曾雨薇 陳學(xué)君

(1.成都七中高新校區(qū)，四川成都，610041;2.中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所，四川成都，610041)

科研與開發(fā)

超臨界CO2中的酶催化反應(yīng)

曾雨薇1陳學(xué)君2

(1.成都七中高新校區(qū)，四川成都，610041;2.中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所，四川成都，610041)

總結(jié)了超臨界CO2中脂肪酶催化反應(yīng)的最新研究進(jìn)展，主要介紹了超臨界CO2酶催化反應(yīng)新的研究方向SC-CO2IL體系，包括從分子水平上分析SC-CO2IL體系中溶解度變化及IL熔融溫度降低的原因，并列舉了近來SC-CO2IL體系在酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用情況。

SC-CO2酶催化 SC-CO2IL體系

超臨界CO2(SC-CO2)是指溫度和壓力均在其臨界點(diǎn)(31.0℃，7.38MPa)之上的CO2流體，超臨界CO2是最常用的超臨界流體之一。在SC-CO2中反應(yīng)物具有較高的擴(kuò)散度、較低的表面張力和相對(duì)較低的粘度，因此比較適用于酶催化反應(yīng)的進(jìn)行。自1985年，Hammond等[1]首先提出SC- CO2可以作為酶催化反應(yīng)介質(zhì)，隨后Nakamura[2]報(bào)道了用脂肪酶催化甘油三酯進(jìn)行酯交換反應(yīng)的研究成果。近年來，越來越多的研究成果表明：不少酶在SC-CO2內(nèi)都存在活性，而且在SC-CO2中底物更易溶解，有更快的反應(yīng)速率，此外還能簡化分離過程，并有利于加強(qiáng)酶的專一性。因此SC-CO2條件下的酶催化反應(yīng)一直是廣大科研工作者的研究重點(diǎn)，目前研究主要是對(duì)酶的穩(wěn)定性、壓力、溫度、超臨界流體流速、酶含水量、共溶劑等因素的考察。

本文總結(jié)了在SC-CO2中脂肪酶催化反應(yīng)的最新研究進(jìn)展，并重點(diǎn)介紹了酶催化反應(yīng)中的最新研究方向：SC-CO2離子液體體系。

1 超臨界CO2中脂肪酶催化反應(yīng)

超臨界狀態(tài)下的高壓對(duì)酶的活性和穩(wěn)定性既有抑制又有促進(jìn)作用，至今文獻(xiàn)報(bào)道共有25多種酶在高壓下其活性和穩(wěn)定性可得到增強(qiáng)，但各種酶的影響程度會(huì)因酶來源、壓力、溫度、溶劑、底物等的不同而有所不同。脂肪酶在自然界中作為催化酯水解的酶而廣泛存在，在有機(jī)溶劑中脂肪酶仍保留活性,在酯水解的逆反應(yīng)酯合成中活性降低，故其應(yīng)用逐漸成為人們的研究重點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物高聚物和生物柴油合成、外消旋混合物的拆分、酯交換及選擇性酰化等。因此本文選擇在高壓CO2條件下有關(guān)脂肪酶反應(yīng)加以介紹。表1總結(jié)了近年來脂肪酶分別在酯化，酯交換，酯水解，?；０坊磻?yīng)中的應(yīng)用情況。

雖然SC-CO2在酶催化反應(yīng)中呈現(xiàn)了許多優(yōu)勢(shì)，然而，底物在SC-CO2中最大溶度卻受到其溶解度的限制，而大部分反應(yīng)中的底物溶度都很小，故需要在較長時(shí)間內(nèi)才能得到一定量的產(chǎn)物[8]。

2 超臨界CO2離子液體體系中的酶催化反應(yīng)

離子液體(Ionic liquid，IL)，是指由有機(jī)陽離子和陰離子構(gòu)成的在室溫下呈液態(tài)的鹽類化合物，隨著對(duì)離子液體研究的不斷深入，科學(xué)家已將離子液體的范圍擴(kuò)展為熔點(diǎn)低于100℃的離子化合物[9]。現(xiàn)有研究表明生物酶在離子液體中可呈現(xiàn)出高穩(wěn)定性和高活性，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，離子液體具有不揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好、溶解能力強(qiáng)和結(jié)構(gòu)可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，因此運(yùn)用IL作為酶催化反應(yīng)的介質(zhì)也是現(xiàn)今學(xué)界研究的熱點(diǎn)。但此方法存在一個(gè)問題，即產(chǎn)物和離子液體的分離及離子液體的回收，當(dāng)分離IL中的反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)，卻又需要用到有毒、易揮發(fā)、易燃的有機(jī)溶劑；而用蒸餾法不適合熱敏感性體系，這樣也會(huì)使循環(huán)使用的離子液體/酶體系活性下降。

因?yàn)镾C-CO2和離子液體本身都具有各自的特殊性，極性和揮發(fā)性相差很大，于是有學(xué)者認(rèn)為將兩者結(jié)合使用的思路將增加一些其自身都不具備的性質(zhì)。而目前的研究結(jié)果已經(jīng)顯示出該體系的突出優(yōu)點(diǎn)，超臨界CO2和離子液體的結(jié)合，充分發(fā)揮了兩者在溶解性和催化反應(yīng)等方面的優(yōu)點(diǎn)，尤其是兩者間不對(duì)稱的相溶性，使反應(yīng)物系可以在相間實(shí)現(xiàn)所需的轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，減少了副反應(yīng)的發(fā)生。

2.1 SC-CO2IL體系溶解度研究

1999年，Brennecke等[10]首次報(bào)道了SC-CO2/IL體系的相行為及在分離中的應(yīng)用研究。發(fā)現(xiàn)超臨界二氧化碳在離子液體中溶解度很大，而離子液體在超臨界二氧化碳中的溶解度卻極低，可以忽略不計(jì)。近來文獻(xiàn)報(bào)道的SC-CO2IL體系溶解度研究結(jié)論如表2所示。

表1 SC-CO2條件下脂肪酶的各類催化反應(yīng)

表2 SC-CO2 IL體系相行為研究

2.2 SC-CO2IL體系分子水平研究

Kazarian et al等[14]通過ATR-IR(紅外線原位衰減全反射比)研究了兩種離子液體([bmim][PF6] 和[bmim][BF4] )中高壓CO2的行為，證明了IL中陰離子在分子水平上對(duì)CO2的溶解度有影響。CO2與陰離子形成了弱路易斯酸堿復(fù)合物，而且其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在[bmim][BF4]中的這種相互作用力比在[bmim][PF6]的強(qiáng)些，這是因?yàn)锽F4-路易斯堿性比PF6-強(qiáng)。研究還表明隨著陰離子體積的增大這種相互作用力會(huì)減小，IL中陰陽離子間的作用力影響著其自由體積的貢獻(xiàn)度，而且作用力弱的陰離子將導(dǎo)致更大的自由體積貢獻(xiàn)度。Kazarian et al[15]考察了壓力對(duì)CO2和[bmim][PF6]間相行為的影響，結(jié)果表明在70bar下CO2可使IL的熔融溫度從75℃降為50℃。Kazarian et al認(rèn)為這是由于CO2與陰離子間弱的路易斯酸堿作用，和P-F鍵與O=C=O軸垂直從而減弱了P-F鍵與陽離子間的相互作用力使得CO2具有降低IL熔融溫度的能力。Kazarian et al的早期研究也表明高壓CO2可使其它類似的IL的熔融溫度降低，這使得IL在比較溫和的溫度下應(yīng)用成為可能。

2.3 兩相體系中的酶反應(yīng)舉例

Lozanoetal[16]考察了乙烯丁酸與1-丁醇反應(yīng)合成丁酸丁酯并研究了乙烯丙酸酯與rac-1-苯基乙醇的酯交換反應(yīng)。合成丁酸丁酯反應(yīng)中分別研究在兩種IL([emim][Tf2N]與[bmim][Tf2N])中游離態(tài)與固載態(tài)生物催化劑CALB對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著溫度的升高酶比活性與選擇性都有所提高，選擇性均高于95%，轉(zhuǎn)化率均大于50%。用動(dòng)力學(xué)拆分產(chǎn)物rac-1-苯基乙醇和乙烯丙酸酯連續(xù)反應(yīng)合成(R)-1-苯乙烯丙酸酯實(shí)驗(yàn)中，以游離態(tài)CALB為催化劑分別在[emim][Tf2N]和[bmim][Tf2N]中的進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果顯示該反應(yīng)選擇性、酶活性與半衰期均要比丁酸丁酯合成反應(yīng)中的低，然而其對(duì)應(yīng)選擇性高達(dá)99.9%。隨溫度的升高選擇性有所提高，但酶比活性卻降低。另一篇Lozano et al[17]的報(bào)道指出，游離態(tài)酶在[emim][Tf2N]中初始反應(yīng)活性要比[bmim][Tf2N]中的高些，半衰期也要長些。而酶在固載態(tài)下上述參數(shù)又要比游離態(tài)的高、長些。在120℃、10MPa、[emim][Tf2N]條件下連續(xù)循環(huán)操作中固載酶活性基本無損失，產(chǎn)物選擇性達(dá)98%，而游離酶條件時(shí)隨著操作周期的延長產(chǎn)物選擇性從36%增長至98.5%。

Hernandez et al[18]研究了在負(fù)載酶的膜循環(huán)反應(yīng)器中合成丁基丙酸酯的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)是在SC-CO2IL體系介質(zhì)，固載酶的膜上涂三種不同的IL例如[bmim][PF6]、[bdimim][PF6]、[omim][PF6]分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)只使用SC-CO2時(shí)產(chǎn)物選擇性為95%，當(dāng)使用SC-CO2IL兩相體系時(shí)選擇性提高到99.5%以上。

Lozano et al[19]分別考察了在IL-正己烷和SC-CO2IL中載體對(duì)CALB的反應(yīng)活性的影響。通過吸附作用，實(shí)驗(yàn)者用特定支鏈如烷基、氨基、羧基、腈等來修飾二氧化硅載體，然后將CALB固載在12種不同的二氧化硅載體上。在兩種IL([btma][NTf2]和[toma][NTf2])條件下研究了IL-正己烷和SC-CO2IL體系中酶CALB的活性及穩(wěn)定性。結(jié)果表明：反應(yīng)中經(jīng)丁基修飾的二氧化硅載體酶活性最高，然而除第四組銨-硅載體外其余各組的選擇性均高于94%，并且對(duì)映體過量也都高于99.9%。相較只用正己烷，使用IL-正己烷體系酶活性降低了10倍，然而半衰期卻增大了6倍多，而使用SC-CO2IL體系酶活性增大了6倍。

3 總結(jié)

現(xiàn)在以超臨界CO2作為反應(yīng)介質(zhì)是生物化學(xué)反應(yīng)研究的熱點(diǎn)，本文歸納總結(jié)了些近來超臨界CO2中酶催化反應(yīng)的研究情況。另一方面，作為綠色溶劑的IL越來越受到人們的廣泛關(guān)注，現(xiàn)已有研究顯示超臨界CO2和離子液體的結(jié)合具有突出優(yōu)點(diǎn)，該體系充分發(fā)揮了兩者在溶解性和催化反應(yīng)等方面的優(yōu)點(diǎn)，尤其是兩者間不對(duì)稱的相溶性，使反應(yīng)物系可以在相間實(shí)現(xiàn)所需的轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。許多研究者也正逐步將精力轉(zhuǎn)移到探索SC-CO2IL體系對(duì)酶催化反應(yīng)的影響。但至今還未有將該技術(shù)如何應(yīng)用于工業(yè)方面的相關(guān)報(bào)道，說明該技術(shù)還存在許多可供研究改進(jìn)的地方。總之，應(yīng)用SC-CO2IL體系進(jìn)行酶催化反應(yīng)還是一個(gè)有待進(jìn)一步探索的領(lǐng)域。

[1] Hammond D A，Kaarel M,et al. Appl Biochem Biotech[J].1985,(11): 393.

[2] Nakamura K，Chi Y M,et al. Chem Eng Commun[J].1986,(45): 207.

[3] Maja Habulin, Sasa Sabeder, et al. Enzymatic synthesis of sugar fatty acid esters in organic solvent and in supercritical carbon dioxide and their antimicrobial activity[J].Supercritical Fluids,2009,(45):338-345.

[4] Tahmina Yasmin, Tao Jiang,et al.Transesterification reaction catalysed by Novozym435 in supercritical carbon dioxide[J].Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,2006,(41):27-31.

[5] Nagesha K, Guthalugu, Manohar Balaraman,et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of triglycerides in soy deodorized distillate with supercritical carbon dioxide[J].Biochemical Engineering Journal,2006,(29):220-226.

[6] Kuan-Ju Liu, Kuan-Miao Liu,et al. Biocatalytic synthesis of palmitoyl vanillylamide in supercritical carbon dioxide through amidation of vanillylamine hydrochloride and palmitic anhydride by lipase[J]. Food Chemistry,2007,(102):1020-1026.

[7] Cleofe Palocci, Mariangela Falconi,et al. Enrico Cernia. Lipase-catalyzed regioselective acylation of tritylglycosides in supercritical carbon dioxide.Supercritical Fluids[J].2008,(45):88-93.

[8] 彭英利,馬承愚. 超臨界流體技術(shù)應(yīng)用手冊(cè)[M]. 化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[9] 王軍,李剛森.離子液體的性能及應(yīng)用[M].北京:中國紡織出版社, 2007.

[10] Blanchard L A, Hancu D, Beckman E J, Brennecke J F．Nature[J].1999,(399):28.

[11] Blanchard L A, Z. Gu,J.F.et al. High pressure phase behavior of ionic liquid/CO2systems[J].Phys. Chem.B, 2001,(105):2437-2444.

[12] S.N.V.K, Aki,B.R, Mellein.et al. High-pressure phase behavior of carbon dioxide with imidazolium-based ionic liquids[J].Phys. Chem. B, 2004, (108):20355-20365.

[13] Shariati A，Peters C J.High pressure phase equilibria of systems with ionic liquids[J].Supercrit. Fluids,2005, (34): 171-176.

[14] Kazarian S G, Briscoe B J,et al. Combining ionic liquids and supercritical fluids: in situ ATR-IR study of CO2dissolved in two ionic liquids at high pressures[J].Chem. Commun, 2000, 2047-2048.

[15] Kazarian S G, Sakellarios N, C.M. Gordon. High pressure CO2-induced reduction of the melting temperature of ionic liquids[J], Chem. Commun,2002, 1314-1315.

[16] Lozano P, de Diego T,et al. Continuous green biocatalytic processes using ionic liquids and supercritical carbon dioxide[J]. Chem. Commun, 2002, 692-693.

[17] Lozano P, de Diego T,et al. Lipase catalysis in ionic liquids and supercritical carbon dioxide at 150℃. Biotechnol.Prog[J]. 2003, (19):380-382.

[18] Hern′andez F J, de los R′os A P,et al.A new recirculating enzymatic membrane for ester synthesis in ionic liquid/supercritical carbon dioxide biphasic systems. Appl. Catal[J]. 2006, (67): 121-126.

[19] Lozano P T, de Diego T,et al. On the importance of the supporting material for activity of immobilized Candida antartica lipase B in ionic liquid/hexane and ionic liquid/supercritical carbon dioxide biphasic media Iborra[J]. Supercrit Fluids, 2007, (40): 93-100.

Chengdu,Chengdu610041,Sichuan,China)

Enzymatic Catalysisin Supercritical CO2

ZengYuwei1,ChenXuejun2

(1.HighSchoolNo.7ChengduTheNewCampus,Chengdu610041,Sichuan,China;2.ChengduInstituteofOrangicchemistryChineseAcademyofSciences

This article summarized the current research development of lipase-catalyzed reaction in supercritical CO2, and mainly described the the newest research direction SC-CO2 IL system of the enzyme-catalyzed reaction in supercritical CO2, including analyze at the molecular level the reason of the change of the solubility in SC-CO2 IL system and the decreasing of the IL’s melting points, and then has enumerated the recent application situation of SC-CO2 IL system in the enzyme-catalyzed reaction.

SC-CO2; enzyme catalysis; SC-CO2 IL system