張洪亮　董天崴　張磊藝

[摘要] 目的 研究miR-21-5p在肺動脈高壓發(fā)病中的調(diào)控機(jī)制。 方法 應(yīng)用qRT-PCR方法檢測miR-21-5p在正常人和先天性心臟病伴肺動脈高壓患者血清，以及常氧和缺氧處理肺動脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)；利用Edu滲入法以及劃痕實驗研究miR-21-5p對肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的影響；應(yīng)用Targetscan軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測并在肺動脈平滑肌細(xì)胞中進(jìn)行驗證。 結(jié)果 肺動脈高壓患者血清miR-21-5p水平顯著高于正常人血清（P < 0.001）；與常氧相比，缺氧處理肺動脈平滑肌細(xì)胞明顯促進(jìn)miR-21-5p表達(dá)（P < 0.01）；miR-21-5p能夠促進(jìn)缺氧條件下的肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移；雙熒光素酶報告系統(tǒng)證明miR-21-5p能夠結(jié)合骨形成蛋白Ⅱ型受體（BMPR2）的3UTR；鑒定miR-21-5p在肺動脈平滑肌細(xì)胞中靶向BMPR2基因。 結(jié)論 miR-21-5p調(diào)控靶基因BMPR2參與肺動脈高壓發(fā)病。

[關(guān)鍵詞] 肺動脈高壓；microRNA；骨形成蛋白Ⅱ型受體；調(diào)控

[中圖分類號] R543.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（b）-0012-04

[Abstract] Objective To reveal the role of miR-21-5p in the development of pulmonary arterial hypertention （PAH）. Methods qRT-PCR method was used to detect the expression of miR-21-5p in the serum of healthy donors and patients with PAH associated with congenital heart disease （CHD-PAH）， and the pulmonary artery smooth muscle cells （PASMC） exposed to normoxia and hypoxia. The effects of miR-21-5p on hypoxia-induced PASMC proliferation and migration were detected by Edu incorporation and wound assay. The target gene of miR-21-5p was predicted by targetscan and validated by luciferase report assay. Results miR-21-5p level was significantly increased in the serum of CHD-PAH patient as compared with healthy donors （P < 0.001）. In addition， the expression of miR-21-5p was significantly induced in PASMC treated by hypoxic as compared with normoxia （P < 0.01）. Functional analysis revealed that miR-21-5p significantly enhanced hypoxia-induced PASMC proliferation and migration. Finally， dual-luciferase reporter system proved miR-21-5p could integrate with BMPR2 3UTR， then BMPR2 was identified as a direct target of miR-21-5p. Conclusion The study demonstrates that miR-21-5p is involved in regulating PAH by targeting BMPR2.

[Key words] Pulmonary arterial hypertension； microRNA； BMPR2； Regulation

肺動脈高壓是以肺動脈壓力持續(xù)升高、肺血管阻力增加和肺小血管重構(gòu)為特征的肺血管疾病[1]。肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，使得肺小動脈內(nèi)徑變細(xì)，最終肺動脈阻力增加，壓力升高為其病理學(xué)特征[2-3]。

microRNA（miRNA）是一類高度保守、長度為20～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA[4]。miRNA通過與靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）特異結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因進(jìn)行調(diào)控[5]。研究表明，miRNA參與肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[6-7]。miRNA通過促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞的分化和抗凋亡效應(yīng)來參與肺動脈高壓的進(jìn)程[8-9]。本研究對miR-21-5p調(diào)控BMPR2參與肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 患者血清標(biāo)本采集

血清標(biāo)本來源于北京阜外醫(yī)院先天性心臟病伴有肺動脈高壓（CHD-PAH）患者及健康人各24例。肺動脈高壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)為在海平面靜息狀態(tài)下右心導(dǎo)管檢查肺動脈收縮壓>4 kPa（30 mmHg）和/或肺動脈平均壓>3.33 kPa（25 mmHg）。血液樣本在室溫下靜置1 h，4℃離心機(jī)3000 r/min離心10 min，上清液保存于-80℃冰箱。

1.2 miR-21-5p實時熒光定量檢測

應(yīng)用qRT-PCR檢測試劑盒（深圳盎然生物）進(jìn)行檢測。miRNA經(jīng)加poly A后立即逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)形成cDNA，snoRNA44作為內(nèi)參。每個樣本PCR反應(yīng)做3個復(fù)孔，引物如下：miR-21-5p 5′-GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCAACAT-3′（RT），5′-TTCGGTAGCTTACAGACTGA-3′（Forward）； SNORD44：5′ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGTCAG-3′（RT），5′-TGGCCTGGATGATGATAAGCA-3′ （Forward）。

1.3 肺動脈平滑肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

人肺動脈平滑肌細(xì)胞（HPASMC）購自美國Science Cell公司，大鼠肺動脈平滑肌原代細(xì)胞（RPASMC）分離自SD大鼠[北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2011-0011]肺動脈。

1.4 靶基因3-UTR熒光素酶載體及其突變載體的構(gòu)建

以大鼠的基因組DNA為模板，將pGL3-ccdb載體經(jīng)雙酶切后與基因的3-UTR產(chǎn)物連接。BMPR2的3-UTR突變引物，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到雙酶切后的pGL3-ccdb載體，連接后轉(zhuǎn)化酶切鑒定后進(jìn)行測序分析。

1.5 BMPR2蛋白表達(dá)檢測

采用Western blot法進(jìn)行蛋白檢測。4%～10%的預(yù)制膠電泳分離蛋白質(zhì)，經(jīng)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，一抗4℃搖床孵育過夜，用Totallab TL100圖像分析軟件對特異條帶進(jìn)行灰度掃描，并用相對灰度值表示蛋白相對含量。一抗?jié)舛确謩e為：抗BMPR2（Abcam）1∶1000，抗β-Tubulin（Santa Cruz）1∶2000；二抗?jié)舛葹?∶2000。

1.6 細(xì)胞增殖實驗

根據(jù)試劑盒（廣州銳博生物），接種細(xì)胞于48孔板，加入20 μmol/L EdU繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.5%Triton X-100透化10 min，每孔細(xì)胞加入150 μL染色反應(yīng)液反應(yīng)30 min。DNA用1×Hochest （150 μL/孔）染色5 min，在熒光顯微鏡下拍照。

1.7 細(xì)胞遷移實驗

細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時進(jìn)行劃痕（每組劃3～5個位置），更換成含0.5%FBS的SmGM-2培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓處理，并標(biāo)記和拍照，所有細(xì)胞遷移實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-21-5p在CHD-PAH患者血清中及缺氧條件下肺動脈平滑細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR檢測結(jié)果顯示：miR-21-5p在CHD-PAH血清中表達(dá)升高，與正常人血清樣本比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001）；RPASMC和HPASMC分別在常氧條件下培養(yǎng)48 h以及缺氧條件下分別培養(yǎng)12、24、48 h，收集細(xì)胞后檢測miR-21-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示缺氧條件下miR-21-5p的表達(dá)升高最明顯，與常氧比較在24 h達(dá)到高峰值（P < 0.001）。

2.2 miR-21-5p對人肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響

觀察在缺氧條件下分別轉(zhuǎn)染miRNA-control、miR-21-5p mimic、anti-cnotrol、anti-miR-21-5p后對HPASMC增殖影響。從圖2（封四）結(jié)果可見，與對照組相比，過表達(dá)miR-21-5p能促進(jìn)HPASMC增殖（P < 0.01），相反，當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-21-5p拮抗物后抑制了HPASMC增殖（P < 0.01）。

2.3 miR-21-5p在人肺動脈平滑肌細(xì)胞遷移過程中的作用

實驗表明，在缺氧24 h條件下miR-21-5p具有促進(jìn)HPASMC遷移作用（P < 0.01）；應(yīng)用miR-21-5p抑制物缺氧24 h后，anti-21-5p抑制了HPASMC的遷移功能（P < 0.01）。

2.4 miR-21-5p靶基因預(yù)測及3-UTR熒光素酶報告系統(tǒng)驗證

TargetScan在線軟件預(yù)測候選靶基因中BMPR2的3-UTR與miR-21-5p結(jié)合位點（圖4A）。雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-21-5p使野生型BMPR2報告載體熒光素酶活性下降，與野生型對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），突變的熒光素酶報告基因的活性與對照組比較大致不變（P > 0.05）（圖4B）。

2.5 miR-21-5p抑制內(nèi)源性BMPR2的表達(dá)

與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimic組中BMPR2表達(dá)水平明顯上調(diào)（P < 0.001），轉(zhuǎn)染miR-21-5p inhibitor組BMPR2表達(dá)水平明顯降低（P < 0.001）（圖5A、B）。應(yīng)用Western blot檢測BMPR2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與mimic-control相比，過表達(dá)miR-21-5p BMPR2蛋白表達(dá)下降；抑制miR-21-5p的表達(dá)，能使HPASMC中BMPR2蛋白表達(dá)水平上調(diào)（圖5C）。

3 討論

既往研究證明miRNA參與肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制[10-11]。本研究檢測肺動脈高壓患者血清及缺氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞中miR-21-5p表達(dá)升高，細(xì)胞功能實驗在缺氧條件下miR-21-5p具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移功能，應(yīng)用Target scan在線軟件預(yù)測miR-21-5p靶基因為BMPR2，實驗證實miR-21-5p通過靶向BMPR2參與肺動脈高壓的細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)過程。

肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制中BMPR2基因突變會引發(fā)肺動脈高壓易感性[12-13]。BMPR2是轉(zhuǎn)錄生長因子-β家族的重要成員，很早就有實驗證實BMPR2基因雜合子突變是肺動脈高壓家族患者人群的重要遺傳易感因素[14]。在肺動脈高壓患者的家族人群檢測結(jié)果顯示：大約有75%的家庭中檢測到BMPR2基因突變[15]。實驗證明，BMPR2和其下游信號途徑在肺血管重構(gòu)中扮演著重要角色，通過激活BMPR2基因阻止細(xì)胞周期從而抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞的分化[16-17]。

microRNA參與肺動脈高壓的調(diào)控機(jī)制已經(jīng)在多個研究中得到證實，miR-145通過靶向BMPR2參與肺動脈高壓[18]，抑制miR-20a導(dǎo)致BMPR2下游基因Id-1和Id-2的激活，從而抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖[19]。miR-21在肺動脈高壓的動物模型肺組織中高表達(dá)，通過激活RhoB信號途徑促進(jìn)肺動脈高壓的發(fā)生[20]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件下，過表達(dá)miR-21-5P具有促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖功能。說明在缺氧條件下，miR-21-5p對肺動脈的重構(gòu)過程具有重要的作用。

本研究只探討了miR-21-5p通過BMPR2基因?qū)PASMC增殖和遷移的影響，Target scan軟件預(yù)測miR-21-5p同時靶向多個靶基因，其他靶基因是否同時參與了肺動脈高壓的調(diào)控需要下一步驗證。

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（收稿日期：2016-07-13 本文編輯：程 銘）