張 宇，黃國(guó)弟，黃 強(qiáng)

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

部分杧果種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP和ISSR分析

張 宇，黃國(guó)弟，黃 強(qiáng)

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

利用SRAP和ISSR分子標(biāo)記，對(duì)20份杧果種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳親緣關(guān)系分析，為杧果種質(zhì)資源的鑒定和雜交育種親本選配提供參考依據(jù)。結(jié)果顯示，在SRAP分析中，從80對(duì)引物中選出12對(duì)引物組合共擴(kuò)增出224條譜帶，每對(duì)引物組合擴(kuò)增譜帶數(shù)在13～21條，平均為18.7條，其中多態(tài)性譜帶為194條，平均多態(tài)性譜帶為16.2條，多態(tài)性比率為86.61 %，材料間相似遺傳系數(shù)變化范圍為0.54～0.94；在ISSR分析中，從100條引物中選出10條引物共擴(kuò)增出179條譜帶，每條引物擴(kuò)增譜帶數(shù)在11～20條，平均為17.9條，其中多態(tài)性譜帶為153條，平均多態(tài)性譜帶為15.3，多態(tài)性比率為85.35 %，材料間相似遺傳系數(shù)變化范圍為0.58～0.90。SRAP和ISSR標(biāo)記分別在相似系數(shù)0.624和0.665水平上，均可將20份杧果種質(zhì)資源分成4大類群，SRAP和ISSR標(biāo)記都能將供試材料完全區(qū)分開(kāi)來(lái)，聚類結(jié)果具有很高的一致性，均適用于杧果材料的遺傳多樣性分析，可用于杧果遺傳親緣關(guān)系的研究。

杧果；遺傳多樣性；SRAP；TRAP

杧果(MangiferaindicaLinnaeus.)屬漆樹(shù)科(Anacardiaceae)杧果屬(MangiferaLinnaeus)多年生常綠果樹(shù)，是與番荔枝、榴蓮、香蕉、菠蘿齊名的熱帶名果[1]。杧果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展依賴于杧果新品種的推陳出新。20世紀(jì)90年代，基于DNA水平的多種分子標(biāo)記技術(shù)相繼出現(xiàn)，這些技術(shù)以其多態(tài)性豐富、數(shù)量多、不受環(huán)境影響等特點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)對(duì)植物基因型的選擇提供了有力的工具，受到遺傳育種學(xué)家的高度重視。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)加速了杧果遺傳育種的發(fā)展。盡管AFLP[2-3]、RAPD[4-6]、SSR[7-8]等標(biāo)記技術(shù)在杧果的遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建、品種鑒定等方面已有一些應(yīng)用，但與蘋(píng)果[9-10]、梨[11-12]等大宗果樹(shù)相比，分子標(biāo)記技術(shù)在杧果上的研究相對(duì)起步較晚、應(yīng)用較為薄弱。SRAP[13]標(biāo)記技術(shù)多用于杧果功能基因的定位，ISSR[14-16]標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于杧果親緣關(guān)系鑒定和遺傳規(guī)律分析的報(bào)道最多，但將兩種標(biāo)記結(jié)合起來(lái)用于杧果遺傳多樣性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究借助SRAP和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，以廣西亞熱帶作物研究所杧果種質(zhì)資源圃內(nèi)的杧果種質(zhì)資源為材料，進(jìn)行遺傳多樣性分析和評(píng)價(jià)，旨在明確杧果遺傳多樣性和親緣關(guān)系情況，為今后杧果品種鑒別、雜交育種親本選配、遺傳關(guān)系及遺傳多樣性分析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的20份杧果種質(zhì)資源均種植于廣西亞熱帶作物研究所杧果種質(zhì)資源圃(表1)。

1.2 研究方法

1.2.1 總DNA的提取和濃度測(cè)定 參考張宇等[17]的改良CTAB法提取DNA，用紫外分光光度計(jì)和1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，將提取的DNA稀釋為30 ng/μl，放入-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SRAP和ISSR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 參考趙英等[18]和應(yīng)東山等[19]發(fā)表的SRAP反應(yīng)體系，利用正交優(yōu)化法，優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系為20 μl，包括25 mmol/L MgCl22 μl、10×PCR緩沖液 2 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、5 U/μlTaq酶 0.3 μl、30 ng/L模板DNA 3 μl、0.1 μmol/L上下游引物(表2)各2.5 μl、滅菌雙蒸水1.2 μl，加5 μl石蠟進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，(退火溫度因引物不同而不同)退火1 min，72 ℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

參考筆者之前的ISSR反應(yīng)體系，利用正交優(yōu)化法，優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系為20 μl，包括25 mmol/L MgCl22 μl、10×PCR緩沖液3 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、5 U/μlTaq酶0.5 μl、30 ng/L模板DNA 1 μl、0.1 μmol/L引物1 μl、滅菌雙蒸水12.0 μl，加5 μl石蠟進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，(退火溫度因引物不同而不同)退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 SRAP和ISSR引物篩選 SRAP引物設(shè)計(jì)參考Li等[14]所用引物，設(shè)計(jì)5條正向引物和7條反向引物，共計(jì)35對(duì)引物組合，由上海生物工程股份有限公司合成。ISSR引物設(shè)計(jì)選擇加拿大哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia,UBC)公布的100條引物，同樣由上海生物工程股份有限公司合成。以桂熱杧82號(hào)、桂熱杧71號(hào)、紫花杧、金煌杧、金穗杧為模板，篩選出SRAP和ISSR引物(表2)。

表1 材料名稱與來(lái)源地

注：M：多胚，P：?jiǎn)闻摺?/p>

Note:M：Monoembryonic，P：Polyembryonic.

1.2.4 電泳檢測(cè) 取8 μl擴(kuò)增產(chǎn)物在2 %的瓊脂糖電泳分離，電壓為5 V/cm，電極緩沖液為0.5×TBE，電泳結(jié)束后用熒光核酸染料染色，在紫外分析儀上觀察并照相。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)分子標(biāo)記的遷移率及其有無(wú)，統(tǒng)計(jì)所有的二元數(shù)據(jù)。按條帶有無(wú)賦值，有條帶的記為“1”，無(wú)條帶的記為“0”，記錄清晰、穩(wěn)定的擴(kuò)增帶輸入Excel 2007建立原始數(shù)據(jù)矩陣。應(yīng)用NTSYS(version2.10)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用非加權(quán)類平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，得到遺傳相似系數(shù)建立聚類分析樹(shù)狀圖[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP和ISSR擴(kuò)增多態(tài)性比較

設(shè)計(jì)正向引物5條，反向引物7條，共計(jì)12個(gè)引物組合。交由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，為了得到有效的SRAP分子標(biāo)記，此12對(duì)引物組合可以擴(kuò)增出條帶清晰、重復(fù)性好，多態(tài)性豐富的DNA電泳多態(tài)性譜帶。進(jìn)行SRAP擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析，利用12對(duì)引物組合對(duì)20份杧果種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增，共產(chǎn)生224條清晰條帶(圖1)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出18.7條，其中多態(tài)性譜帶為196條，平均多態(tài)性譜帶16.2條，多態(tài)性比率為86.61 %(表3)。選擇加拿大哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia,UBC)公布的引物，進(jìn)行序列設(shè)計(jì)與合成，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，為了得到有效的ISSR分子標(biāo)記，對(duì)已合成的100條引物進(jìn)行篩選，選出10條擴(kuò)增清晰、重復(fù)性好，多態(tài)性豐富的引物，進(jìn)行ISSR擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析。利用10條引物對(duì)20份杧果種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增，共產(chǎn)生179條清晰譜帶(圖2)，平均每個(gè)引物產(chǎn)生17.9條譜帶，其中多態(tài)性譜帶為153條，平均多態(tài)性譜帶15.3條，多態(tài)性比率為85.35 %(表3)。比較SRAP和ISSR擴(kuò)增的總條帶數(shù)和多態(tài)性譜帶比率，SRAP標(biāo)記多態(tài)性高于ISSR標(biāo)記。

表2 SRAP和ISSR引物序列

表3 SRAP和ISSR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳，并用紫外分析儀拍照可得SRAP和ISSR電泳圖譜(圖1和圖2)。36對(duì)SRAP引物組合中，12對(duì)引物組合可以擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的DNA譜帶，譜帶分子量在100 ～2000 bp；100條ISSR引物中，10條引物可以擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的DNA譜帶，譜帶分子量在250 ～2000 bp。SRAP和ISSR標(biāo)記均能擴(kuò)增出符合研究預(yù)期效果的DNA多態(tài)性譜帶，SRAP標(biāo)記擴(kuò)增譜帶清晰度、層次感較ISSR標(biāo)記擴(kuò)增效果好，SRAP標(biāo)記從較少的待選引物中篩選出較多的滿足研究要求的引物，且SRAP標(biāo)記擴(kuò)增譜帶分布范圍較ISSR標(biāo)記廣。比較分析SRAP和ISSR標(biāo)記擴(kuò)增電泳圖譜，杧果種質(zhì)資源具有較高的SRAP多態(tài)位點(diǎn)。

M:DL2000 bp ladder;編號(hào)1～20同表1，下同M:2000 bp ladder;Code 1-20 are the same as the table 1.The same as below圖1 SRAP引物組合Me3/Em14的擴(kuò)增電泳圖Fig.1 SRAP amplification profile of prime combination Me3/Em14

圖2 ISSR引物UBC857的擴(kuò)增電泳圖Fig.2 ISSR amplification profile of prime UBC857

2.2 SRAP和ISSR聚類分析比較

利用UPGMA法對(duì)SRAP標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類樹(shù)狀圖構(gòu)建(圖3)。在遺傳相似系數(shù)0.624處可將20份杧果供試材料分為4組，依次標(biāo)記A、B、C、D。興熱1號(hào)在A組；虎豹牙、金煌杧在B組；云霞杧、粉紅杧、沅江象牙杧、桂熱杧82號(hào)在C組；象牙22、紫花杧、紅蘋(píng)杧、金穗杧、紅玉杧、三蜜杧、桂熱杧71號(hào)、楊杧、碩帥杧、矮杧、攀西紅杧、白象牙、龍眼香杧在D組。在遺傳相似系數(shù)0.665處B組分為B1和B2 2個(gè)亞組，金煌杧在B1組，虎豹牙在B2組；在遺傳相似系數(shù)0.679處C組分為C1和C2 2個(gè)亞組，云霞杧、沅江象牙杧、桂熱杧82號(hào)在C1組，紅粉杧在C2組；在遺傳相似系數(shù)0.662處D組分為D1和D2 2個(gè)亞組，象牙22、紫花杧、紅蘋(píng)杧、金穗杧、紅玉杧、三蜜杧在D1組，桂熱杧71號(hào)、楊杧、碩帥杧、矮杧、攀西紅杧、白象牙、龍眼香杧在D2組。

按UPGMA法構(gòu)建ISSR標(biāo)記親緣關(guān)系樹(shù)狀圖(圖4)。在遺傳相似系數(shù)為0.665的水平上，將20份杧果供試材料分為4組，分別用A、B、C、D依次標(biāo)記。興熱1號(hào)在A組；虎豹牙、金煌杧在B組；云霞杧、粉紅杧、沅江象牙杧、桂熱杧82號(hào)、象牙22、紫花杧、紅蘋(píng)杧在C組；金穗杧、紅玉杧、三蜜杧、桂熱杧71號(hào)、楊杧、碩帥杧、矮杧、攀西紅杧、白象牙、龍眼香杧在D組。在遺傳相似系數(shù)0.711處B組分為B1和B2 2個(gè)亞組，虎豹牙在B1組，金煌杧在B2組；在遺傳相似系數(shù)0.728處C組分為C1和C2 2個(gè)亞組，云霞杧、沅江象牙杧在C1組，紅粉杧、桂熱杧82號(hào)、象牙22、紫花杧、紅蘋(píng)杧在C2組；在遺傳相似系數(shù)0.739處D組分為D1和D2 2個(gè)亞組，紅玉杧、三蜜杧、桂熱杧71號(hào)在D1組，金穗杧、楊杧、碩帥杧、攀西紅杧、白象牙、龍眼香杧在D2組?；谶z傳相似系數(shù)的不同(圖3～4)，利用UPGMA法對(duì)供試的20份杧果種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，SRAP和ISSR 2種標(biāo)記獲得了相似但不完全相同的聚類樹(shù)狀圖。

圖3 基于SRAP標(biāo)記遺傳相似系數(shù)UPGMA聚類圖Fig.3 Dendrogram generated by UPGMA methods based on genetic similarity from SRAP marker

圖4 基于ISSR標(biāo)記遺傳相似系數(shù)UPGMA聚類圖Fig.4 Dendrogram generated by UPGMA methods based on genetic similarity from ISSR marker

3 討論與結(jié)論

3.1 SRAP和ISSR遺傳多樣性比較分析

杧果遺傳多樣性研究是杧果育種的重要環(huán)節(jié)[21]。運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)研究杧果種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可以不受環(huán)境、時(shí)間、空間的限制，從基因組水平上揭示其遺傳差異。ISSR標(biāo)記技術(shù)是在SSR序列的5′或3′端錨定2～4個(gè)堿基為引物，降低其他可能靶標(biāo)退火的數(shù)目。此方法的優(yōu)勢(shì)是在基因組上只有與錨定的堿基匹配的位點(diǎn)才能被靶定，規(guī)避了引物在基因組上的脫落，加大PCR擴(kuò)增反應(yīng)的確定性，ISSR標(biāo)記是顯性標(biāo)記；引物設(shè)計(jì)是SRAP標(biāo)記的核心，SRAP標(biāo)記引物為雙引物，在正向引物使用“CCGG”序列，結(jié)合可譯框(ORFs)區(qū)域的外顯子，但外顯子通常具有保守特性，低水平的多態(tài)性限制了它們做標(biāo)記的條件，內(nèi)含子具有變異性大特點(diǎn)，堿基AT區(qū)域通常見(jiàn)于內(nèi)含子中，SRAP標(biāo)記反向引物的3′端含有核心AATT，以特異結(jié)合富含AT堿基區(qū)域，因此該標(biāo)記可以擴(kuò)增出基于內(nèi)含子與外顯子的SRAP多態(tài)性。本研究表明：SRAP擴(kuò)增電泳對(duì)20份杧果種質(zhì)資源共產(chǎn)生224條有效譜帶，平均每對(duì)引物組合擴(kuò)增出18.7條，其中多態(tài)性譜帶為196條，平均多態(tài)性譜帶16.2條，多態(tài)性比率為86.61 %；ISSR擴(kuò)增電泳對(duì)20份杧果種質(zhì)資源共產(chǎn)生有效譜帶179條，平均每條引物產(chǎn)生譜帶17.9條，其中多態(tài)性譜帶為153條，平均多態(tài)性譜帶15.3條，多態(tài)性比率為85.35 %。比較SRAP和ISSR擴(kuò)增的總譜帶數(shù)和多態(tài)性譜帶比率，SRAP標(biāo)記多態(tài)性高于ISSR標(biāo)記。在20個(gè)供試杧果品種間，SRAP標(biāo)記具有比ISSR標(biāo)記更寬泛的變異范圍，說(shuō)明前者比后者具有更高的標(biāo)記效率，更精確的遺傳變異數(shù)據(jù)。SRAP和ISSR均可作為杧果品種遺傳多樣性的分析手段。相對(duì)來(lái)說(shuō)，SRAP具有更高的多態(tài)性位點(diǎn)，能反映更多的遺傳信息。

3.2 SRAP和ISSR聚類結(jié)果比較分析

分子標(biāo)記的應(yīng)用評(píng)價(jià)是開(kāi)展分子遺傳多樣性研究工作的基礎(chǔ)，不同的分子標(biāo)記可能檢測(cè)到的遺傳信息水平不同[22]。在有些供試材料中甚至獲得相去甚遠(yuǎn)的結(jié)果[23]。本研究中SRAP和ISSR分子標(biāo)記對(duì)20份杧果種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳聚類分析獲得了相似性較為一致的結(jié)果。如：在ISSR聚類分析中，云霞杧、粉紅杧、沅江象牙杧、桂熱杧82號(hào)、象牙22號(hào)、紫花杧、紅蘋(píng)杧聚類在C組；而在SRAP聚類分析中，云霞杧、粉紅杧、沅江象牙杧、桂熱杧82號(hào)聚類在C組，象牙22號(hào)、紫花杧、紅蘋(píng)杧卻聚類在D組。在SRAP和ISSR分析中，C組和D組聚類樹(shù)狀圖的格局有所不同，這主要是因?yàn)镾RAP標(biāo)記是在總結(jié)RAPD、AFLP標(biāo)記優(yōu)缺點(diǎn)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出的一種基于PCR的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。SRAP標(biāo)記引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，上游引物17 bp，下游引物18 bp，上下游引物之間可以隨機(jī)搭配，兩兩組合，降低了引物的設(shè)計(jì)難度，提高了引物的利用效率[24]。SRAP標(biāo)記主要是針對(duì)開(kāi)放閱讀框(ORF)進(jìn)行擴(kuò)增，主要擴(kuò)增基因外顯子區(qū)域，并根據(jù)194個(gè)變異的信息進(jìn)行聚類。ISSR標(biāo)記針對(duì)基因中高度重復(fù)序列進(jìn)行擴(kuò)增，無(wú)需預(yù)知物種基因組信息，信息量豐富、重復(fù)性好、呈顯性標(biāo)記、操作簡(jiǎn)單，因而被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性研究中，并根據(jù)153個(gè)變異的信息進(jìn)行聚類，從而導(dǎo)致了兩種方法聚類結(jié)果存在一定差異[25]。從聚類的信息量來(lái)看，SRAP標(biāo)記聚類結(jié)果可靠性更高。

SRAP標(biāo)記繼承了RAPD和AFLP標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，克服了RAPD標(biāo)記穩(wěn)定差的缺點(diǎn)，同時(shí)克服了AFLP標(biāo)記復(fù)雜的劣勢(shì)。ISSR標(biāo)記吸收了RADP和SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，比RADP標(biāo)記穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富，比SSR標(biāo)記簡(jiǎn)單、無(wú)需特意性引物的設(shè)計(jì)[26-27]。本研究綜合利用SRAP和ISSR標(biāo)記分析了20份杧果種質(zhì)資源的遺傳多樣性，2種標(biāo)記均能產(chǎn)生各自有效的多態(tài)性譜帶，并揭示出材料間的遺傳差異，能很好地將所有材料加以區(qū)分。筆者分別用194個(gè)(SRAP)和153 (ISSR)個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分析20份杧果種質(zhì)資源，所得到的結(jié)果能夠真實(shí)、客觀地反應(yīng)出供試材料間的遺傳關(guān)系。

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(責(zé)任編輯 王冠玉)

Analysis on Genetic Relationship of Some Mango(MangiferaindicaL.) Germplasms by SRAP Markers and ISSR Markers

ZHANG Yu,HUANG Guo-di,HUANG Qiang

(Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Guangxi Nanning 530001, China)

The genetic variation and relationship of 20 mango germplasms were analyzed by SRAP and ISSR molecular markers in order to provide references for the identification of mango germplasm resources and breeding selection of parents. In SRAP analysis, from 80 pairs of primers, 12 pairs of primers were selected and 224 bands were amplified. Each primer combination amplified polymorphism belt in 13-21, with the average of 18.7. There were 194 polymorphic bands, with the average of 16.2. Polymorphism ratio was 86.61 %. The genetic similarity coefficient of materials was 0.54-0.94. In the ISSR analysis, from 100 primers, 10 primers amplified 179 bands.Each primer amplified bands from 11 to 20, with an average of 17.9,of which 153were polymorphic bands. The average polymorphism was 15.3 and polymorphic ratio was 85.35 %.The genetic similarity coefficient of materials was 0.58 - 0.90. The results showed that SRAP and ISSR markers were at the similarity coefficient of 0.624 and 0.665 levels. 20 copies of mango germplasm resources can be totally divided into 4 groups by SRAP and ISSR markers. Clustering results, due to high similarity, can be used for genetic diversity analysis and genetic relationship study of mango.

mango；genetic diversity；SRAP；ISSR

1001-4829(2016)09-2045-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.007

2016-04-01

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015GXNSFBA139085)；農(nóng)業(yè)部熱作農(nóng)技推廣與體系建設(shè)項(xiàng)目(16RZN-402)；國(guó)家行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201203092-5)

張 宇(1983-)，男，河北博野人，助理研究員，主要從事果樹(shù)生理與分子生物學(xué)研究工作，E-mail：375900554@qq.com。

S667.7

A