張 良，譚銘浩，陽(yáng)范文，朱繼翔，田秀梅，陳曉明

(廣州醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系， 廣州 511436)

3層結(jié)構(gòu)抗菌型牙槽骨修復(fù)膜的制備和檢測(cè)＊

張 良，譚銘浩，陽(yáng)范文，朱繼翔，田秀梅，陳曉明

(廣州醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系， 廣州 511436)

設(shè)計(jì)和制備一種適合口腔牙槽骨缺損修復(fù)的多層功能膜。利用溶液鋪展法和靜電紡絲法制備3層多功能膜；通過(guò)掃描電鏡得到修復(fù)膜微觀形貌結(jié)果，力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果得到拉伸強(qiáng)度為6.5 MPa；進(jìn)行模擬體液的藥物釋放發(fā)現(xiàn)釋放時(shí)間可持續(xù)3 d。結(jié)果表明，3層多功能膜引入致密PCL層獲得更高的機(jī)械強(qiáng)度，添加明膠抗菌層獲得了抗菌功能。

牙槽骨修復(fù)；骨引導(dǎo)；屏障作用；抗菌

0 引 言

如今，口腔健康問(wèn)題越來(lái)越受人們的關(guān)注，口腔問(wèn)題中以牙槽骨缺損最為嚴(yán)重，為了恢復(fù)骨組織的正常功能，臨床將引導(dǎo)骨再生作為重要的治療手段，牙槽骨缺損的引導(dǎo)再生成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)[1]。種植義齒，需要對(duì)牙槽骨進(jìn)行病理消除和槽骨增量，這也要利用引導(dǎo)骨再生技術(shù)[2-3]。

在牙槽骨缺損的自我修復(fù)過(guò)程中，牙周膜細(xì)胞生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)大于骨細(xì)胞，這樣造成牙周膜細(xì)胞長(zhǎng)入牙槽骨缺損部位，阻礙骨組織的生長(zhǎng)和修復(fù)[4]。通過(guò)生物工程膜對(duì)兩種組織進(jìn)行隔離，使牙周組織不能長(zhǎng)入，并且引導(dǎo)骨細(xì)胞生長(zhǎng)，修復(fù)骨缺損[5]。發(fā)揮隔離、引導(dǎo)作用的膜稱(chēng)為引導(dǎo)骨再生膜(GBR膜)[6]。

如今臨床中使用的Bio-gide膜、海奧口腔修復(fù)膜等都具有雙層功能體系，致密膠原層起到屏蔽隔離作用，而疏松層則引導(dǎo)骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，這些修復(fù)膜主要是動(dòng)物膠原膜[7-8]。近幾年研究的高分子可降解膜也采取了雙層功能體系，通過(guò)材料的復(fù)合和多層化，以達(dá)到修復(fù)膜的多功能化。Marco C. Bottino等使用靜電紡絲法制成多層膜，設(shè)計(jì)成三明治結(jié)構(gòu)，在雙層的結(jié)構(gòu)上添加了消炎滅菌層，使修復(fù)膜獲得抗菌功能[9]。

但是，現(xiàn)研究的可降解膜存在降解快、機(jī)械強(qiáng)度不夠等問(wèn)題，這類(lèi)屏障膜進(jìn)行牙槽骨修復(fù)時(shí)會(huì)發(fā)生膜塌陷。本文通過(guò)對(duì)致密中層結(jié)構(gòu)的引入，以期能夠在不增加厚度的條件下，達(dá)到更高的機(jī)械強(qiáng)度和合適的降解速度[10]。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

PCL，分子量8×104，深圳市光華偉業(yè)實(shí)業(yè)有限公司；明膠，阿拉丁，膠強(qiáng)度約250 g Bloom；納米羥基磷灰石，阿拉丁，大于等于97%，小于100 nm；戊二醛，25%，天津市福晨化學(xué)試劑廠；六氟異丙醇，鄭州阿爾法化工有限公司。

靜電紡絲機(jī)，深圳通力微納；萬(wàn)能電子試驗(yàn)機(jī)，深圳新三思儀器有限公司CMT7503；掃描電子顯微鏡，日本Hitachi S-3400N Ⅱ型；傅立葉紅外光譜儀，布魯克TENSOR27；超微量分光光度計(jì)，Thermo Scientific NanoDropTM2000。

1.2 3層多功能膜的設(shè)計(jì)

本文設(shè)計(jì)的膜為3層結(jié)構(gòu)(圖1)，中層為致密的屏障層，內(nèi)層為靜電紡絲制備的疏松纖維引導(dǎo)骨再生層，外層是紡絲纖維抗菌層。聚己內(nèi)酯(PCL)可降解，其降解速度恰當(dāng)，為6個(gè)月左右，其親水性差，作為中層膜能起到有效的阻隔作用。

圖1 3層多功能膜的設(shè)計(jì)圖

而引導(dǎo)膜的內(nèi)層與細(xì)胞接觸，加入明膠調(diào)節(jié)親水性使細(xì)胞能粘附生長(zhǎng)；膜的內(nèi)層與骨缺損部位接觸，復(fù)合納米羥基磷灰石(nHA)可促進(jìn)骨生長(zhǎng)。膜的外層與手術(shù)傷口接觸，是易感染區(qū)，載入抗菌藥物緩釋?zhuān)苡行Э刂萍?xì)菌感染。

1.3 多層功能膜的制備

1.3.1 多層功能膜制備

nHA/PCL/明膠復(fù)合內(nèi)層，m(明膠)/m(PCL)=1∶1的六氟異丙醇溶液中分別混入20%，50%和80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))nHA，進(jìn)行靜電紡絲(靜電紡絲的參數(shù)，溶液濃度5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，電壓為8 kV，接收距離為15 cm，注射速度1 mL/h，得到納米纖維膜。

致密PCL中層，將PCL的六氟異丙醇溶液倒在玻璃板上，并用玻璃片圍住周邊，晃動(dòng)玻璃板使溶液盡量鋪展，控制膜的最終厚度為0.04～0.06 mm。

外層明膠外層，配制5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))明膠的六氟異丙醇溶液，進(jìn)行靜電紡絲獲得納米纖維膜，在該溶液加入替硝唑進(jìn)行靜電紡絲，可得負(fù)載藥物的納米纖維膜。

3層多功能膜，先制備PCL致密膜，再在該膜的一面通過(guò)靜電紡絲制備明膠層，真空干燥24 h；最后，翻轉(zhuǎn)在另一面靜電紡絲制備含nHA的內(nèi)層，真空干燥24 h，保存。

1.3.2 明膠纖維層的交聯(lián)

將10 mL的25%戊二醛水溶液倒入培養(yǎng)皿中，然后將培養(yǎng)皿放入干燥器底部，樣品膜放在干燥器的孔盤(pán)上，蓋上干燥器蓋子，利用蒸汽對(duì)薄膜進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)時(shí)間分為1，2和12 h等。結(jié)束后真空干燥。

1.4 性能測(cè)試

1.4.1 形貌表征

用數(shù)碼照相機(jī)對(duì)樣品膜表面進(jìn)行拍攝取照，進(jìn)行宏觀觀察；用掃描電子顯微鏡對(duì)樣品膜表面微觀形貌、纖維結(jié)構(gòu)和樣品膜的截面層狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行微觀觀察和分析。

1.4.2 親水性和溶脹率

將水滴滴在樣品膜上，60 s后照相，通過(guò)軟件測(cè)定照片中水滴的高度h和水滴與膜接觸面的直徑d。利用式(1)得到靜態(tài)接觸角[11]

(1)

用電子分析天平稱(chēng)取0.0500 g左右的樣品膜(重Ma)，浸泡在20 mL PBS液中24 h，達(dá)到溶脹平衡，然后再將樣品膜取出，用濾紙輕輕擦去膜表面溶劑，迅速稱(chēng)重Mb。按式(2)計(jì)算溶脹率[12]

(2)

1.4.3 力學(xué)性能測(cè)試

將樣品膜用磨具切割成啞鈴型，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量樣品細(xì)長(zhǎng)部位的寬度和厚度。用萬(wàn)能電子試驗(yàn)機(jī)測(cè)得樣品膜的拉伸力和斷裂強(qiáng)度。

1.4.4 藥物的紅外分析及釋放

使用紅外光譜儀用透射法測(cè)得替硝唑粉末的紅外光譜圖，用反射法測(cè)得薄膜的紅外光譜圖。

取載藥明膠層0.0100 g置于20 mL PBS液中， 37 ℃,60 r/min條件下進(jìn)行藥物釋放，在前12 h每1 h取樣一次，之后每12 h取樣1次，持續(xù)1周， 取樣時(shí)先取1 mL，再補(bǔ)充1 mL PBS液。最后，用超微量分光光度計(jì)對(duì)所得釋放液進(jìn)行藥物的定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 3層多功能膜各層的宏觀觀察和微觀顯貌

圖2為相同比例的PCL/明膠中，含20%，50%和80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) nHA的纖維膜掃描電鏡圖。從圖2比較看出，隨著nHA的增加，纖維上的顆粒也在逐漸增加，而PCL/明膠含量的減少，纖維得到了更強(qiáng)的拉伸，纖維的直徑不斷減小。當(dāng)nHA含量為80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，可靜電紡絲成纖維膜，但該纖維膜nHA過(guò)多，物理摩擦?xí)?dǎo)致磷灰石粉末脫落，不適合實(shí)際應(yīng)用。nHA的含量及形貌是內(nèi)層引導(dǎo)骨再生的關(guān)鍵因素，含50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) nHA的纖維膜在含量和均勻度優(yōu)于20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的纖維膜，因此選擇含50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的nHA纖維膜作為多功能膜的引導(dǎo)骨再生層。

圖2 不同nHA含量的復(fù)合纖維膜的掃描電鏡圖

圖3為溶液鋪展制備的致密PCL膜和靜電紡絲法制備的纖維PCL膜的掃描電鏡圖。從圖3可以看出，致密PCL基本沒(méi)有空隙，與液體接觸面積遠(yuǎn)低于纖維PCL。中層的主要功能是物理屏蔽、支撐空間，則其關(guān)鍵因素為機(jī)械強(qiáng)度，從微觀結(jié)構(gòu)可以判斷致密PCL膜強(qiáng)度要大于纖維PCL膜，而且通過(guò)后續(xù)的機(jī)械性能測(cè)試也證實(shí)了此判斷。

圖3 不同制備方式的PCL膜的掃描電鏡圖

3層多功能膜的外層被設(shè)計(jì)為載藥抗菌層，它在牙槽骨修復(fù)的應(yīng)用中與牙周纖維組織接觸。多功能膜的使用環(huán)境為水環(huán)境，需要對(duì)明膠纖維交聯(lián)以避免在水中溶解，交聯(lián)后的微觀形貌如圖4所示。明膠在沒(méi)有交聯(lián)時(shí)，纖維直徑較小，纖維之間粘結(jié)低，但是隨著交聯(lián)時(shí)間的增加，交聯(lián)程度增加，纖維直徑有較大的增加，纖維之間粘結(jié)加強(qiáng)，交聯(lián)12 h后，很難發(fā)現(xiàn)有清晰纖維。

圖4 不同交聯(lián)時(shí)間的明膠纖維膜的掃描電鏡圖

圖5為3層功能膜的截面微觀形貌，膜的截面厚度有120 μm，明膠抗菌外層厚度約為25 μm，致密PCL屏障中層約為60 μm，nHA引導(dǎo)內(nèi)層約為35 μm。目前，應(yīng)用中的引導(dǎo)膜bio-gide膜的厚度為50 μm、海奧口腔修復(fù)膜為100 μm，本文膜的厚度為120 μm，三者接近，可以判斷在牙槽骨修復(fù)手術(shù)中，不會(huì)因?yàn)?層功能膜厚度引起患者的不適感。

2.2 多層功能膜各層親水性改善及溶脹率的比較

親水性是評(píng)價(jià)醫(yī)用植入材料的指標(biāo)，它關(guān)系到細(xì)胞對(duì)材料的粘附程度，一般認(rèn)為親水性好的材料表面有利于細(xì)胞粘附生長(zhǎng)。圖6(a)為PCL復(fù)合明膠改變親水性的靜態(tài)接觸角圖，PCL纖維膜的靜態(tài)接觸角為95.2°，親水性較差；50%PCL/明膠纖維膜的靜態(tài)接觸角為46.7°，親水性良好，且不溶解，可作為復(fù)合nHA的材料。圖6(b)為明膠交聯(lián)前后的靜態(tài)接觸角圖，明膠無(wú)交聯(lián)纖維的靜態(tài)接觸角為33.6°，但是水滴會(huì)在幾分鐘后發(fā)生溶透，明膠纖維能溶于水，不適合在口腔中使用；明膠交聯(lián)12 h的纖維膜靜態(tài)接觸角為87.1°，親水性較弱不利于細(xì)胞粘附；明膠交聯(lián)1 h的纖維膜靜態(tài)接觸角為44.7°，親水性良好，且不溶于水，達(dá)到了水環(huán)境下使用的要求。

多層功能膜作為植入材料，在水環(huán)境下的溶脹程度對(duì)患者植入后感覺(jué)有重要影響。3層多功能膜和各層膜在PBS溶液中的溶脹率大不相同，如圖7所示，內(nèi)層膜的溶脹率為308.2%，吸水量最高，這主要是nHA的吸水作用及靜電紡絲纖維的多孔結(jié)構(gòu)造成的；靜電紡絲纖維PCL膜的溶脹率為199.4%，遠(yuǎn)高于致密型PCL膜的0.6%，靜電紡絲的多孔結(jié)構(gòu)起到主要的作用；交聯(lián)1 h的電紡明膠纖維膜的溶脹率為160.2%，交聯(lián)12 h的電紡明膠纖維膜為99.8%，交聯(lián)作用使纖維膜中的孔隙減小，明膠的溶脹能力也減弱；PHG 3層多功能膜(中層為致密PCL，外層為交聯(lián)1 h的載藥電紡明膠纖維和內(nèi)層為m(nHA)/m(PCL)/m(明膠)為2∶1∶1的復(fù)合纖維)的溶脹率為64.4%，其整體溶脹率不高，不會(huì)出現(xiàn)在植入患者后過(guò)于腫脹的現(xiàn)象。

圖5 3層功能膜截面的掃描電鏡圖

圖6 幾種纖維膜的靜態(tài)接觸角(n=5)

2.3 多功能膜的力學(xué)性能

力學(xué)測(cè)試結(jié)果如表1所示，PCL致密膜強(qiáng)度為13.7 MPa，遠(yuǎn)大于PCL靜電紡絲纖維膜的1.5 MPa；以致密PCL膜為中層的3層多功能膜強(qiáng)度為6.5 MPa、抗拉伸力5.2 N；也遠(yuǎn)大于3層纖維膜(中層為PCL靜電紡絲纖維、內(nèi)層為nHA/PCL/明膠復(fù)合靜電紡絲纖維、外層為明膠載藥?kù)o電紡絲纖維)的1.6 MPa和3.8 N。引入中層致密PCL膜增強(qiáng)了多功能膜力學(xué)強(qiáng)度，優(yōu)化了屏障功能。

圖7 幾種膜在PBS溶液中的溶脹率 (n=5)

Fig 7 Swelling ratios of membranes in PBS solution (n=5)

表1中PCL致密膜兩面進(jìn)行靜電紡絲，制備成3層多功能膜的拉伸力卻下降了。這是因?yàn)?層結(jié)構(gòu)為溶劑粘合，當(dāng)紡絲液噴射在PCL致密膜上時(shí)，溶劑不能蒸發(fā)完全，造成了PCL膜的輕微溶解，出現(xiàn)溶痕、紋痕；特別是靜電紡絲nHA引導(dǎo)骨再生層時(shí)，nHA顆粒含有大量溶劑，造成PCL致密膜眾多點(diǎn)痕，不再平整，3層多功能膜在拉伸時(shí)有了應(yīng)力點(diǎn)，反而更容易斷裂，拉伸力和斷裂生長(zhǎng)率下降。

2.4 3層多功能膜載藥的紅外分析及藥物釋放

表1 多功能膜的力學(xué)性能

圖8 負(fù)載替硝唑的明膠紅外譜圖

圖9 替硝唑分子式

圖10為替硝唑/明膠纖維膜中替硝唑7 d的累積釋放曲線，從曲線上可以看出，前8 h，藥物出現(xiàn)突釋?zhuān)? h時(shí)累積釋放率已經(jīng)接近50%。在12 h后，進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的釋放階段，持續(xù)到第60 h，釋放了大量藥物。最后在72 h左右釋放達(dá)到最大值，累計(jì)釋放率達(dá)到90%，釋放完畢。在口腔手術(shù)完成后的恢復(fù)過(guò)程中，前8 h階段快速釋放大量替硝唑滅殺細(xì)菌；隨后在2～3 d中持續(xù)釋放一定濃度的藥物，起到抗菌效果；當(dāng)3 d后，傷口基本愈合，不會(huì)再有細(xì)菌進(jìn)入，治療度過(guò)易感染期[14]。這種釋放規(guī)律是符合手術(shù)后的愈合過(guò)程。

圖10 負(fù)載替硝唑的明膠膜在PBS液中的釋放曲線(n=5)

Fig 10 Release curves of gelatin membrane with tinidazole in PBS (n=5)

3 結(jié) 論

針對(duì)口腔修復(fù)膜所存在的問(wèn)題，對(duì)引導(dǎo)骨再生膜進(jìn)行了中層致密結(jié)構(gòu)引入，成功制備了新型的3層多功能膜。中層致密的設(shè)計(jì)使3層多功能膜的力學(xué)強(qiáng)度有了很大提高，達(dá)到6.5 MPa，強(qiáng)化了修復(fù)膜的屏障功能。外層明膠抗菌纖維膜的替硝唑釋放可持續(xù)3 d，能夠滿(mǎn)足牙槽骨修復(fù)手術(shù)的抗菌需求。3層多功能膜各層間結(jié)合良好，無(wú)間隙；各膜層的親水性合適于細(xì)胞粘附。總體溶脹率為64.4%，并且膜的厚度為0.12 mm，能夠滿(mǎn)足人體感受要求。

[1] Blanco J, Alonso A, Sanz M. Long-term results and survival rate of implants treated with guided bone regeneration: a 5-year case series prospective study [J]. Clin Oral Implants Res, 2005,16(3):294-301.

[2] Geurs N, Vassilopoulos P, Reddy M. Soft tissue considerations in implant site development [J]. Oral Maxillofac Surg Clin North Am, 2010, 22(3):387-405.

[3] Meng Waiyan, Zhou Yanmin, Chu Shunli, et al. The restoring capability of bone defects around BLB implants—an histological investigation [J]. Journal of Modern Stomatology, 2009,23 (2): 124-127.

孟維艷，周延民，儲(chǔ)順禮，等. 種植體周不同骨量缺損修復(fù)的組織學(xué)研[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2009,23(2):124-127.

[4] Kahnberg K, Rasrnusson L, Zellin G. Bone grafting techniques for maxillary implants [M]. Iwate-ken: Blackwell Munksgard, 2005.

[5] Oh T, Meraw S, Lee E, et al.Comparative analysis of collagen membranes for the treatment of implant dehiscence defects[J]. Clin Oral Implants Res, 2003,14(1):80-90.

[6] Gentile P, Chiono V, Tonda-Turo C, et al. Polymeric membranes for guided bone regeneration[J]. Biotechnology Journal, 2011,6(10):1187-1197.

[7] Yuya T, Norio A, Masayoshi N, et al. A histological evaluation for guided bone regeneration induced by a collagenous membrane[J].Biomaterials,2005,26(31): 6158-6166.

[8] Wang Xingsong. Analysis of dental restorative materials for bone regeneration guided bone regeneration [J]. Guide of China Medicine, 2014,(04):172-173.

王杏松. 口腔修復(fù)膜材料在牙種植中引導(dǎo)骨再生中的應(yīng)用分析[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南,2014,(04):172-173.

[9] Marco C, Vinoy T, Gregg M. A novel spatially designed and functionally graded electrospun membrane for periodontal regeneration[J]. Acta Biomaterialia, 2011,(7): 216-224.

[10] Swetha M, Sahithi K, Moorthi A, et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering [J]. Int J Biol Macromol,2010,47(1): 1-4.

[11] Xu Gang, Yang Jueming, Chen Ping. Measurement of contact angle of complex hydrophobic thin films [J]. Journal of Xi’an Institute of Technology, 2004,(01):65-69.

許 崗,楊覺(jué)明,陳 平. 疏水復(fù)合薄膜接觸角的測(cè)定[J]. 西安工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,(01):65-69.

[12] Hosseini S, Rezaei M, Zandi M, et al. Preparation and functional properties of fish gelatin-chitosan blend edible films[J]. Food Chemistry, 2013,136(3-4): 1490-1495.

[13] Ling Zhigang, Tang Yanlin, Li Tao, et al. Study on the structure and spectra of metronidazole tinidazole and ornidazole[J]. Journal of Atomic and Molecular Physics, 2013,30(4):553-558.

凌智鋼，唐延林，李 濤，等. 甲硝唑、替硝唑和奧硝唑的結(jié)構(gòu)與光譜[J]. 原子與分子物理學(xué)報(bào)，2013,30(4):553-558.

[14] Lu Yanghui, Chen Yongji, Luo Zhixiao，et al. The application of guided bone regeneration of e-PTFE membrane on behalf of Bio-oss bone substitutes in dental implant surgery [J]. J Clin Stomatol, 2014,30(2):99-101.

盧楊輝，陳永吉，羅志曉，等. e-PTFE 膜聯(lián)合Bio-oss骨代材料在種植手術(shù)中引導(dǎo)骨再生的應(yīng)用研究[J]. 臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(2):99-101.

Preparation of three-layered membrane for antimicrobial and alveolar bone regeneration

ZHANG Liang，TAN Minghao，YANG Fanwen，ZHU Jixiang，TIAN Xiumei，CHEN Xiaoming

(Department of Biomedical Engineering, Guangzhou Medical University,Guangzhou 511436,China)

This paper design a multifunctional alveolar bone regeneration membrane. Preparation the three-layered membrane by solution spreading and electrospinning. The microstructure observation was carried out by scanning electron microscopy (SEM); the three-layered structure demonstrated higher strength (6.5 MPa); the drug release showed sustainable 3 d time. The results testified that it is promising for use in alveolar bone regeneration.

alveolar bone repair; bone guide; barrier function; antimicrobial

1001-9731(2016)12-12240-06

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013B010402019)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015A030310345)；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目(A2015352)

2016-03-11

2016-06-08 通訊作者：陳曉明，E-mail: xmchenw@126.com

張 良 (1989-)，男，湖南常德人，在讀碩士，師承陳曉明教授，從事生物醫(yī)用材料研究。

TB34

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.12.042