王洪秀，魏云輝*，靳 亮，胡中娥，李 菁，陳慶隆，李勝杰，鐘國(guó)祥

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所, 江西 南昌 330200; 2.江西省科學(xué)院微生物研究所, 江西 南昌 330096)

基于ITS序列分析18個(gè)茶樹菇菌株的親緣關(guān)系

王洪秀1，魏云輝1*，靳 亮2，胡中娥1，李 菁1，陳慶隆1，李勝杰1，鐘國(guó)祥1

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所, 江西 南昌 330200; 2.江西省科學(xué)院微生物研究所, 江西 南昌 330096)

采用ITS 序列分析方法，對(duì)供試18株(4株野生菌株、7株工廠化栽培菌株、5株經(jīng)鈷60輻照誘變菌株和2株搭載神十的航天誘變菌株)茶樹菇菌株進(jìn)行研究。結(jié)果表明，供試菌種的ITS序列長(zhǎng)度為703～721 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中茶樹菇菌種的ITS序列相似度為99 %以上，在種的水平上證明供試菌種為茶樹菇。運(yùn)用構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將供試菌種聚為6個(gè)類群，其中Cha3與Cha3shen，AS-2與AS-2-600，AS-1與AS-1shen、AS-1-700，分別聚在了不同的類群，說(shuō)明這7株茶樹菇菌株可能由于輻照或航天誘變后使得ITS序列存在著種內(nèi)的變異。ITS序列分析結(jié)果從系統(tǒng)發(fā)育角度反映出了研究菌株的遺傳關(guān)系，是進(jìn)行茶樹菇菌株遺傳分析及科學(xué)鑒定的重要工具。

茶樹菇；輻照誘變；航天誘變；ITS序列分析

茶樹菇(Agrocybeaegerita)隸屬于真菌門(Eumycota)、擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、傘菌目(Agaricales)、糞銹傘科(Bolbitiaceae)、田頭菇屬(Agrocybe)。野生的茶樹菇生長(zhǎng)在茶樹、楊柳樹等腐爛的樹木上，分布于中國(guó)的福建、云南、浙江及四川等地。由于其生長(zhǎng)宿主的多樣性及形態(tài)上的細(xì)微差別，又被命名為楊樹菇、柳松茸、柳環(huán)菌、柱狀田頭菇(Agrocybecylindracea)、茶薪菇(Agrocybechaxingu)、油菜菇等[1]。茶樹菇因其蓋肥柄脆、口味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而被譽(yù)為“中華神菇”。含有鐵、鋅、鈣等10多種微量元素，以及人體所需要的17種氨基酸(尤其是人體不能合成的7種氨基酸含量特別高)[2]。有些地方人們還當(dāng)作藥物來(lái)治療胃寒、腎炎水腫等慢性病[3]，近代研究表明茶樹菇不僅能抗神經(jīng)衰弱，而且對(duì)高膽固醇及高血脂有一定療效果[4]，甚至有報(bào)道表明茶樹菇有一定抗腫瘤功效[5]。長(zhǎng)期以來(lái)，一方面由于有關(guān)茶樹菇系統(tǒng)地位的報(bào)道較少，導(dǎo)致了命名上的混亂。另一方面，國(guó)內(nèi)外對(duì)茶樹菇的遺傳多樣性也鮮有報(bào)道[6-11]。因?yàn)椴铇涔降木薮蠼?jīng)濟(jì)價(jià)值，目前在國(guó)內(nèi)很多省份均有栽培。但是同大部分人工栽培食藥用菌一樣，也面臨著品種退化的威脅。因此，從各種環(huán)境中搜集野生資源，對(duì)現(xiàn)有品種進(jìn)行誘變馴化，以及對(duì)所分離菌株的準(zhǔn)確鑒定就愈發(fā)顯得重要。

真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)，又叫內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是位于真菌核糖體DNA(rDNA)上18S和28S基因之間的區(qū)域，包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS1)、5.8S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)[12]。在大多數(shù)生物中，18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA序列趨于保守，種間變化較小，作為非編碼區(qū)的ITS1區(qū)和ITS2區(qū)，在進(jìn)化過(guò)程中承受較小的自然選擇壓力，所以相對(duì)變化較大，可提供系統(tǒng)學(xué)分析所需的詳盡的可遺傳性狀[13]。真菌的rDNA的ITS區(qū)段的保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致、種間差異比較明顯，這一特點(diǎn)使得ITS區(qū)段不僅適合于屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，而且非常適合于真菌物種的分子鑒定[14]。許多學(xué)者利用不同物種中或同一物種不同菌株間ITS序列的差異來(lái)進(jìn)行真菌系統(tǒng)發(fā)育或分類鑒定等方面的研究[15-19]。

本文首次運(yùn)用ITS序列分析結(jié)合堿基比對(duì)，對(duì)18個(gè)供試的茶樹菇野生菌株、工廠化栽培菌株、經(jīng)鈷60輻照誘變菌株和航天誘變菌株的ITS序列特征構(gòu)建指紋圖譜，揭示其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為茶樹菇的品種選育、資源保護(hù)、遺傳學(xué)研究等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 茶樹菇Agrocybeaegerita的18個(gè)供試菌株，詳見表1。其中4株是野生菌株(編號(hào)1～4)、7株是工廠化栽培菌株(編號(hào)5～11)、5株是經(jīng)鈷60(劑量為600、700和800 Gy)輻照誘變菌株(編號(hào)12～16)、2株是搭載神十的航天誘變菌株(編號(hào)17～18)。大腸桿菌Escherichiacoli菌株DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

表1 茶樹菇18個(gè)供試菌株

注：1～4：野生菌株；5～11：工廠化栽培菌株；12～16：經(jīng)鈷60(劑量為600、700和800Gy)輻照誘變菌株；17～18：搭載神十的航天誘變菌株。 Note: 1-4: Wild strains; 5-11: Factory cultivation strains; 12-16: Cobalt-60 irradiation induced strains (dose: 600, 700 and 800 Gy); 17-18: Aerospace mutation strains carried by the Shenzhou 10 spacecraft.

1.1.2 主要培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基制作方法參考方中達(dá)[20]的方法，LB培養(yǎng)基參考于飛進(jìn)和陳衛(wèi)良[21]的方法。

1.1.3 生化試劑 TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)(北京天根生化科技有限公司)，TaqDNA聚合酶、克隆T載體pMD18-T、dNTP、瓊脂糖(大連寶生物工程有限公司)，PCR引物(上海立非生物技術(shù)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)及DNA的提取 接種少量菌絲體到PDA固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿平板。將長(zhǎng)滿平板的菌絲用灼燒滅菌過(guò)的接種鏟刮取至1.5 mL的Eppendorf管中，加入液氮研磨至粉狀，按照試劑盒使用說(shuō)明書的方法提取供試材料的DNA，提取的DNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ITS區(qū)段通用引物的擴(kuò)增 選用真菌ITS擴(kuò)增的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG -3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[22]，對(duì)供試的各個(gè)菌株進(jìn)行ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增。反應(yīng)在25 μl體系中進(jìn)行，各組分如下：2.5 mmol/L dNTP 2 μl、5 U/μlTaq酶0.2 μl、10 × PCR buffer 2.5 μl、5 μmol/L引物ITS1 1 μl、5 μmol/L引物ITS41 μl、基因組DNA 1 μl，加ddH2O至25 μl。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。

1.2.3 目的片段的克隆與測(cè)序 從瓊脂糖凝膠上將700 bp左右的ITS擴(kuò)增條帶切下，克隆到pMD18-T載體，用熱擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～16 h，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將LB菌液送交上海立非生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 測(cè)得的ITS序列通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行同源序列比較，選擇了與供試菌ITS序列相似度99 %以上的6條序列，以香菇的ITS序列為外類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[23-25]。采用Clustal X程序進(jìn)行多序列匹配排列，然后通過(guò)MEGA4.0程序中的Neighbor-Joining(NJ)方法、采用Jukes-Cantor計(jì)算模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1000次Bootstrap可信度分析，Kimura 2-parameter法計(jì)算遺傳距離，空位作為完全缺失(Complete deletion)處理，設(shè)置相同的轉(zhuǎn)換(Transition，Ti)和顛換(Transversion，Tv)權(quán)重。

M：DL2000 Marker；1～16：不同菌株的PCR產(chǎn)物；CK：對(duì)照M: DL2000 Marker; 1-16: PCR products of different isolates; CK: Control圖1 茶樹菇菌株ITS1/4引物的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of isolates from Agrocybe aegerita with ITS1/4 primers

1.2.5 序列登錄號(hào) 將本實(shí)驗(yàn)中所得到的供試菌株ITS序列提交GenBank登記，序列號(hào)如下：KT148846-KT148863。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶清晰(圖1)，大小在720 bp左右。

2.2 ITS序列分析

經(jīng)對(duì)位排列，去掉兩端不整齊部分得到18株供試菌的ITS比對(duì)序列，長(zhǎng)度為703～721 bp(表2)，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的茶樹菇菌種的ITS序列相似度為99 %以上，在種的水平上證明供試菌株為茶樹菇。在ITS序列中共有696個(gè)保守位點(diǎn)(Conserves sites)，27個(gè)變異位點(diǎn)(Variable sites)，9個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(Parsimony-informative sites)，18個(gè)單個(gè)堿基變化位點(diǎn)(Singleton sites)，存在插入與缺失。18株供試菌的ITS序列各堿基含量：A為21.2 %～22.1 %，平均值為21.7 %；T為30.1 %～30.8 %，平均值為30.5 %；G為23.7 %～24.1 %，平均值為23.8 %；C為23.6 %～24.2 %，平均值為23.9 %；G+C為47.4 %～48.2 %，平均值為47.7 %。G+C含量能反映屬種間的親緣關(guān)系，含量差異越小，親緣關(guān)系越近。本實(shí)驗(yàn)供試菌的G+C含量差異不明顯，說(shuō)明親緣關(guān)系較近[26](表2)。

表2 18個(gè)茶樹菇菌株ITS序列的序列長(zhǎng)度及G+C含量

括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為GenBank序列號(hào)；結(jié)點(diǎn)處數(shù)字為Bootstrap值；標(biāo)尺代表2 %的序列分歧Numbers in parenthesis represented GenBank accession No.. Numbers at the branch points indicated the bootstrap values. The scale bar represents a 2 % sequence divergence圖2 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

12345678910111213141516171Yangshushang2hao2AS?1?7000．01013AS?10．00720．00874AS?1shen0．00570．00720．00145AS?2?6000．00570．00720．00140．00006AS?20．00720．00580．00580．00430．00437Baicha7000．00720．01450．01160．01010．01010．01168Baicha0．00570．01310．01010．00860．00860．01010．00149Cha3?8000．00570．00720．00140．00000．00000．00430．01010．008610Cha30．00860．01010．00430．00290．00290．00720．01300．01150．002911Cha3shen0．00720．00580．00580．00430．00430．00290．01160．01010．00430．007212Cha5?8000．00570．01310．01010．00860．00860．01010．00140．00000．00860．01150．010113Cha50．00720．01450．01160．01010．01010．01160．00290．00140．01010．01300．01160．001414Chayuan1hao0．00580．01020．00720．00580．00580．00720．01010．00870．00580．00870．00720．00870．010115Chayuan2hao0．01300．01450．01450．01300．01300．01160．01160．01010．01300．01600．01160．01010．01160．013116Gu10．00720．00580．00290．00430．00430．00290．01160．01010．00430．00720．00290．01010．01160．00720．011617Gu20．00580．01010．01010．00870．00870．00720．01010．00870．00870．01160．00720．00870．01010．00870．01300．007218Yangshudong1hao0．00000．01010．00720．00570．00570．00720．00720．00570．00570．00860．00720．00570．00720．00580．01300．00720．0058

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2)，結(jié)果表明,18株茶樹菇菌株聚成6個(gè)類群：第Ⅰ類群：Yangshushang2hao、Yangshudong1hao；第Ⅱ類群：Cha3-800、Cha3、Chayuan1hao、AS-2-600、AS-1shen；第Ⅲ類群：AS-1、Gu1；第Ⅳ類群：Gu2、AS-2、AS-1-700、Cha3shen；第Ⅴ類群：Baicha700、Cha5-800、Baicha、Cha5；第Ⅵ類群：Chayuan2hao。其中Cha3與Cha3shen，AS-2與AS-2-600，AS-1與AS-1shen、AS-1-700，分別聚在了不同的類群，說(shuō)明這7株茶樹菇菌株可能由于輻照或航天誘變后使得ITS序列存在著種內(nèi)的變異。系統(tǒng)發(fā)育分析中18個(gè)菌株聚為6個(gè)分支，應(yīng)視為6個(gè)遺傳株系，分支間遺傳距離較大，可在遺傳分支間挑選親本菌株進(jìn)行雜交育種，以便充分發(fā)揮雜交后代遺傳互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)。

基于Kimura 2-parameter距離模式進(jìn)行遺傳距離分析(表3)，結(jié)果表明18株供試菌的成對(duì)序列遺傳距離范圍為0.0000～0.0160，總體平均遺傳距離為0.0079，Yangshushang2hao與Yangshudong1hao，Baicha與Cha5-800，Cha3-800與AS-1shen、AS-2-600，以及AS-2-600與AS-1shen，這4組菌間的遺傳距離為0，不存在遺傳分化，應(yīng)為相同菌株[27]；余下11株菌種(AS-1-700、AS-1、AS-2、Baicha700、Cha3、Cha3shen、Cha5、Chayuan1hao、Chayuan2hao、Gu1、Gu2)間的遺傳距離大于0，存在一定的遺傳差距，因此經(jīng)ITS序列初步分析，將供試的18株菌種定為14個(gè)菌。

3 討 論

由于ITS區(qū)不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速率較快，在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性；同時(shí)ITS序列長(zhǎng)度適中，從人類到酵母的各種真核生物中ITS的序列長(zhǎng)度約為300～1000 bp。因此，可以從不太長(zhǎng)的序列中獲得足夠的信息，已受到真菌分類學(xué)者的廣泛關(guān)注。rDNA-ITS序列變異較快，可提供比較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，因此可作為一種分子標(biāo)記用于探討真菌種內(nèi)變異和屬內(nèi)種間分子系統(tǒng)關(guān)系[28-31]。近年來(lái)，Xiao等利用rDNA-ITS序列提出了冬蟲夏草種復(fù)合群體及其包含的3個(gè)隱存種的假設(shè)[32]，曹杰等利用ITS序列分析證明8種鵝膏菌的種間具有較高的遺傳多樣性[33]。由于ITS序列具有方便、快速的特點(diǎn)，因此也用于鑒定一些未知植株，如侯軍等利用ITS序列對(duì)疑似菌株白羊肚菌進(jìn)行了初步分子鑒定[34]，李小林等結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察和ITS序列分析對(duì)2株耐高溫野生柱狀田頭菇進(jìn)行鑒定及系統(tǒng)發(fā)育地位的研究[35]。

AS-1、AS-2、Gu1、Gu2、Baicha、Cha5為重要的茶樹菇主栽品種，在ITS序列分析中，AS-1和Gu1聚在一個(gè)分支，AS-2和Gu2聚在一個(gè)分支，Baicha和Cha5聚在一個(gè)分支，三者分屬不同的遺傳分支，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)。栽培中可以將3類菌株搭配種植，以擴(kuò)大栽培菌株間的遺傳背景，利于改良栽培品種結(jié)構(gòu)，提高茶樹菇栽培品種對(duì)環(huán)境、病蟲害等因素的適應(yīng)性。

Cha3與Cha3shen，AS-2與AS-2-600，AS-1與AS-1shen、AS-1-700，分別聚在了不同的類群，說(shuō)明這7株茶樹菇菌株可能由于輻照或航天誘變后使得ITS序列存在著種內(nèi)的變異。菌株經(jīng)輻照或航天誘變產(chǎn)生的變異可以改變菌株因長(zhǎng)期栽培導(dǎo)致的菌種退化。也可以選擇產(chǎn)生有利性狀的誘變菌株作為父母本進(jìn)行雜交，增強(qiáng)后代的雜種優(yōu)勢(shì)。

Yangshushang2hao、Yangshudong1hao、Chayuan1hao、Chayuan2hao菌株為野生分離菌株，在ITS序列分析中Yangshushang2hao、Yangshudong1hao、Chayuan1hao與Cha3-800、Cha3、AS-2-600、AS-1shen系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系很近。但因其采自野生環(huán)境，具有特有的環(huán)境適應(yīng)性、抗逆性等優(yōu)良特性，能夠作為優(yōu)良親本菌株在育種中得到較好應(yīng)用。

在ITS序列分析試驗(yàn)中，獲得了18個(gè)茶樹菇菌株的ITS特征指紋圖譜，并被聚為6個(gè)分支，反映出了研究菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果從系統(tǒng)發(fā)育角度分析得到了研究菌株的遺傳關(guān)系，其研究結(jié)果能夠直接應(yīng)用于進(jìn)一步的遺傳育種和種質(zhì)鑒定等工作，是進(jìn)行茶樹菇菌株遺傳分析及科學(xué)鑒定的重要工具。由于受時(shí)間和條件限制，研究供試的茶樹菇菌株較少，在今后研究中將進(jìn)一步擴(kuò)大取樣數(shù)量和取樣范圍。

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(責(zé)任編輯 李山云)

Analysis on Genetic Relationships of 18AgrocybeaegeritaStrains Based on ITS Sequence

WANG Hong-xiu1, WEI Yun-hui1*, JIN Liang2, HU Zhong-e1, LI Jing1, CHEN Qing-long1, LI Sheng-jie1, ZHONG Guo-xiang1

(1.Institute of Agricultural Applied Microbiology, Jiangxi Agricultural Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330200, China; 2. Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330096, China)

18 testedAgrocybeaegeritastrains (4 wild strains, 7 factory cultivation strains, 5 Cobalt-60 irradiation induced strains, 2 aerospace mutation strains carried by the Shenzhou 10 spacecraft) by ITS sequence analysis were studied. The results showed that the lengths of ITS sequences ofAgrocybeaegeritastrains were 703-721 bp, and their ITS sequence similarity in the GenBank database was more than 99 %, which indicated that the tested strains wereAgrocybeaegeritaat the specific level. Phylogenetic tree was also constructed that the tested strains were clustered into six groups, of which Cha3 and Cha3shen, AS-2 and AS-2-600, AS-1 and AS-1shen and AS-1-700 were respectively clustered into different groups, which indicated that there were intraspecific variations for ITS sequences of these seven strains under the conditions of irradiation or aerospace mutation. The phylogenetic relationships were distinctly delineated using ITS sequencing, which was an important tool in the genetic analysis and identification ofAgrocybeaegerita.

Agrocybeaegerita; Radiation mutation; Aerospace mutation; ITS sequence analysis

1001-4829(2016)09-2038-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.006

2015-09-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460490)；中國(guó)科學(xué)院農(nóng)業(yè)與環(huán)境微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究基金項(xiàng)目(2014AEM003)；江西省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(20142BAB214021)；南昌市對(duì)外科技合作與成果轉(zhuǎn)化推廣計(jì)劃項(xiàng)目(2013HZCG019)；江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目(2012CBS006)

王洪秀(1981-)，女，黑龍江海倫人，博士，主要研究方向?yàn)槭乘幱镁z傳育種、資源化利用及栽培技術(shù)研究，E-mail:wanghongxiu0624@163.com，Tel：13607045429，*為通訊作者，E-mail:yunhuiwei@sina.com。

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