任明保,李 揚,趙金輝,劉 晶

熒光定量16SrRNA基因檢測診斷婦產(chǎn)科菌血癥的應(yīng)用價值

任明保1,李 揚1,趙金輝2,劉 晶2

目的 評價熒光定量16SrRNA基因檢測診斷婦產(chǎn)科患者菌血癥的應(yīng)用價值。方法 2013-01至2014-12對100例疑為全身感染處于菌血癥狀態(tài)的住院分娩孕產(chǎn)婦進行常規(guī)血液培養(yǎng)，同時行細菌16SrRNA基因檢測，包括DNA提取、設(shè)計引物和探針、PCR擴增及對擴增產(chǎn)物熒光定量檢測，以臨床診斷及血液培養(yǎng)陽性菌血癥作為對照，計算診斷陽性率、敏感性和特異性，數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果 熒光定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)菌血癥陽性的患者44例，陽性率為44%，明顯高于血液培養(yǎng)的15%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；以臨床診斷及血液培養(yǎng)陽性菌血癥作為對照，熒光PCR的診斷敏感性為87.9%，特異性為90.6%。結(jié)論 熒光定量16SrRNA基因檢測的陽性率遠高于血液培養(yǎng)，可為孕產(chǎn)婦患者感染提供早期、敏感的病原學(xué)診斷依據(jù)。

16SrRNA；孕產(chǎn)婦；菌血癥；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

感染是婦產(chǎn)科患者圍術(shù)期和圍分娩期常見的并發(fā)癥，病原菌侵入血液通過血行播散到體內(nèi)各部位可造成菌血癥，全身表現(xiàn)有發(fā)熱，寒戰(zhàn)，乏力等；局部表現(xiàn)有傷口紅腫，滲液，化膿等。如不及時治療可能會危及生命，因此要求早期快速準確診斷菌血癥。目前用于檢測血液感染細菌的方法主要是進行血液培養(yǎng)，但其缺點是所需時間長、陽性率低、因一次采血量較大患者的依從性也差。我們對100例住院分娩疑似感染處于菌血癥狀態(tài)的患者,在進行血液培養(yǎng)的同時應(yīng)用熒光定量 PCR方法(PCR)檢測細菌的16S rRNA基因，16SrRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，其集保守性與變異性于一身， 是目前應(yīng)用最廣泛的分子微生物學(xué)檢測的靶基因[1,2]，希望通過此項研究探索婦產(chǎn)科菌血癥患者的早期診斷方法和治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2013-01至2014-12疑似處于菌血癥感染狀態(tài)的患者100例。菌血癥診斷指南，分為臨床診斷血液感染和血液培養(yǎng)陽性作為確診血液感染，臨床診斷血液感染依據(jù)2001年國家衛(wèi)計委《醫(yī)院感染診斷標準》血液感染的臨床診斷[3]。

1.2 試劑與儀器 血液培養(yǎng)檢測采用美國BD公司9240全自動血液培養(yǎng)儀。熒光PCR檢測采用ABI7300熒光定量PCR分析儀， PCR引物和探針依據(jù)細菌16S rRNA基因保守區(qū)域，均由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒童醫(yī)院中心實驗室合成。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922,金黃色葡萄球菌ATCC25923，菌株均購于衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 無菌條件下，取待檢血液標本50 μl，分別加到1.5 ml離心管中；加入DNA提取液(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽pH 7.6，5 mmol/L乙二胺四乙酸，0.5%十二烷基硫酸鈉)50 μl，振蕩充分混勻，37 ℃搖床搖勻30 min后置100 ℃干浴10 min, 12 000 r/min，離心5 min，取上清液備用。

1.3.2 引物與探針 選擇細菌16S rRNA基因高保守的區(qū)域設(shè)計引物，在該引物的片段范圍內(nèi)，通過MegAlign分析軟件分別設(shè)計針對所有細菌共有的通用探針，對革蘭陽性菌特異的革蘭陽性探針，對革蘭陰性菌特異的革蘭陰性探針。引物序列：上游引物(P690F)： TGTGTAGCGGTGAAATGCG (690～708 bp)；下游引物(P829R)： CATCGTTTACGGCGTGGAC(829～811 bp)。

1.3.3 PCR 抽取上清液2 μl作為模板，在ABI 7300檢測儀按下列程序進行PCR反應(yīng): 94 ℃預(yù)變性2 min后，94 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s為一個循環(huán)，共循環(huán)40次。每次PCR循環(huán)均設(shè)陽性和空白對照。陽性對照為大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCCC25923；空白對照不加DNA模板。

1.3.4 結(jié)果報告 將baseline曲線start值設(shè)置為7～18，熒光值設(shè)置為4000，使correlation數(shù)值介于-1.0～-0.97，F(xiàn)AM通道為革蘭陽性菌，VIC通道為革蘭陰性菌。PCR完畢計算CT 值 (Cycle Threshold)，以CT值<35判定為陽性。

1.3.5 血液培養(yǎng) 采用臨床常規(guī)血液培養(yǎng)方法。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件，計數(shù)資料采用絕對數(shù)和率的形式表達，率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 16S rRNA基因檢測結(jié)果 100份標本中，基于16S rRNA基因的PCR方法的檢測陽性44例，陽性率為44%。

2.2 PCR方法與血液培養(yǎng)檢測結(jié)果的比較 100份標本中，血培養(yǎng)陽性16例，陽性率為16%，遠低于PCR的44%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。

表1 婦產(chǎn)科菌血癥PCR方法與血液培養(yǎng)檢測結(jié)果比較

2.3 PCR方法與臨床診斷指標的結(jié)果比較 100例中，基于臨床診斷指標的陽性患者37例，陽性率為37.0%，低于PCR的檢測陽性率44%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表2)。

表2 婦產(chǎn)科菌血癥PCR方法與臨床診斷指標的比較

2.4 診斷指標 若以臨床診斷且血液培養(yǎng)陽性作為菌血癥診斷作對照，PCR的診斷敏感性為87.9%，診斷特異性為90.6%。

3 討 論

臨床診斷婦產(chǎn)科菌血癥的感染缺乏特異性的指標，血液培養(yǎng)雖然是菌血癥的金標準，但其所需時間長，在出現(xiàn)臨床癥狀后的數(shù)天才能發(fā)出報告，從而導(dǎo)致患者的依從性相對較差，而且，由于抗生素的廣泛使用，血培養(yǎng)的陽性率也不高，因此不能滿足臨床上的要求，尤其對于臨床癥狀嚴重如高熱不退、合并其他系統(tǒng)癥狀可能存在復(fù)合感染的婦產(chǎn)科住院患者，甚至引起不必要的恐慌。目前臨床診斷菌血癥多依靠患者的臨床表現(xiàn)，2001年國內(nèi)衛(wèi)生部發(fā)布了《醫(yī)院感染診斷標準》作為國內(nèi)醫(yī)院院內(nèi)感染臨床診斷的試行指南，其中血液感染部分對菌血癥的臨床診斷做出具體規(guī)定，包括發(fā)熱時體溫>38 ℃或低體溫<36 ℃，可伴有寒戰(zhàn)，同時合并有下列情況之一：(1)有入侵門戶或遷徙病灶；(2)有全身中毒癥狀而無明顯感染灶；(3)有皮疹或出血點、肝脾腫大、粒細胞核左移，且無其他原因可解釋；(4)收縮壓<90 mmHg或較原收縮壓下降超過40 mmHg。但是這些感染指標均存在特異性不足的問題，若做出病原學(xué)診斷須在臨床診斷基礎(chǔ)上，符合下述兩條之一才可做出：(1)血液培養(yǎng)分離出病原微生物；(2)血液中檢測到病原體的抗原物質(zhì)。因此婦產(chǎn)科臨床工作中對重癥感染的診斷常常面臨較大的壓力。

在檢索相關(guān)文獻后我們進行此項研究，以國內(nèi)浙江大學(xué)兒童醫(yī)院專利試劑盒為模板，在細菌16S rRNA基因保守區(qū)內(nèi)所建立的PCR分子生物學(xué)方法可檢測所有細菌的16S rRNA基因片段[3，4]。本研究表明，該方法具有高度的特異性與敏感性，而且檢測快速，從采集標本到PCR擴增只需4～6 h即可完成，而通常血液培養(yǎng)至少需要3～5 d，從而顯著提高了工作效率。

本試驗證明，若以臨床診斷且血液培養(yǎng)陽性作為血液感染對照，PCR方法的診斷敏感性為87.9%,診斷特異性為90.6%，說明基于16S rRNA基因的PCR方法是一種快速準確具有潛力和價值的診斷方法。同時，通過分別合成革蘭陽性探針和革蘭陰性探針，可以進一步判斷血液感染的病原菌為革蘭陽性球菌或革蘭陰性桿菌，從而為臨床醫(yī)師有針對性的選擇抗菌藥物抗感染治療提供幫助。

本試驗的數(shù)據(jù)顯示, PCR方法的陽性率為44%，遠高于血液培養(yǎng)的陽性率16%，亦高于臨床診斷指標37.0%，說明PCR方法能夠發(fā)現(xiàn)其他方法無法查到的細菌感染。PCR方法檢測假陰性的原因可能在于PCR體系中血紅蛋白等抑制物存在較多或抽提過程中細菌DNA的丟失而導(dǎo)致PCR方法假陰性[5，6]，此外，臨床診斷指標特異性較低也可能影響最后的數(shù)據(jù)。

血液培養(yǎng)陰性及不符合臨床血液感染的患者，分析原因，可能由于：(1)存在某些特殊培養(yǎng)條件的細菌如L型細菌等或某些無法培養(yǎng)的細菌[7]；(2)臨床診斷指標亦存在假陰性的可能；(3)在PCR方法操作過程中有發(fā)生污染的可能性[8]。

綜上所述，16S rRNA基因熒光定量PCR方法可為婦產(chǎn)科患者血液感染提供早期、敏感的病原學(xué)診斷依據(jù)，具有較大的臨床應(yīng)用前景。但是，由于本試驗只涉及細菌引起的血液感染，對真菌、病毒、支原體屬、衣原體屬等其他病原體引起的血液感染尚不能提供診斷幫助。血培養(yǎng)依然是血液感染最為重要的金標準，熒光定量PCR方法不能替代傳統(tǒng)的血液培養(yǎng)方法，其對臨床診斷的幫助還需要進一步的研究。

致謝：感謝首都兒科研究所分子研究室王建華教授對此項研究所給予的大力支持和幫助。

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(2016-07-20收稿 2016-09-10修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Applicability of PCR methods based on 16S rRNA genes to diagnosis of infections in gynecological and obstetric patients

REN Mingbao1, LI Yang1, ZHAO Jinhui2, and LIU Jing2.1.Department of Obstetrics One，2.Department of Clinical Laboratory，Beijing Obstetric and Gynecology Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100026, China

Objective To develop a PCR method based on 16S rRNA genes for the diagnosis of infections among gynecological and obstetric patients in order to improve the efficiency and accuracy of bacterial detection.Methods 100 patients suspected with blood infections had their blood cultured and bacterial 16S r RNA genes were detected synchronously by extraction of DNA, primer and probe design, PCR amplification and fluorescent quantitative detection of amplified products.The positive rate, sensitivity and specificity of the two methods were compared.Results The positive rate of PCR was 44% by PCR, which was significantly higher than 15% by blood culture. Withg the criteria of positive blood culture and/or clinical diagnosis of blood infection as control, the sensitivity was 87.9% and the specificity was 90.6% for PCR.Conclusions The positive rate of PCR was significantly higher than that of blood culture and can be used as an early and sensitive index in pathogenic diagnosis of blood infections among gynecological and obstetric patients.

16S rRNA; para and grevia; blood infection; PCR

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院科研基金(201016)

任明保，博士，副主任醫(yī)師。

100026，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院：1.產(chǎn)一科,2.檢驗科

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