陳 磊

（新疆兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊830063）

生鮮乳中皮革水解蛋白的檢測(cè)及應(yīng)用

陳 磊

（新疆兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊830063）

為測(cè)定生鮮乳中皮革水解蛋白，采用UV法檢測(cè)農(nóng)業(yè)部生鮮乳比對(duì)盲樣和2011-2015年兵團(tuán)9個(gè)師的生鮮乳收購站及生鮮乳運(yùn)輸車的生鮮乳，按3∶1比例進(jìn)行抽檢樣品的L-羥脯氨酸。結(jié)果顯示：L-羥脯氨酸的濃度在0～1.5 mg/L范圍呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.9993，L-羥脯氨酸的回收率為96.16％～104.84％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.32％，農(nóng)業(yè)部生鮮乳盲樣比對(duì)結(jié)果全部通過，檢測(cè)634批次生鮮乳均未檢出皮革水解蛋白。此檢測(cè)方法對(duì)兵團(tuán)生鮮乳中皮革水解蛋白的測(cè)定提供重要的科學(xué)依據(jù)。

生鮮乳；L-羥脯氨酸；皮革水解蛋白

10.16863 /j.cnki.1003-6377.2016.06.008

皮革水解蛋白是利用已經(jīng)廢棄的皮革制品和動(dòng)物毛發(fā)，水解后將其制成粉末狀，再摻入到牛奶或著奶粉中去，用以提高奶制品中蛋白質(zhì)的濃度，這種摻雜有皮革水解蛋白的奶制品食用后，會(huì)致使身體消化不良，吸收及利用率降低，長(zhǎng)時(shí)間飲用會(huì)導(dǎo)致人體中毒，影響了人體健康[1]。2009年2月6日，中國衛(wèi)生部公布了《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第二批）》，其中共4個(gè)指標(biāo)，就包含有“皮革水解蛋白”。檢測(cè)鮮奶中的皮革水解蛋白，實(shí)際就是檢測(cè)鮮奶中的L-羥脯氨酸[2]。

1 材料與方法

1.1 主要的試劑和材料

L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)111578-200201）；氯胺T、對(duì)二氨基苯甲醛、HCl、苯酚、檸檬酸、NaOH、結(jié)晶乙酸鈉、正丙醇均為分析純；去離子水。

生鮮乳樣品：來自兵團(tuán)九個(gè)師生鮮乳奶站和運(yùn)輸車。

1.2 主要儀器設(shè)備

TU-1901紫外分光光度儀、水浴鍋、電熱恒溫干燥箱、移液器。

1.3 試劑配制

1.3.1 配制緩沖液

把50.0 g的一水合檸檬酸、26.3 g的NaOH和146.1 g的乙酸鈉溶解于去離子水中，定容到1 L，再依次的加入200mL的去離子水和300 mL的正丙醇，混合均勻。

1.3.2 配制氯胺T溶液

把1.41 g的氯胺T，溶解于10mL去離子水中，再依次的加入10 mL的正丙醇和80mL的緩沖液（1.3.1）后，混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 配制顯色劑

將10.0 g的對(duì)二甲胺基苯甲醛，溶解于35 mL的高氯酸中，再緩慢的加入65 mL的異丙醇后，混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（500mg/L）

用0.02mol/LHCl溶液將50.0mg/L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解，定容到100mL。靜置于4℃冰箱，有效期為6個(gè)月。

1.3.5 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.00mg/L）

用0.02mol/LHCl溶液稀釋1.0mL的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.3.4），定容到100mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品制備

準(zhǔn)確吸取5.00mL(V1)混勻的生乳樣品于玻璃水解管中，加5.00mLHCl搖勻密封后，置于110℃電熱恒溫干燥箱內(nèi)，水解作用12 h（計(jì)時(shí)1 h后，取出玻璃水解管輕輕搖動(dòng)數(shù)次）。水解作用結(jié)束后，待溶液溫度下降至室溫，將溶液混合均勻用濾紙進(jìn)行過濾，用水反復(fù)沖洗玻璃水解管和漏斗，濾液用容量瓶定容至100 mL（V2），搖勻。分別用10mol/L和1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)10.0m L（V3）水解液pH值至8.0±0.2，用容量瓶定容到50 mL（V4），搖勻，作為試液留存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)制備空白試劑對(duì)照和陽性添加。

1.4.2 制備陽性添加

分別量取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（500mg/L）125 L、500 L、1 000 L，再分別加入5mL的空白生鮮乳，配制成12.5 g/mL、50 g/mL、100 g/mL的陽性添加試料。

1.5 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.3.5）0.00mL、5.00 mL、10.00 mL、15.00 mL、20.00 mL和30.00 mL，分別加入去離子水，用容量瓶分別定容到100mL，搖勻。配制成濃度分別為0.00mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L、0.75mg/L、1.00 mg/L和1.50mg/L的溶液。各種濃度的溶液取5.00mL，分別加入到25mL的具塞比色管內(nèi)，再加入2.00 mL配制好的氯胺T溶液（1.3.2），搖勻，室溫靜置20min。加入2.00 mL的顯色劑（1.3.3），搖勻后密封，60℃水浴20min，溶液置入20℃水中快速降溫，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)560 nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定結(jié)果需40min內(nèi)完成。

1.6 試液測(cè)定

從試液（2.1）中吸取5.00mL于25mL具塞比色管中，按照3.1的方法進(jìn)行操作，在560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，40 min內(nèi)完成測(cè)定。從得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算得到L-羥脯氨酸的濃度(C)，L-羥脯氨酸含量(X)的計(jì)算：

計(jì)算公式：X=CV2V4/V1V3

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），得到線性回歸方程為：y=0.2167x+0.0006，R2=0.9993。從圖1可知，吸光度和濃度呈良好的線性關(guān)系，線性范圍是0～1.5 mg/L。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 加標(biāo)回收率

按照本試驗(yàn)方法對(duì)陽性添加進(jìn)行測(cè)定，得到回收率結(jié)果見表2。由表2可以看出其加標(biāo)回收率在96.16％～104.84％。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.32％。

表2 L-羥脯氨酸回收率g/m L％)（

2.3 應(yīng)用

應(yīng)用此方法參加農(nóng)業(yè)部生鮮乳盲樣比對(duì)，連續(xù)5年結(jié)果全部通過考核（見表3）。

表3 近年來參加農(nóng)業(yè)部比對(duì)結(jié)果（mg/mL％)

應(yīng)用上述生鮮乳中皮革水解蛋白的檢測(cè)方法對(duì)兵團(tuán)9個(gè)師的生鮮乳收購站及生鮮乳運(yùn)輸車的生鮮乳按3：1比例進(jìn)行抽檢，2011-2015年共檢測(cè)生鮮乳650批次，均未檢測(cè)出皮革水解蛋白（見表4）。

表4 兵團(tuán)生鮮乳中皮革水解蛋白檢測(cè)結(jié)果

3 討論

用UV方法對(duì)兵團(tuán)近5年抽檢的634批次生鮮乳進(jìn)行L-羥脯氨酸檢測(cè)，均未檢出，說明兵團(tuán)乳品中未添加皮革水解蛋白。

應(yīng)用此方法參加農(nóng)業(yè)部生鮮乳盲樣比對(duì)結(jié)果符合農(nóng)業(yè)部要求，通過考核。說明用該方法檢測(cè)生鮮乳中皮革水解蛋白可行。

本試驗(yàn)方法測(cè)定生鮮乳中皮革水解蛋白的濃度，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件穩(wěn)定，變異系數(shù)較小，其準(zhǔn)確度較好，加標(biāo)回收率較高，對(duì)儀器要求較低，消耗試驗(yàn)成本較低，操作方便簡(jiǎn)單。應(yīng)用此方法對(duì)兵團(tuán)生鮮乳中皮革水解蛋白進(jìn)行檢測(cè)具有重要的科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)意義。

[1]孔曉鋒,古麗曼,達(dá)成彪，等.紫外分光光度法測(cè)定生鮮乳中動(dòng)物水解蛋白L-羥脯氨酸含量[J].飼料工業(yè)，2011(4):60-61.

[2]劉學(xué)琴,徐栓朝，等.生鮮乳制品中添加皮革水解蛋白的測(cè)定方法研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2010，（4）：188-192.

Detection and App lication of Ieather Hydrolyzed Protein in Fresh M ilk

CHEN Lei
（Animal Husbandry and Veterinary Station of Xinjiang Production and Construction Corps, Urumqi830063，China）

In order to determine the hydrolysis protein of leather in raw milk.The acquisition of raw milk and raw milk vehicle testing station of Ministry of agriculture of fresh milk intercomparison and 2011-2015 Corps 9 division with the UV method for sampling fresh milk samples according to the proportion of 3:1 L-hydroxyproline.The results showed that the concentration of hydroxyproline L-was linear in the range of 0 mg/L-1.5 mg/L,the linear correlation coefficient is 0.9993,the recovery rate was 96.16％～L-were 104.84％, the relative standard deviation is 3.32％,the Ministry of agriculture of fresh milk all through the comparison results,the detection of 634 batches of fresh milk were not detected in leather hydrolyzed protein.This detection method provides an important scientific basis for the determination of the hydrolyzed protein in raw milk.

freshmilk;L-hydroxyproline;leather hydrolyzed protein

S879.1

A

1003-6377（2016）06-0034-04

陳磊（1971-），女，農(nóng)學(xué)碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病及畜產(chǎn)品藥物殘留檢測(cè)工作。E-mail：736429476@qq.com

2016-10-03，

2016-10-16