)≥1（已淘汰）的情況以外，未發(fā)現(xiàn)有自交結(jié)實現(xiàn)象。2014-2015年，又對經(jīng)回交6代后的DJA、K6A、HK-1A、K46A 4個具代表性的不育系及對應(yīng)保持系的單株自交結(jié)實情況進行了系統(tǒng)考察，4個不育株系春季及夏季的自交結(jié)實指數(shù)均為0，表現(xiàn)為高度的不育且育性穩(wěn)定；而保持系在不同的季節(jié)結(jié)實率差異較大，一般是春季結(jié)實率高于夏季，這可能與夏季氣溫較高、植株營養(yǎng)體小有關(guān)。

b.不育系花粉的生活力。2014年3月，對DJA、K6A、HK-1A、K46A 4個具代表性的不育系及對應(yīng)的保持系的花粉進行染色鏡檢觀察。結(jié)果表明，不育系的花粉粒均不著色，且多數(shù)花粉呈不規(guī)則圓球形、透明，部分花粉粒還有開裂、缺失現(xiàn)象，花粉粒邊沿呈乳突狀（圖1）；而保持系的花粉著色率為85%～96%，表現(xiàn)為有生活力的花粉占絕大多數(shù)，花粉粒的形狀多為圓球形或橢圓形，不透明、飽滿。

②雌蕊的育性 2011-2015年，每個世代的回交轉(zhuǎn)育結(jié)果表明，寬柄芥不育系（或不育單株）的雌蕊柱頭在人工授粉后，不但能結(jié)實結(jié)籽，而且后代生長發(fā)育正常，不存在生殖隔離。同時，觀察不育系雌蕊的形態(tài)特征，均未發(fā)現(xiàn)與對應(yīng)的保持系（或回交父本材料）有質(zhì)的差異。由此證明，寬柄芥雄性不育系的雌蕊育性是完全正常的。

圖1 不育系DJA和保持系DJB花粉生活力測定

2.5 寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系SSR分子標(biāo)記多態(tài)性鑒定

2016年1～4月，對培育出的4個具代表性的寬柄芥雄性不育系及保持系 （DJA和DJB、K6A和K6B、HK-1A和HK-1B、K46A和 K46B）進行了SSR分子標(biāo)記篩選鑒定。圖2結(jié)果表明，引物KBJ416（F：5'-TATCAACAGAAACGCACCGAG-3'；R：5'-CCACTTGTTTCTCTCTCTAG-3'）在不育系及保持系中擴增出的條帶呈多態(tài)性，且在不育源和經(jīng)連續(xù)回交轉(zhuǎn)育的不同寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系上擴增的條帶完全一致，而與對應(yīng)的寬柄芥保持系擴增出的帶型表現(xiàn)有顯著差異。

3 結(jié)論與討論

本研究以莖瘤芥胞質(zhì)雄性不育系JL154A為不育源，通過雜交和連續(xù)回交轉(zhuǎn)育而成的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系，不但不育性徹底，不育性狀穩(wěn)定，而且育性不因環(huán)境條件的改變而變化，另外，其經(jīng)濟性狀良好，與對應(yīng)的寬柄芥保持系無質(zhì)的差別，是一批可利用的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系，為大規(guī)模開展寬柄芥雜種優(yōu)勢的利用奠定了基礎(chǔ)和提供了可能。

圖2 引物KBJ416在寬柄芥不育系及保持系中多態(tài)性分布

陳竹君等[4]對榨菜雄性不育雄蕊形態(tài)的分類和遺傳表現(xiàn)的研究結(jié)果及范永紅等[3]對莖瘤芥胞質(zhì)雄性不育系的定義證明，芥菜（莖瘤芥）胞質(zhì)雄性不育類型在不同環(huán)境條件下表現(xiàn)育性穩(wěn)定，不因環(huán)境條件的變化而發(fā)生育性的改變。據(jù)此認為，DJA、K6A、K46A、HK-1A 4個具代表性的寬柄芥雄性不育應(yīng)屬胞質(zhì)互作不育類型，其不育性狀可能是由細胞核內(nèi)的不育基因和不育細胞質(zhì)共同作用的結(jié)果。因為本研究所選育的寬柄芥雄性不育系的不育源為莖瘤芥JL154-5A，并經(jīng)過4個年度不同生長季（春季和夏季）的回交轉(zhuǎn)育證明，每個回交世代單株套袋自交結(jié)實指數(shù)均為0，后代無可育株出現(xiàn)，該不育系的不育性狀非常穩(wěn)定，不育株率達100%，表現(xiàn)為高度不育。

本研究篩選的SSR引物KBJ416，可成功地將寬柄芥不育系及保持系區(qū)分開來，且不育源的條帶和不育系的條帶表現(xiàn)完全一致，表明引物KBJ416與寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系的不育源（莖瘤芥不育系JL154-5A）基因相連鎖，可以用來輔助進行不育系株系純度鑒定和為該類不育系的保存與保護提供分子標(biāo)記手段，也為寬柄芥不育基因分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)體系的建立奠定了基礎(chǔ)。

[1]劉佩瑛.中國芥菜[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1994：46-56.

[2]李時珍.本草綱目.白話精譯[M].北京：科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

[3]范永紅，周光凡，陳材林.莖瘤芥胞質(zhì)雄性不育系的選育及其主要性狀調(diào)查[J].中國蔬菜，2001（5）：4-7.

[4]陳竹君，張明方，汪炳良，等.榨菜胞質(zhì)雄性不育系及其農(nóng)藝性狀的研究[J].園藝學(xué)報，1995，22（1）：40-46.

Breeding ofBrassica junceaCMS and Identification of Main Characteristics

LENG Rong,FAN Yonghong,LI Juan,YANG Shiwei,LIU Xuejiao,ZHAO Shouzhong
(Southeast of Chongqing Academy of Agricultural Sciences,Peiling 408000)

Using the mustard male sterile lines JL154-5A as sterility source,and fine cultivars ofBrassica juncea(inbred lines)as male parents,fourB.junceaCMS,DJA,K6A,HK-1A and K46A,with representativeness,stable sterile characteristic and fine economic characteristic,were obtained through cross hybridizing and continuous back cross.This paper systematically observed and identified the main characteristics,agronomic trait expression and SSR molecular marker of the male sterile lines,and confirmed that a lot of goodB.junceaCMS could be utilized in future actual production.

Brassica juncea;Cytoplasm male sterile lines(CMS);Breeding;Characteristic;Identification

S637.2

A

1001-3547（2016）22-0049-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2016.22.018

重慶市涪陵區(qū)科技項目（FLKJ.2012ABB1078）；重慶市應(yīng)用開發(fā)重點科技項目（cstc2014yykfB80005）

冷容（1975-），女，本科，高級農(nóng)藝師，專業(yè)方向為芥菜遺傳育

種與栽培，電話：15095820339，E-mail：fllengrong@163.com

2016-09-23