譚建英，劉 濤，陳俊英，黃 楠

(1. 西南交通大學 材料學院材料先進技術(shù)教育部重點實驗室，成都 610031；2. 江蘇淮陰工學院 介入醫(yī)療器械重點實驗室，江蘇 淮安 223003)

載VEGF的肝素-PLL納米顆粒改性表面對抗凝血性及內(nèi)皮細胞行為的影響＊

譚建英1，劉 濤2，陳俊英1，黃 楠1

(1. 西南交通大學 材料學院材料先進技術(shù)教育部重點實驗室，成都 610031；2. 江蘇淮陰工學院 介入醫(yī)療器械重點實驗室，江蘇 淮安 223003)

利用生物分子間的相互作用制備載VEGF的肝素-多聚賴氨酸(PLL)納米顆粒，將該納米顆粒固定于多巴胺涂覆的316L不銹鋼表面，研究其對表面抗凝血性能以及內(nèi)皮細胞行為的影響。通過阿辛藍染色和甲苯胺藍定量肝素的方法對改性表面的理化性質(zhì)進行表征；用熒光染色法和掃描電鏡觀察表面血小板的粘附數(shù)量及形態(tài)；通過APTT檢測不同樣品表面的凝血時間；通過熒光染色法和CCK-8細胞增殖活性檢測對改性表面的內(nèi)皮細胞生長行為進行評價。結(jié)果顯示，構(gòu)建的納米顆粒成功固定于316L不銹鋼表面，改性后的表面具有良好抗凝效果(1 h)，且樣品體外浸泡0，5和15 d后，依然保持良好的持續(xù)抗凝血性；同時，改性后的樣品表面內(nèi)皮細胞數(shù)量、形態(tài)、活性等生物學行為保持良好，具有明顯促內(nèi)皮再生的潛能。納米顆粒引入心血管材料表面為其生物功能化提供了一種可行方法。

血管內(nèi)皮生長因子；納米顆粒；抗凝；內(nèi)皮細胞

0 引 言

經(jīng)皮冠脈支架介入術(shù)(PCI)已經(jīng)成為治療冠心病的主要方法，但由于支架材料生物相容性不足以及在治療過程中引起血管內(nèi)皮損傷，造成血栓及支架內(nèi)再狹窄等并發(fā)癥。雖然藥物洗脫支架(DES)的出現(xiàn)降低了50%～70%的早中期支架內(nèi)再狹窄率[1]，但在藥物釋放結(jié)束后，依然存在著很高的晚期并發(fā)癥風險[2-4]。為此在血管支架表面進行生物化改性，提高表面血液相容性并促進血管內(nèi)皮再生，是解決術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生的有效途徑。肝素(Hep)能與抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)相互作用，是臨床上最常用的抗凝藥物[5]。因此，表面肝素化是提高支架材料表面血液相容性的最常用方法之一[6-7]。除此之外，肝素還可與體內(nèi)多種蛋白及細胞因子結(jié)合，并發(fā)揮出特定的生物學功能[8]。Hep與細胞外基質(zhì)蛋白和血管內(nèi)皮友好性細胞因子的特異性結(jié)合具有促進內(nèi)皮再生的潛能[9]，此外，游離態(tài)的Hep能夠阻斷由這些信號蛋白介導的細胞內(nèi)信號應答[10-12]。天然的血管內(nèi)皮層能夠形成無血栓和抑制平滑肌細胞增生的表面[13]。血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)作為一種高度特異性的血管內(nèi)皮有絲分裂素[14]，可以促進血管內(nèi)皮細胞生長，并在體內(nèi)誘導血管新生[15]。而肝素與VEGF特異性結(jié)合后能夠有效保護其活性，Randall等[16]將肝素與PLL結(jié)合，并證實固定VEGF的表面具有高特異性捕獲內(nèi)皮祖細胞的能力。Liu等[17]研究表明，裝載VEGF的肝素-PLL納米顆粒具有促進內(nèi)皮細胞遷移、增殖以及促進內(nèi)皮祖細胞增殖的能力。

但是關(guān)于納米顆粒持續(xù)抗凝的研究卻較少，本文不僅研究了接枝納米顆粒后材料表面的生物相容性，還重點研究了該體系的持續(xù)抗凝效果和對內(nèi)皮再生的影響。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

316L不銹鋼(SS，?10 mm)，丙酮，乙醇，蒸餾水，低分子量肝素(大于等于160 U/mg)，多聚賴氨酸(PLL, MW 150 000～300 000)，多巴胺(DM)，甲苯胺藍(TBO)，羅丹明123，DAPI，磷酸緩沖液(PBS，pH值為7.4)，VEGF(人源)，DMEM-F12培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%胰酶，0.9%氯化鈉注射液，細胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK-8)，倒置熒光顯微鏡，超凈工作臺，CO2細胞培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，電熱恒溫水浴鍋，移液槍，酶標儀，全自動凝血機(Clot-1A，Hospitax)。

1.2 載VEGF納米顆粒的制備與固定

首先將316L不銹鋼打磨、拋光并清洗；然后將樣品浸沒在2 mg/mL的DM溶液中(溶劑為10 mmol/L Tris buffer溶液，pH值為8.5)，20 ℃下靜置反應12 h后，用蒸餾水超聲清洗3次并烘干，記為1層DM層；重復上述多巴胺沉積步驟兩遍，在不銹鋼表面共沉積3層DM層，樣品標記為DM；隨后將14 mg/mL的肝素溶液與700 ng/mL VEGF溶液等體積混合，37 ℃下靜置反應1 h后，將其緩慢滴加到等體積的0.5 mg/mL的PLL溶液中，形成載VEGF的肝素-PLL納米顆粒；最后將DM樣品浸沒在納米顆粒懸液中，37 ℃下振蕩反應24 h，樣品標記為DM-NPV。未裝載VEGF的納米顆粒作為對照組，標記為DM-NP。

1.3 理化性質(zhì)表征

用水接觸角測試儀(JY-82，China)對樣品表面進行親水性檢測；用阿辛藍染色的方法定性表征材料表面肝素接枝情況；用甲苯胺藍定量表征材料表面肝素接枝量；用羅丹明染色與CCK-8對樣品表面細胞進行形態(tài)與數(shù)量的檢測；用羅丹明染色法與掃描電鏡法對樣品表面血小板粘附進行形態(tài)與數(shù)量檢測。

1.4 血小板粘附實驗

將SS與DM作為實驗對照樣，取新鮮人血于1 500 r/min離心15 min，取上清液，獲得富板漿(PRP)；然后在不同樣品表面滴加富板漿50 μL，放恒溫水浴鍋37 ℃孵育1 h；結(jié)束后用PBS清洗3遍，洗去物理粘附的血小板；洗后再用2.5%戊二醛室溫固定24 h；最后將固定好的樣品洗凈吹干，再進行羅丹明染色以及掃描電鏡觀察。再取新鮮人血于3 000 r/min離心15 min，取上清液，獲得貧板漿(PPP)；將樣品浸泡于280 μL貧板漿中，37 ℃孵育30 min；將全自動凝血機反應杯放在指定位置，加入一定量的APTT試劑和濃度為0.025 mol/L的CaCl2；孵育結(jié)束后，依次從樣品中吸取250 μL的PPP于反應杯中，選擇PPP為對照，根據(jù)儀器提示操作，檢測APTT值。

1.5 內(nèi)皮細胞相容性評價

先將已經(jīng)培養(yǎng)好的細胞用生理鹽水清洗3遍，然后每瓶細胞滴加3～4滴0.25%胰酶，將內(nèi)皮細胞從培養(yǎng)瓶中消化下來，至細胞呈皺縮狀，然后加入培養(yǎng)基(20%FBS)吹打瓶底，并且將細胞懸液吹打均勻；加培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋成2×104個/mL，然后將800 μL細胞懸液緩慢滴加到樣品表面，并放入CO2孵箱，培養(yǎng)1，3和5 d；并于特定時間提前3.5 h，在無菌條件下加入CCK-8(V(CCK-8)∶V(培養(yǎng)基)=1∶9)進行細胞活性檢測；然后取出細胞，固定后進行熒光染色；最后于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米顆粒功能層的構(gòu)建與表征結(jié)果

2.1.1 納米顆粒功能層的構(gòu)建

如圖1所示，先將VEGF與肝素特異性結(jié)合、再與PLL等體積混合制成納米顆粒，然后將納米顆粒接枝到沉積DM的不銹鋼(SS)表面，即得裝載VEGF的Hep-PLL納米顆粒改性表面。

圖1 載VEGF的肝素-多聚賴氨酸(PLL)納米顆粒功能層構(gòu)建示意圖

2.1.2 納米顆粒功能層的表征結(jié)果

(1) 阿辛藍染色檢測

阿辛藍與肝素結(jié)合可以呈現(xiàn)出藍綠色，樣品表面阿辛藍染色肝素的結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，多巴胺表面平整，在光鏡下呈橙黃色，而沉積了納米顆粒的多巴胺表面出現(xiàn)了明顯的藍綠色顆粒，且均勻分布，顆粒之間無聚集現(xiàn)象，表明裝載VEGF的納米顆粒在材料表面固定成功，且均勻分布于樣品表面。

(2) 表面親水性檢測

由圖3可看出，SS表面水接觸角為(59.8±2.8)°，而DM表面為(61±1.5)°，這是由于DM分子中含有疏水性結(jié)構(gòu)苯環(huán)，使沉積多巴胺后表面親水性無明顯改善。接枝納米顆粒后，樣品表面水接觸角顯著下降，其中DM-NP表面為(41.5±1.5)°，DM-NPV表面為(43.3±5.1)°，這是由于肝素與PLL中具有較多的如—COOH、—NH2等親水性基團。與DM-NP改性表面相比，載VEGF納米顆粒改性表面親水性無顯著變化，但是仍然具有較好的親水性。一般認為樣品表面親水性的增加有利于降低血小板粘附和促進細胞粘附。因此，良好的親水性為改善表面血液與細胞相容性提供了有利基礎(chǔ)。

圖3 各樣品表面水接觸角變化

Fig 3 Water contact angle of different samples surface

(3)甲苯胺藍(TBO)定量肝素結(jié)果

圖4為接枝納米顆粒表面甲苯胺藍法定量檢測肝素的結(jié)果。實驗以DM作為空白對照，由圖4可見，接枝納米顆粒后，表面肝素暴露密度約為9～10 μg/cm2，且DM-NP組和DM-NPV組之間無明顯差異。雖然肝素化表面往往表現(xiàn)出不利于細胞生長的特性，但根據(jù)Liu Tao等的研究結(jié)果，在一定肝素密度范圍內(nèi)，肝素化表面對內(nèi)皮細胞的生長增殖行為不會產(chǎn)生顯著影響[18]。據(jù)此推斷，本文中樣品表面接枝納米顆粒后，表面肝素暴露密度不會對內(nèi)皮細胞的行為產(chǎn)生明顯影響。

圖4 各樣品表面肝素定量結(jié)果

Fig 4 Quantitative characterization of heparin binding density on DM，DM-NP and DM-NPV

2.2 血液相容性評價

2.2.1 血小板粘附實驗結(jié)果

血小板的粘附與激活行為將直接影響到表面血栓的形成。樣品表面血小板粘附的SEM圖如圖5所示。

圖5 樣品表面血小板粘附的SEM圖(培養(yǎng)時間：1 h)

由SEM結(jié)果(圖5)可看出，SS與DM表面粘附了大量血小板，且血小板有大量偽足伸出，部分血小板甚至出現(xiàn)鋪展形態(tài)，血小板之間團聚現(xiàn)象明顯，這表明表面血液相容性差，在體內(nèi)有引發(fā)血栓形成的風險。而DM-NP和DM-NPV改性的表面血小板數(shù)量均明顯降低，粘附的血小板呈圓形，幾乎無偽足伸出現(xiàn)象和鋪展形態(tài)，說明表面粘附的血小板未激活。又從圖6中APTT檢測結(jié)果可以看出，PPP、SS及DM樣品的APTT值相差不大，均在38 s左右；而DM-NP的凝血時間達到85 s左右，DM-NPV凝血時間達到100 s左右、較DM-NP凝血時間更長，表明接枝納米顆粒的表面凝血時間得到明顯延長，通常在臨床上使用肝素時APTT值較對照樣延長1.5～2.5倍具有較好的抗凝效果。 因此，由以上結(jié)果可以看出經(jīng)過納米顆粒改性的表面能夠有效抑制血小板粘附與激活、顯著延長凝血時間，具有良好的抗凝性。

2.2.2 納米顆粒對持續(xù)性抗凝的影響

為了進一步評價樣品表面的持續(xù)性抗凝效果，本文選擇將納米顆粒改性的樣品與對照樣浸入無菌PBS溶液中，在37 ℃恒溫條件下，搖床震蕩5和15 d后取出，并進行血小板粘附實驗，以評價其表面血液相容性的變化。

實驗結(jié)果如圖7所示，浸泡之前，SS與DM表面粘附的血小板數(shù)量較多，且大量聚集，而接枝納米顆粒的DM-NP與DM-NPV表面血小板數(shù)量明顯減少，沒有出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。

圖6 樣品表面APTT檢測結(jié)果

Fig 6 The result of APTT on different samples surfaces

圖7 各樣品在PBS中浸泡0，5，15 d后表面血小板粘附情況(培養(yǎng)時間：45 min)

Fig 7 Immunofluorescence staining of adherent platelets on different samples surfaces after immersed in PBS 0，5 and 15 d

從圖7可知，浸泡5與15 d后，SS與DM表面均粘附大量血小板，且血小板呈嚴重聚集狀態(tài)，血小板被激活，因此抗凝效果仍然很差。但是，表面接枝納米顆粒的DM-NP與DM-NPV樣品表面，粘附的血小板數(shù)量明顯減少，未出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，呈現(xiàn)良好抗凝效果。該結(jié)果表明，接枝肝素-PLL納米顆粒的表面，在PBS中浸泡15 d后仍然具有較好抗凝效果，同時，納米顆粒裝載VEGF后，其持續(xù)抗凝效果未受影響。

2.3 細胞相容性評價

2.3.1 接枝納米顆粒表面對內(nèi)皮細胞形態(tài)的影響

在抑制血小板粘附與激活的基礎(chǔ)上，理想的支架材料表面還應具有促進表面內(nèi)皮化的能力，即促進表面內(nèi)皮再生。圖8為血管內(nèi)皮細胞在接枝納米顆粒前后的樣品表面種植1，3及5 d后的結(jié)果，由圖8可見，培養(yǎng)1 d后，內(nèi)皮細胞在表面鋪展良好，CCK-8檢測結(jié)果也表明各樣品表面細胞增殖活性相當；培養(yǎng)3 d后，SS、DM及DM-NPV表面細胞數(shù)量都有一定程度的增加，鋪展呈現(xiàn)鋪路石形態(tài)，表現(xiàn)出較好的活性，但是DM-NP表面細胞數(shù)量雖有一定程度增加，但是形態(tài)較差；培養(yǎng)5 d后，樣品表面細胞數(shù)量均明顯增加，并且DM-NPV表面細胞長成了1層致密的細胞層，而對照樣SS與DM表面細胞增值不明顯，表明VEGF能夠較好地促進內(nèi)皮細胞增值與鋪展。

圖8 內(nèi)皮細胞靜態(tài)培養(yǎng)1，3，5 d熒光染色結(jié)果

2.3.2 接枝納米顆粒表面對內(nèi)皮細胞活性的影響

表面接枝納米顆粒后，能夠較好促進細胞鋪展(圖8)，但細胞活性直接影響內(nèi)皮細胞的增殖與功能，從而影響內(nèi)皮再生。本文進一步進行了樣品表面內(nèi)皮細胞增殖活性，如圖9所示。在培養(yǎng)1 d時，接枝納米顆粒的樣品表面細胞活性不及SS與DM表面；培養(yǎng)至3 d時，各樣品表面細胞活性都得到明顯增加，但是DM-NPV表面仍與對照樣相差不大；而培養(yǎng)至5 d時，SS與DM表面細胞活性相對3 d無明顯差別，但是接枝納米顆粒的表面細胞活性明顯增加，DM-NPV表面細胞活性明顯高于DM-NP表面，這表明納米顆粒對細胞有一定的調(diào)控作用，并且VEGF能夠較好促進內(nèi)皮細胞增殖，這與文獻報道相符合[19]。

圖9 內(nèi)皮細胞靜態(tài)培養(yǎng)1，3，5 d后CCK-8細胞活性檢測結(jié)果

Fig 9 CCK-8 result of adherent ECs on different sample surfaces after 1, 3 d culture

2.4 分析與討論

肝素作為天然的抗凝劑，已經(jīng)廣泛應用于臨床。近幾年的研究表明，由于肝素具有能夠與蛋白、生長因子特異性結(jié)合的基團，使其具有較好抑制平滑肌增生、抗炎以及促進內(nèi)皮化的效果[20-22]。本文利用肝素與多聚賴氨酸靜電結(jié)合作用，制成如圖1所示的三維載VEGF的Hep-PLL納米顆粒。利用不銹鋼表面多巴胺暴露出來的醌基與納米顆粒中多聚賴氨酸暴露出來的氨基發(fā)生邁克爾加成與西弗堿反應，成功構(gòu)建出裝載VEGF的Hep-PLL納米顆粒改性層。在前期的研究中表明,在DM-NPV改性表面，肝素與VEGF的釋放都得到較好的控制[17]，表明在持續(xù)釋放一定時間后，接枝納米顆粒的表面仍會暴露出一定量肝素。因此，在釋放5和15 d后，接枝納米顆粒的表面仍具有較好的抗凝效果，如圖7所示。較好的抗凝效果是材料表面內(nèi)皮化的前提，由圖8與9可以看出，相對于SS與DM，固定DM-NP的表面細胞數(shù)量明顯下降，且細胞呈皺縮，細胞活性較差，這是由于ECs對肝素較敏感，較高的肝素含量使得樣品表面電負性增強，不利于細胞的粘附。由于內(nèi)皮細胞自身增殖能力有限，因此在不存在生長因子VEGF時，細胞的CCK-8細胞活性下降，預示細胞出現(xiàn)了一定程度的凋亡，如圖9所示。第3及5 d時，DM-NPV表面細胞活性明顯高于DN-NP表面，表明VEGF具有抑制ECs凋亡的作用。雖然與SS和DM表面相比，DM-NPV表面ECs生長并不理想，但是相對于DM-NP表面，具有明顯的促內(nèi)皮再生的功能。

3 結(jié) 論

(1) 借助多巴胺，構(gòu)建的載VEGF的肝素-PLL納米顆粒成功固定于316L不銹鋼表面。

(2) 接枝納米顆粒的表面不僅具有較好的抗凝效果(1 h)，并且在浸泡一定時間(0，5和15 d)后，樣品表面依然保持良好的持續(xù)抗凝血性。

(3) 接枝納米顆粒的表面內(nèi)皮細胞生物學行為(數(shù)量、形態(tài)和活性)良好，具促內(nèi)皮再生能力，為心血管材料表面生物功能化提供了一種新方法。

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Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031,China;2.Jiangsu Provincial Key Laboratory for Interventional Medical Devices,

Huaiyin Institute of Technology, Huai’an 223003,China)

Thesurface construction by heparin-poly-l-ly-sine (Hep-PLL) nanoparticles loaded VEGF and the influence to anti-coagulation and endothelial regeneration

TAN Jianying1，LIU Tao2，CHEN Junying1，HUANG Nan1

(1.Key Laboratory of Advanced Technology of Materials, Ministry of Education,

The ideal biomaterials surface for the blood or vascular contacting should be hemocompatibility and endothelialization ability. This study focuses on improving the anti-coagulation and endothelial regeneration of 316L stainless steel (316L SS) surface by introduced VEGF-loaded heparin-poly-l-lysine (Hep-PLL) nanoparticles to its surface. The VEGF-loaded nanoparticles (NPV) were firstly constructed by electrostatic interactions. And the NPV were then immobilized on dopamine-coated 316L SS surface. The physicochemical properties of the modified surface were characterized by water contact angle assay, Alcian blue staining and toluidine blue O assay, etc. The adhesion behavior and morphology of platelets on the modified surfaces were evaluated by fluorescence staining and scanning electron microscope (SEM). The clotting time were tested by APTT. The endothelial cell growth behaviors were evaluated by fluorescent staining and Cell Counting Kit-8 (CCK-8). The results revealed that the NPV were successfully immobilized onto 316L SS surface. The introduction of the loaded-VEGF nanoparticles obviously increased the blood compatibility due to the less platelet adhesion compared to the 316L SS surface. The modified surface also provided favorable endothelial regeneration according to the endothelial cells adhesion, proliferation and its biological activity based the CCK-8 measurements. Meanwhile, the modified surface still exhibited exciting antithrombogenic properties after immersed in PBS solutions for 5 and 15 d. Our results indicated that the surface modification of loaded VEGF heparin-poly-l-ly-Sine (Hep-PLL) nanoparticles could be a promising strategy for cardiovascular contacting device.

VEGF; nanoparticles; endothelial cells; anticoagulation

1001-9731(2016)12-12097-07

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(2011CB606204);國家自然科學基金資助項目(31470921,31170916)

2016-04-14

2016-08-30 通訊作者：陳俊英，E-mail: chenjy@263.net

譚建英 (1989-)，女，四川營山人，在讀碩士，師承陳俊英教授，從事生物材料表面改性研究。

R54；TH77

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.12.015