李艷萍，曾煦欣，黃珠愛，譚 珍，吳劍峰*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系，廣東 佛山 528000；2.佛山馮了性藥業(yè)有限公司，廣東 佛山 528000；3.佛山市藥學(xué)會(huì)，廣東 佛山 528000）

HPLC法檢測(cè)不同劑量60Co輻照對(duì)蛇膽陳皮散的影響

李艷萍1，曾煦欣1，黃珠愛1，譚 珍2，吳劍峰1*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系，廣東 佛山 528000；2.佛山馮了性藥業(yè)有限公司，廣東 佛山 528000；3.佛山市藥學(xué)會(huì)，廣東 佛山 528000）

目的通過(guò)比較60Co輻照前后蛇膽陳皮散中主要成分橙皮苷的含量變化，考察不同輻照劑量對(duì)蛇膽陳皮散質(zhì)量的影響。方法采用高效液相色譜法，色譜柱Agilent ZorbaxSB-C18（4.6×150mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1％磷酸溶液（35:65），流速為1mL/min，柱溫為26℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為283nm，進(jìn)樣量20μL，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法為SPSS單因素分析。結(jié)果每g樣品計(jì)算，輻照劑量0、2、6和10kGy橙皮苷的量分別為43.37、42.32、35.93和42.43mg。結(jié)論實(shí)驗(yàn)輻照劑量下，橙皮苷含量均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。輻照劑量為2 kGy和10kGy的60Co輻照對(duì)蛇膽陳皮散中的橙皮苷的含量無(wú)影響，而輻照劑量為6kGy的60Co輻照可使蛇膽陳皮散中的橙皮苷的含量顯著減少。

HPLC法；60Co輻照；蛇膽陳皮散；橙皮苷

中藥制劑藥材組成種類多，成分復(fù)雜，原料來(lái)源廣泛，且在藥材加工和貯存的過(guò)程中易受到細(xì)菌污染，所以在保證用藥的有效性和安全性的前提下，若要獲取最大的經(jīng)濟(jì)效益，則必須結(jié)合藥物性質(zhì)合理選擇滅菌方法［1］。60Co輻照滅菌是一種冷滅菌法，主要機(jī)理為直接破壞細(xì)菌的遺傳物質(zhì)從而使細(xì)菌失去遺傳和合成蛋白質(zhì)的能力后致其死亡［2］。其特點(diǎn)為穿透力強(qiáng)、操作方便和殘留量低［3］，因此適用于含揮發(fā)油、不耐熱等中藥或中成藥的滅菌。本文主要利用HPLC檢測(cè)手段，測(cè)定60Co不同輻照劑量下蛇膽陳皮散中橙皮苷的含量，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析輻照劑量組之間的差異性，從而得到60Co滅菌法是否影響蛇膽陳皮散質(zhì)量的結(jié)論。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（1260型，美國(guó)Agilent）；電子天平（BS-110S，法國(guó)賽多利斯）；超聲波提取（AS5150B）；實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（密理博，ZTLH00005）；移液槍（上海求精生化試劑儀器有限公司）；蛇膽陳皮散由佛山馮了性藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)為B13007。橙皮苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110721-200613）；甲醇為色譜純，水為超純水；其他試劑均為分析純。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS軟件進(jìn)行。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇超聲溶解，用50％甲醇稀釋得對(duì)照品溶液（50μ g/m L）。進(jìn)樣前用0.45μ m微孔濾膜過(guò)濾。

2.2 供試品溶液的制備

分別取不同劑量60Co輻照（0，2，6，10kGy）的供試品約2.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50mL，稱定質(zhì)量，放置30min，至樣品粉末完全浸潤(rùn)，超聲處理30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量。濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液l mL，置50mL量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，有機(jī)微孔濾膜（0.45μ m）過(guò)濾，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（4.6×150mm，5μ m），流動(dòng)相為甲醇-0.1％磷酸溶液（35:65），流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)283nm，柱溫26℃，進(jìn)樣量20μ L，檢測(cè)時(shí)間30min。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

利用2.3項(xiàng)的色譜條件，得到橙皮苷對(duì)照品溶液（a）與蛇膽陳皮散供試品溶液（b）的色譜圖。結(jié)果見圖1。橙皮苷的出峰時(shí)間約為16.3min，對(duì)稱因子約為0.95，供試品中橙皮苷色譜峰與相鄰成分色譜峰的分離度較好，對(duì)照品與供試品中的橙皮苷色譜峰的理論塔數(shù)均大于2 000，證明此色譜條件的系統(tǒng)適用性良好。

圖1 橙皮苷色譜圖（1：橙皮苷色譜峰）

2.5 線性關(guān)系考察

將橙皮苷對(duì)照品溶液（50μ g/mL），按照一定比例用50％的甲醇將其稀釋到6個(gè)濃度，按照2.3項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得到橙皮苷的回歸方程為y= 45.27x-4.032 5，r=0.9997（n=6）。結(jié)果表明橙皮苷在8.4～50μ g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取橙皮苷對(duì)照品溶液，按照2.4項(xiàng)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，按照峰面積計(jì)算，得到RSD值為0.77％，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（B13007）樣品6份，按2.2項(xiàng)方法平行制備供試溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果橙皮苷的平均含量RSD（n=6）為1.2％，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的蛇膽陳皮散供試品溶液9份，分別精密加入已知含量的橙皮苷對(duì)照品溶液適量。按照2.3項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果如表1所示。供試品中橙皮苷的回收率在均在95％～105％的區(qū)間內(nèi)，平均回收率為100.29％，RSD為1.95％。表明方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 橙皮苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 含量測(cè)定

取2.2項(xiàng)制備的0，2，6，10kGy輻照劑量的供試品溶液進(jìn)行色譜檢測(cè)，平行操作3次，采用2.5項(xiàng)的回歸方程計(jì)算樣品中橙皮苷的含量。結(jié)果見表2。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS軟件的單因素方差分析（One way ANOVA）模塊分析2，6和10kGy輻照劑量組橙皮苷的含量與0kGy組的差異性，所得的P值見表3。

表2 不同輻照組中橙皮苷的含量

表3 各輻照劑量組橙皮苷的含量測(cè)定與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

由表3可知，輻照劑量0、2、6和10kGy的蛇膽陳皮散中橙皮苷含量分別為43.37、42.32、35.93、42.43mg/g，均符合2010版中國(guó)藥典的標(biāo)準(zhǔn)（不少于30.0mg/g）［4］。與0kGy組（43.37mg/g）比較，2 kGy與10kGy組的P值分別為0.102和0.144，均大于0.05，表明它們與空白組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即輻照劑量為2 kGy和10kGy對(duì)蛇膽陳皮散中橙皮苷的含量無(wú)明顯的影響。6kGy輻照劑量組的P值為0.000，小于0.01，表明它與空白組之間存在顯著性差異，即6kGy的輻照劑量可使橙皮苷的含量顯著減少，在本次試驗(yàn)中測(cè)得的下降率為17.15％。

5 討論

5.1 色譜條件的選擇

在2010版中國(guó)藥典中，檢測(cè)蛇膽陳皮散的橙皮苷成分色譜條件是流速1mL/min，柱溫26℃，流動(dòng)相（甲醇:0.1％磷酸溶液）的比例為40:60［5］。參照這個(gè)條件，首次實(shí)驗(yàn)中供試品的橙皮苷色譜峰與相鄰成分的色譜峰未能完全分離。在保持流速和柱溫不變的前提下，降低甲醇比例至35％，發(fā)現(xiàn)供試品的橙皮苷色譜峰與相鄰成分的色譜峰能完全分離，峰形和對(duì)稱因子等都較好，出峰時(shí)間為16min左右。為了加快出峰，嘗試升高柱溫到30℃，發(fā)現(xiàn)橙皮苷色譜峰保留時(shí)間提前不到1min。權(quán)衡比較后，最終采用2.4項(xiàng)的色譜條件，即流速為1mL/min，柱溫為26℃，流動(dòng)相（甲醇:0.1％磷酸溶液）比例為35:65。

5.2 樣品溶劑的選擇

本次實(shí)驗(yàn)中溶劑的選擇對(duì)峰形影響較大。如圖2所示，當(dāng)采用100％甲醇作為溶劑直接進(jìn)針檢測(cè)時(shí)，橙皮苷色譜峰會(huì)出現(xiàn)肩峰現(xiàn)象（圖2a），推斷原因可能是由于溶劑與流動(dòng)相的極性差別較大。因此，采用50％甲醇溶作為溶劑，肩峰現(xiàn)象消失，色譜峰的對(duì)稱因子在0.95左右，如圖2所示。

圖2 橙皮苷色譜圖

5.360Co輻照對(duì)橙皮苷成分影響的分析

含量測(cè)定結(jié)果表明，與未輻照樣品相比，2和10kGy的輻照劑量不影響橙皮苷成分的含量。但輻照劑量為6kGy時(shí)，橙皮苷的含量顯著性減少。表明這一輻照強(qiáng)度將對(duì)蛇膽陳皮散的藥品質(zhì)量造成一定的影響。不過(guò)減少后的含量依然符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，因此尚不影響藥品的使用和療效。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性，進(jìn)行了多次的提取測(cè)定工作，盡量排除可能的人為誤差，但多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果都保持著一致性，即6kGy的輻照劑量下橙皮苷的含量會(huì)顯著降低。目前造成含量降低的原因尚在進(jìn)一步的研究之中。

6 結(jié)論

在我國(guó)衛(wèi)生部頒布的《60Co輻照中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)》中，陳皮被列為允許輻照滅菌的藥材品種，但蛇膽陳皮散卻未被納入。目前亦尚無(wú)關(guān)于60Co輻照滅菌對(duì)蛇膽陳皮散質(zhì)量影響的相關(guān)報(bào)道。本論文利用高效液相色譜法檢測(cè)60Co輻照滅菌對(duì)蛇膽陳皮散質(zhì)量的影響，選擇主要成分橙皮苷作為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，輻照劑量為2和10kGy對(duì)橙皮苷的含量無(wú)明顯影響，而輻照劑量為6kGy時(shí)橙皮苷含量顯著減少（約17％）?？偟膩?lái)說(shuō)，在本實(shí)驗(yàn)所有劑量的60Co輻照處理后，橙皮苷含量依然符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。本論文的研究結(jié)果可以為蛇膽陳皮散采用60Co輻照滅菌提供一定的理論依據(jù)。

［1］陳天朝,徐麗軍,宋薇.中藥固體制劑滅菌技術(shù)研究現(xiàn)狀、問(wèn)題及對(duì)策［J］.中醫(yī)學(xué)報(bào),2013,28（7）:1015-1517.

［2］王錦燕.60Co-γ輻照滅菌在中藥及其制劑中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2013,17（6）:59-60.

［3］姚道魯,李奉勤,史東霞,等.60Co-γ射線輻照滅菌在中藥方面的應(yīng)用研究新進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,10（10）: 181-182.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部［M］.2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:1078-1079.

［5］蘇德模,王藏徐,徐玉華,等.60Co-γ射線輻照滅菌中成藥的最佳輻照劑量選擇（一）［J］.藥物分析雜志,1990,10（5）: 280-283.

【責(zé)任編輯：周紹纓410154121@qq.com】

Evaluating on Shedan-Chenpi Powder after different irradiation doses of60Co by HPLC method

LI Yan-ping1,ZENG Xu-xin1,HUANG Zhu-ai1, TAN Zhen2,WUJian-feng1*

（1.Department of Pharmacy,Foshan University.Foshan 528000,China; 2.Foshan Feng Liao Xing Pharmaceutical Company,Foshan 528000,China; 3.Foshan Pharmaceutical Society,Foshan 528000,China）

Aim To compare the contents of hesperidin in Shedan-Chenpi powder after different irradiation doses of60Co-γ and find the influence of radiations.Methods The chromatographic column Agilent Zorbax SB-C18(4.6×150mm,5μm)was adopted.The mobile phase consisted of methanol-0.1％phosphoric acid solution (35:65)at the flowrate of1ml/min.The column temperature was 26℃.UV detection wavelength was 283nm and the sample volume was 20μL.The results were further analyzed by SPSS one way ANOVA method.Results The contents of hesperidin in Shedan-Chenpi powder from the irradiation doses of 0kGy,2 kGy,6kGy and 10kGy were 43.37mg,42.32 mg,35.93mg and 42.43mg per 1gram respectively.Conclusion The contents of hesperidin from all irradiation doses met the requirement of Chinese Pharmacopoeia.The irradiation doses of 2 kGy and 10kGy had no effect on the contents of hesperidin,and the irradiation doses of 6kGy could significantly reduce the content of hesperidin in Shedan-Chenpi powder.

HPLC;60Co irradiation;Shedan-Chenpi powder;hesperidin

R286

A

1008-0171（2016）06-0065-05

2016-09-13

佛山社會(huì)組織發(fā)展專項(xiàng)扶持基金項(xiàng)目資助（20140430）

李艷萍（1985-），女，廣東肇慶人，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院助教，理學(xué)博士。*

吳劍峰（1960-），女，江蘇無(wú)錫人，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院教授，理學(xué)博士。