韓風(fēng)杰 徐文娜 劉 敏 李啟蒙 王雪鵬*（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 271018 山東省濟(jì)寧市泗水縣水利局）

魁蚶溶藻弧菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

韓風(fēng)杰①徐文娜②劉 敏①李啟蒙①王雪鵬①*（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 271018 ②山東省濟(jì)寧市泗水縣水利局）

本文從山東某魁蚶養(yǎng)殖區(qū)發(fā)病魁蚶和養(yǎng)殖水體中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌能引起供試魁蚶發(fā)病，死亡率為100%，且發(fā)病癥狀與原發(fā)病癥狀相同，提示該菌是引起魁蚶死亡的主要致病菌。本研究對(duì)該菌形態(tài)、生理生化特征、16SrDNA及致病性進(jìn)行了初步分析。結(jié)果顯示該菌株為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，該菌對(duì)頭孢拉定等9種藥物高度敏感，對(duì)氟哌酸等5種藥物中度敏感，對(duì)青霉素具有耐藥性。

魁蚶 溶藻弧菌 生理生化 致病性

魁蚶是我國(guó)沿海常見(jiàn)的一種重要經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者歡迎，是出口創(chuàng)匯的重要水產(chǎn)品之一。但是近十幾年來(lái)，隨著魁蚶養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境惡化導(dǎo)致微生物疾病的流行而引發(fā)的養(yǎng)殖魁蚶的大規(guī)模死亡屢屢發(fā)生，已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而弧菌（Vibrios）是導(dǎo)致魁蚶發(fā)病的主要致病菌。本研究對(duì)發(fā)病魁蚶優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分離、鑒定，并進(jìn)行人工感染試驗(yàn)和藥物敏感性分析，探討分析導(dǎo)致山東魁蚶大規(guī)模死亡的病原，旨在為魁蚶疾病研究提供理論依據(jù)，為魁蚶健康養(yǎng)殖提供一些參考資料。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病魁蚶 于2015年8月份山東魁蚶發(fā)病高峰期，采集病狀特征明顯、瀕臨死亡的魁蚶?；疾】?殼長(zhǎng)3cm左右)，表皮部分脫落、表面粘液較少，解剖發(fā)現(xiàn)外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開(kāi)合無(wú)力，有些發(fā)爛發(fā)白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無(wú)色，部分病蚶腮黏液明顯增多。

1.2 分離方法 無(wú)菌鹽水洗凈，用70%的酒精棉球?qū)w表擦拭消毒，無(wú)菌手術(shù)刀開(kāi)啟，取肝胰臟等部位無(wú)菌勻漿器中勻漿處理，zobell 2216E平板和TCBS平板劃線(xiàn)接種，28℃培養(yǎng)24 h后，選取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行重復(fù)劃線(xiàn)純化，純培養(yǎng)物于4℃冰箱中保存。

1.3 人工感染試驗(yàn) 人工感染試驗(yàn)在20L水族箱中進(jìn)行，條件為溫度28℃，鹽度26.4，pH8.2，連續(xù)充氣，每組放16只2cm大小的魁蚶。每天換水1次，試驗(yàn)組調(diào)節(jié)水體中細(xì)菌濃度為108cfu/mL，每日投單胞藻1次；對(duì)照組不加入菌體，按上述方法飼養(yǎng)；連續(xù)觀察12d，紀(jì)錄死亡狀況，并進(jìn)行解剖和病原的再分離以確定是否死于攻毒活菌引起的感染。

1.4 細(xì)菌生化鑒定 按一般細(xì)菌常用鑒定方法[6]進(jìn)行分離菌的生物學(xué)性狀測(cè)定，包括革蘭氏染色、形態(tài)觀察、生理生化特性測(cè)定(所用試劑購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.5 16SrDNA克隆、測(cè)序 采用細(xì)菌16SrDNA序列擴(kuò)增的通用引物對(duì)純培養(yǎng)的細(xì)菌16SrDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物為5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物為5'AAGGAGGTGWTCCARCC-3'。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，在zobell 2216E培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈直徑。藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離及其形態(tài)特征 經(jīng)分離純化后，從病蛤中分離到1株優(yōu)勢(shì)菌，分離到的菌株均為革蘭氏陰性直桿菌(圖1)，菌體直或稍彎，無(wú)莢膜，靠鞭毛運(yùn)動(dòng)。在TCBS (硫代硫酸鈉-檸檬酸鹽-膽鹽)瓊脂平板上培養(yǎng)18h后，該分離菌株形成黃色扁平的大菌落(圖1)。

圖1 1:革蘭氏染色顯微鏡觀察(1000x)；2: 分離菌在TCBS上的生長(zhǎng)特性

2.2 人工感染試驗(yàn) 人工感染7d后，魁蚶開(kāi)始出現(xiàn)死亡，9d后全部死亡，病死率為100%。于是初步判定2015年8月山東某養(yǎng)殖區(qū)魁蚶大批死亡主要是以該分離菌為主要病原體的傳染病所造成。

2.3 分離菌株生化特性 細(xì)菌分離株在40℃以上和4℃以下不生長(zhǎng)，無(wú)鹽不生長(zhǎng)，其生活特性見(jiàn)表1，根據(jù)表1可以可以看出，這些特性與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)溶藻弧菌的描述基本一致，認(rèn)為該分離菌為溶藻弧菌，命名為Va-kh1。

表1 分離菌生化特征及其與標(biāo)準(zhǔn)溶藻弧菌的比較

2.4 16SrDNA克隆、測(cè)序 對(duì)Va-kh1株16S rDNA序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析PCR擴(kuò)增，所得結(jié)果見(jiàn)圖2，進(jìn)一步證實(shí)該菌為溶藻弧菌。

圖2 Va-kh1進(jìn)化樹(shù)

2.5 藥物敏感性試驗(yàn) 利用紙片法測(cè)定16種抗菌藥物對(duì)致病菌的抑制作用，由結(jié)果可知，分離菌株該菌對(duì)頭孢拉定等9種藥物高度敏感，對(duì)氟哌酸等5種藥物中度敏感，對(duì)青霉素產(chǎn)生耐藥性。

3 討論

（1）溶藻弧菌感染海水養(yǎng)殖動(dòng)物的報(bào)道比較多，但導(dǎo)致貝類(lèi)病害發(fā)生的報(bào)道卻很少。本次樣品采集是在高水溫期，表明溶藻弧菌是容易高溫環(huán)境下生長(zhǎng)并導(dǎo)致海水養(yǎng)殖動(dòng)物的弧菌病，通過(guò)人工感染實(shí)驗(yàn)可知，感染后的試驗(yàn)魁蚶出現(xiàn)明顯的病癥：表皮部分脫落、表面粘液較少，解剖發(fā)現(xiàn)外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開(kāi)合無(wú)力，有些發(fā)爛發(fā)白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無(wú)色，部分病蚶腮黏液明顯增多，死亡率高達(dá)100%，從浸泡感染方式發(fā)病魁蚶處分離到與自然發(fā)病相同的細(xì)菌，因此可以確定該分離株是魁蚶發(fā)病的病原體。（2）從藥敏試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，該溶藻弧菌對(duì)阿米卡星、復(fù)方新諾明、卡那霉素、菌必治、先鋒必、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、頭孢拉定9種藥物高度敏感，對(duì)氟哌酸、利福平、頭孢噻吩、頭孢氨芐、氨芐青霉素5種藥物中度敏感，對(duì)四環(huán)素、青霉素G低度敏感，因此在疾病發(fā)生時(shí)可以適量投放一些抗菌性藥物，但值得注意的是目前在養(yǎng)殖過(guò)程中誤用、濫用抗生素和消毒劑等，影響了水體中微生態(tài)環(huán)境的平衡，可能導(dǎo)致了一些耐藥菌株的出現(xiàn)，但是合理選擇和使用有效的抗生素仍是目前和近期內(nèi)控制疾病主要方法。為了更好的預(yù)防病害發(fā)生，塘養(yǎng)或池養(yǎng)魁蚶(灘涂除外)可以適量投放微生態(tài)制劑，如：芽孢桿菌和光合細(xì)菌，以達(dá)到生態(tài)防治的目的。

表2 菌株Va-kh藥敏試驗(yàn)結(jié)果

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S851.61+3

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1007-1733(2016)05-0013-02

2016–04–14）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系貝類(lèi)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-14-07)

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