王明媚, Kevin Parris, ZHANG Dong-lin, 金曉玲，李志輝, 楊玉潔

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004; 2.佐治亞大學(xué)，美國佐治亞州 雅典 30602; 3.克萊姆森大學(xué)，美國南卡萊羅納州 克萊姆森 29634; 4.長江大學(xué)，湖北 荊州 434025)

天女花與廣玉蘭雜交F1代的ISSR遺傳多樣性分析

王明媚1,2, Kevin Parris3, ZHANG Dong-lin2*, 金曉玲1*，李志輝1, 楊玉潔4

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004; 2.佐治亞大學(xué)，美國佐治亞州 雅典 30602; 3.克萊姆森大學(xué)，美國南卡萊羅納州 克萊姆森 29634; 4.長江大學(xué)，湖北 荊州 434025)

利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)探討了天女花與廣玉蘭雜交后代9株幼苗的遺傳多樣性。9株F1代幼苗根據(jù)生長健壯的情況依次標(biāo)記為SA、SB、SC、SD、SE、SF,、SG、SH、SI。選用10個(gè)ISSR引物對(duì)親本以及9株F1代幼苗的基因組進(jìn)行分析。結(jié)果表明，11株植物共擴(kuò)增出96條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶為85條，占總條帶的88.5 %。UPGMA聚類結(jié)果表明所有F1代幼苗與六倍體父本更為相似，與二倍體的母本遺傳距離較遠(yuǎn)。其中SC無論從葉片大小、邊緣的形態(tài)在9株F1代幼苗中與父本最相似，SG葉片為披針形，在9株F1代幼苗中較為特殊。其余7株F1代幼苗日漸成熟后再根據(jù)UPGMA聚類樹狀圖進(jìn)行形態(tài)多樣性分析。

F1代遺傳多樣性；種間雜交；ISSR分子標(biāo)記技術(shù)；天女花；廣玉蘭；多態(tài)性條帶

天女花，原產(chǎn)于中國、日本以及朝鮮半島[1-2]，二倍體(2n=2x=38)[3]落葉灌木或小喬木，一年多個(gè)花期，花白色，紅色雄蕊。在美國4～8帶地域生長良好。廣玉蘭，塔形，原產(chǎn)于美國弗吉尼亞州至佛羅里達(dá)州，東至田納西州，抗寒性極強(qiáng)，六倍體(2n=6x=114)[3]常綠喬木，花白色。根據(jù)種間雜交以及不同倍性間的雜交[2,4]經(jīng)驗(yàn)，兩個(gè)品種均具有極大的育種潛力。具有豐富育種經(jīng)驗(yàn)的木蘭科育種學(xué)家Dennis Ledvina 是第一個(gè)從天女花與廣玉蘭雜交后代中選擇出具有商業(yè)價(jià)值產(chǎn)品的人。參照Ledvina 先生的經(jīng)驗(yàn)，于2013年5月在美國南卡萊羅納州斯巴坦堡社區(qū)學(xué)院樹木園對(duì)天女花和廣玉蘭進(jìn)行雜交。3個(gè)月后收獲到雜交種子并通過懸浮法獲得25顆具有活力的F1代種子。去掉假種皮，用10 %的次氯酸鈉進(jìn)行沖洗后把種子輕輕放在濕潤的泥炭塊中冷處理5個(gè)月。2014年3月共有21顆種子萌發(fā)。萌發(fā)后，有9株F1代幼苗(根據(jù)生長健壯的情況依次標(biāo)記為SA, SB, SC, SD, SE, SF, SG, SH, SI)被移栽到1加侖的容器中。通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測得所有的F1代育苗的染色體倍性為四倍體(2n=4x=76)[3]。后期生長表明，所有F1代幼苗葉片均為常綠，同六倍體父本一致。但是，葉片的大小、形狀以及顏色各有不同。且由于F1代幼苗樹齡小，其生長習(xí)性和花的特征了解不很清楚。因此，有必要進(jìn)行DNA分子鑒定掌握F1代的遺傳變異。

分子技術(shù)，像cpDNA分析[5]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于木蘭科植物的研究中。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是一種新的植物遺傳性研究技術(shù)[6-7]。分子技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性以及遺傳關(guān)系的研究中[8]。在此研究中，本文試圖分析出F1代與親本之間的遺傳變異以及F1代幼苗之間的遺傳多樣性，為木蘭科F2代優(yōu)良植株的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)選取2個(gè)親本和生命力旺盛的9株F1代幼苗(SA, SB, SC, SD, SE, SF, SG, SH, SI)上的新鮮葉片提取DNA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA提取 從F1代9株幼苗以及2個(gè)親本植株上均選取1片新鮮健康的葉片，用其一小部分放在液氮中提取DNA，多余葉片放在-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。使用DNA提取試劑盒QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit提取DNA。

1.2.2 DNA質(zhì)量檢測 提取的DNA樣品用spectrophotometer (ThermoScientific NanoDrop Lite)紫外分光光度計(jì)測定波長260和280 nm的光吸收值，以A260/A280比值判斷DNA樣品的純度，并直接觀測紫外分光光度計(jì)上樣品的濃度。檢測完畢的DNA放在-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。本試驗(yàn)以2個(gè)親本以及9個(gè)F1代DNA為模板，從100個(gè)ISSR引物中篩選出10個(gè)擴(kuò)增條帶清晰的引物用于11個(gè)植物的ISSR分析。

1.2.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)循環(huán)參數(shù) PCR反應(yīng)體系(20 μl)為：AmpliTaqGold 360 Master Mix 10 μl，模板DNA 3 μl，引物 1 μl，最后用ddH2O補(bǔ)足至20 μl。

PCR反應(yīng)采用如下循環(huán)參數(shù)定為：預(yù)變性94 ℃ 5 min，在變性94 ℃ 30 s，退火50～60 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1.5 min循環(huán)40次，最后一次延伸為72 ℃ 7 min，然后設(shè)置PCR溫度為4 ℃。

1.2.4 2個(gè)親本以及9個(gè)F1代樣本的ISSR-PCR擴(kuò)增 用篩選的引物對(duì)11個(gè)DNA樣本在相應(yīng)的退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2 %瓊脂糖凝膠并加入2滴EB于0.5X緩沖液中電泳，電壓120 V，約80 min后取出。使用100 bp DNA ladder作為參照標(biāo)準(zhǔn)，凝膠在UV燈下進(jìn)行觀察拍照。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠的某個(gè)相同遷移率的具體位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0。剔除模糊不清晰的條帶。使用PAUP 4.0 分析和估計(jì)親代與F1之間的基因差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR引物退火溫度的篩選

ISSR對(duì)PCR退火溫度極為敏感，同一引物對(duì)于不同退火溫度不一樣，而同一物種不同的引物，退火溫度也不相同。因此，對(duì)于ISSR分析而言，引物的篩選和退火溫度至關(guān)重要。本試驗(yàn)從100個(gè)ISSR引物中逐步篩選出10個(gè)擴(kuò)增條帶清晰的引物，這10個(gè)ISSR引物相應(yīng)的退火溫度在52～56 ℃，其中引物UBC807，UBC811，UBC812，UBC827，UBC828退火溫度最低，為52 ℃；引物UBC834，UBC835退火溫度最高，為56 ℃。

2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果及11個(gè)樣本的遺傳多態(tài)性

10個(gè)ISSR引物共擴(kuò)增出96條清晰的條帶，條帶大小為200～1500 bp，其中85條具有多態(tài)性，比例為88.5 %。不同引物擴(kuò)增大條帶數(shù)為7～15。平均每個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為9.6。其中引物UBC817擴(kuò)增出的具有多態(tài)性條帶比例最高，為100.0 %；引物UBC817擴(kuò)增出的具有多態(tài)性條帶比例最低，為57.1 %(表1)。對(duì)于每個(gè)分類單元，擴(kuò)增出的條帶數(shù)介于45(XX，Magnoliasieboldii‘Colossus’)至58(SG和SI)之間。

2.3 遺傳距離分析

供試材料的遺傳距離在0.167～0.604。因?yàn)樘炫?Magnoliasieboldii‘Colossus’)(XX) 為落葉，葉背沒有棕色絨毛，且葉片較大，而廣玉蘭 (Magnoliagrandiflora‘Kay Parris’)(XY) 葉片較小且常綠。經(jīng)過ISSR分析，它們之間的遺傳距離最大，為0.604。在F1代樣本之間，遺傳距離最小的兩個(gè)樣本為SH和SI，它們之間的遺傳距離為0.167；遺傳距離最大的2個(gè)樣本為SA和SG，它們之間的遺傳距離為0.396。F1代樣本與母本之間的平均遺傳距離為0.279，與父本之間的平均遺傳距離為0.494。從遺傳距離上看，六倍體父本比二倍體母本的貢獻(xiàn)力大。

2.4 ISSR聚類分析樹狀圖

根據(jù)ISSR數(shù)據(jù)結(jié)果，按UPGMA法構(gòu)建了親本與9個(gè)F1代樣本之間的遺傳關(guān)系聚類分析樹狀圖(圖1)。從聚類圖中可以看出，可將11個(gè)供試材料分為2類。

表1 10個(gè)引物序列、退火溫度、擴(kuò)增條帶數(shù)以及多態(tài)性

圖1 ISSR分析親本與F1代樣本聚類樹狀圖Fig.1 Dengrogram of Magnolia parents and F1 siblings based on ISSR data

第1類為母本。第2類為父本及9個(gè)F1代樣本，第2類中又分為4個(gè)亞類(圖1)。父本與SC之間遺傳距離最近為0.219。且從形態(tài)學(xué)上觀察，SC葉片的形狀以及大小最接近父本。SH和SI均具有小葉片，生長緩慢，以及相似的樹形。兩者從遺傳角度分析，也是遺傳距離最接近的兩個(gè)F1代樣本。這4個(gè)樣本被聚為第1個(gè)亞類。第2個(gè)亞類包含生長最快的SA，以及亞聚類SB和SF。從遺傳距離上判斷它們彼此接近，但從目前的生長及形態(tài)特征上無顯著差異。第3個(gè)亞類包含SD和SE。且它們也具有相似的形態(tài)特征。第4個(gè)亞類為SG，是唯一的具有可辨別的絨毛葉片的植株。

3 結(jié)論與討論

(1)特異性條帶與條帶組合類型對(duì)將來的研究至關(guān)重要[12]。在此試驗(yàn)中，共獲得17條特異性條帶，其中8條來自母本，只有1條來自父本。通過親本DNA重組，4個(gè)F1代樣本中出現(xiàn)特異性條帶。分別為SE和SG均有3條，SC和SD各有1條。因?yàn)镾G葉片為披針形且有3條特異性條帶，很可能控制披針形葉片形狀的基因是3條特異性條帶中的1條。但是，此假設(shè)還需要進(jìn)一步證實(shí)。由于F1代樣本較小，生長程度還不足以去推測帶型與生長的關(guān)系，需要進(jìn)一步的研究。

(2)ISSR分析結(jié)果表明SC與父本之間的親緣關(guān)系最近，且所有F1代樣本均與父本相似。這也證實(shí)了F1代樣本基因組DNA從母本與父本獲得的基因組DNA的比例為1∶3。通過ISSR分析，9個(gè)F1代樣本與父本分享11條帶，而只有3條帶是9個(gè)F1代樣本從母本獲得。待9個(gè)F1代樣本成熟將繼續(xù)觀察其生長習(xí)性以及花的特征，為未來木蘭科育種做準(zhǔn)備。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Genetic Variation ofMagnoliasieboldiiK. Koch ‘Colossus’ andMagnoliagrandifloraL.‘Kay Parris’ F1Seedlings Using ISSR Markers

WANG Ming-mei1, 2, PARRIS Kevin3, ZHANG Dong-lin2*, JIN Xiao-ling1, LI Zhi-hui1, YANG Yu-jie4

(1.Central South University of Forestry and Technology, Hunan Changsha 410004, China; 2.University of Georgia, Athens, GA 30602, USA; 3.Clemson University, Clemson, SC 29634, USA; 4.Yangtze University, Hubei Jingzhou 434025, China)

ISSR markers were used to analyze genetic variations and assessed inheritance of nine F1seedlings. Plants were accessioned and assigned a letter, with A being the most vigorous and I being the least vigorous individuals. A total of 96 bands were generated from 10 primers, in which 85 bands (88.5 %) were polymorphic. UPGMA tree revealed that all the seedlings were much closer to their hexaploid pollen parent (M.grandiflora‘Kay Parris’) and more distant from their diploid seed parent(M.sieboldii‘Colossus’), supporting early foliage morphology. Seedling C is the most similar to the pollen parent, both in regard to foliage proportions, margin undulation, and proximity. Seedling G is unique among the F1, displaying lanceolate leaves. Other seedlings grouped within the tree have slight morphological variations that may be analyzed for correlation to the UPGMA tree as they continue to mature and growth habit variations become evident.

F1variation; Interspecific hybrid; ISSR markers;Magnoliasieboldii‘Colossus’;Magnoliagrandiflora‘Kay Parris’; Polymorphic bands

1001-4829(2016)09-2225-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.037

2015-10-12

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(2014047 10)

王明媚(1989-)，女，河北唐山人，森林培育碩士研究生，E-mail: mingmei16@sina.cn, *為通訊作者。

S685.15

A