張 爽,劉春花,李向紅,張建平

(1.黑龍江工程學(xué)院 土木與建筑工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150050；2.黑龍江大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150080；3.哈爾濱供排水集團(tuán)，黑龍江 哈爾濱 150040；4. 黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028)

反硝化聚磷菌生物特性的研究

張 爽1,劉春花2,李向紅3,張建平4

(1.黑龍江工程學(xué)院 土木與建筑工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150050；2.黑龍江大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150080；3.哈爾濱供排水集團(tuán)，黑龍江 哈爾濱 150040；4. 黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028)

采用平板劃線法對(duì)反硝化聚磷菌進(jìn)行分離、純化，并富集培養(yǎng)，選定脫氮除磷效果最佳的菌株12為試驗(yàn)反硝化聚磷菌菌株。觀察菌群的表觀性質(zhì)，研究不同碳源、氮源、溫度、pH值對(duì)反硝化除磷菌生長(zhǎng)特性及除磷效果的影響，為污水同步脫氮除磷工藝改革與創(chuàng)新提供新的思路與視角。

反硝化聚磷菌；平板劃線法；生物特性；分光光度法

1 概 述

隨著越來(lái)越多的國(guó)家和地區(qū)對(duì)氮磷排放標(biāo)準(zhǔn)要求的日益提高，研究和開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的污水脫氮除磷技術(shù)成為污水處理工程領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，各種同步脫氮除磷工藝應(yīng)運(yùn)而生。然而，傳統(tǒng)的生物脫氮除磷組合工藝存在菌群難以協(xié)調(diào)的矛盾和競(jìng)爭(zhēng)，諸如污泥齡、硝酸鹽、溫度以及pH等方面的問(wèn)題，影響工藝的處理效率，難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)高效脫氮除磷?？梢?jiàn)傳統(tǒng)的脫氮除磷工藝中存在著自身難以解決的弊端，因而研究新的生物脫氮除磷方法十分重要。反硝化除磷理論的發(fā)現(xiàn)與深入研究為污水同步脫氮除磷工藝改革與創(chuàng)新提供了新的思路與視角，由此成為近年來(lái)水處理研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。

2 反硝化聚磷菌的生物特性

2.1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

實(shí)驗(yàn)研究主要通過(guò)批式實(shí)驗(yàn)的形式完成，試驗(yàn)思路為純種培養(yǎng)方式試驗(yàn)方法，本次試驗(yàn)接種的污泥為污水處理廠反應(yīng)池曝氣末端取混合液，從中分離、篩選及富集出反硝化聚磷菌，觀察磷細(xì)菌的表觀性質(zhì)，研究不同碳源、氮源、溫度、pH值對(duì)反硝化除磷菌生長(zhǎng)特性及除磷效果的影響。

2.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基

1)富集培養(yǎng)基：CH3COONa·3H2O 3.32 mg、K2HPO425 mg、NH4Cl 305 g、KNO3300 mg、MgSO4·7H2O 90 mg、CaCl·2H2O 25 mg、CaCl·2H2O 25 mg、NaCl 10 mg、微量元素2 ml、PIPES緩沖劑8.5 g、蒸餾水1 L、pH7.0～7.2。

2)牛蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L、pH7.0～7.2。

3)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g、NaCl 0.5 g、NH4NO31.0 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、蒸餾水1 L 、pH7.0～7.5。

4)LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 L、pH7.0～7.2。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

1)菌株的生理生化鑒定按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《一般細(xì)菌常用鑒定方法》進(jìn)行。

表1 缺氧培養(yǎng)試驗(yàn)

2)測(cè)定上清液磷濃度采用鉬銻抗分光光度法。

3)測(cè)定硝酸鹽氮濃度采用紫外分光光度法。

4)測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)量采用分光光度計(jì)測(cè)定。

細(xì)菌的生長(zhǎng)量采用722型可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定，以波長(zhǎng)λ=600 nm處的吸光度表示，培養(yǎng)后菌液用已滅菌的雙蒸水洗滌，并懸浮于等量雙蒸水中測(cè)定OD600 nm。

2.4 試驗(yàn)方法及分析

2.4.1 碳源的影響

碳元素同樣是菌株生長(zhǎng)必需的元素之一，既用于細(xì)胞物質(zhì)的組成，還常常作為細(xì)胞的能源。

在6個(gè)250 mL錐形瓶中各加入100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，將菌株12按1%的接種量接種，5個(gè)瓶中分別加入1.0 g不同碳源，碳源依次為蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖。置于恒溫振蕩器(180 r·min-1、30 ℃)中培養(yǎng)12 h，測(cè)定OD600 nm。設(shè)接種但不加碳源的參比，如果菌液明顯大于參比，就認(rèn)為該碳源可利用。不同碳源對(duì)菌株12生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖1所示。菌株12對(duì)葡萄糖和麥芽糖的利用率最高，OD600 nm分別達(dá)到1.35和1.19。

圖1 菌株12在不同碳源條件下的生長(zhǎng)吸光度值

2.4.2 氮源的影響

氮元素同樣是菌株生長(zhǎng)必需的元素之一，是菌株中蛋白質(zhì)、核酸和輔酶的重要組成成分。

在5個(gè)250 mL錐形瓶中各加入100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，將菌株12按1%的接種量接種，以葡萄糖為碳源，5個(gè)瓶中分別加入1.0 g不同氮源，包括蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、NH4Cl、NH4NO3，置于恒溫振蕩器(180 r·min-1、30 ℃)中，培養(yǎng)12 h，測(cè)定OD600 nm。不同氮源對(duì)菌株12生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖2所示。在供試的幾種氮源中，菌株12對(duì)酵母膏和蛋白胨兩種有機(jī)氮源利用率最高，對(duì)無(wú)機(jī)氮源NH4Cl的利用率也較高。

圖2 菌株12在不同氮源條件下的生長(zhǎng)吸光度值

2.4.3 溫度的影響

污水生物處理的核心是微生物的代謝，而代謝是各種酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。由于生物蛋白的活性受溫度影響較大，酶具有蛋白質(zhì)特性，所以在污水生物處理中需要在合適的溫度下進(jìn)行，才有利于提高污水處理效果。

將菌株12按1%的接種量接種裝有100 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩器(180 r·min-1)中，分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃條件下各培養(yǎng)12 h，測(cè)定OD600 nm。由圖3可知，菌株12于LB培養(yǎng)基中在25～35 ℃時(shí)生長(zhǎng)最好，生長(zhǎng)量最大，最適宜生長(zhǎng)溫度是30 ℃，說(shuō)明菌株12屬于中溫型的細(xì)菌。當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，在LB培養(yǎng)基中菌株12生長(zhǎng)受到明顯抑制。

圖3 菌株12在不同溫度條件下的生長(zhǎng)吸光度值

菌株12屬于中溫菌株，其適宜的溫度與室溫較接近，在室溫條件下就能較好地完成脫氮除磷作用，在實(shí)際工程中更利于節(jié)約成本。

2.4.4 pH值的影響

不同的微生物對(duì)pH適應(yīng)能力都不同，即它們生長(zhǎng)的pH范圍有寬有窄，所以在反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中， 環(huán)境的pH是一個(gè)非常重要的指標(biāo)。 在適

宜的pH范圍內(nèi)，菌株的生長(zhǎng)代謝酶的活性較高，從而生長(zhǎng)速率也較快。當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谶@個(gè)范圍，可能會(huì)使酶的活性降低，甚至喪失，從而影響污水處理效果。

在6個(gè)250 mL錐形瓶中各加入100 mL配好的LB液體培養(yǎng)基，將菌株12按1%的接種量接種，pH值分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0，置于恒溫振蕩器(180 r·min-1，30 ℃)中培養(yǎng)12 h，測(cè)定OD600 nm。

由圖4可知，菌株12的生長(zhǎng)對(duì)pH沒(méi)有特殊要求。在LB培養(yǎng)基中菌株12生長(zhǎng)的最適宜pH為7.0。在pH低于7.0的酸性條件下，菌株12的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，在pH達(dá)到5.0時(shí)，菌株12幾乎不生長(zhǎng)；而pH高于7.0的堿性條件則對(duì)菌株12生長(zhǎng)的抑制要小得多。

圖4 菌株12在不同pH條件下的生長(zhǎng)吸光度值

3 結(jié)束語(yǔ)

反硝化聚磷菌株12在碳源上對(duì)葡萄糖和麥芽糖的利用率最高，在氮源上對(duì)酵母膏和蛋白胨兩種有機(jī)氮源利用率最高；菌株12最適宜生長(zhǎng)溫度是30 ℃，最適宜pH為7.0。

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[責(zé)任編輯：郝麗英]

Research on biological characteristics of denitrification phosphorus removal bacteria

ZHANG Shuang1, LIU Chunhua2,LI Xianghong3,ZHANG Jianping4

(1.College of Civil and Architectural Engineering,Heilongjiang Institute of Technology，Harbin 150050,China；2.Heilongjiang University，Harbin 150080,China；3.Harbin Water Supply and Drainage Group，Harbin 150040,China；4. Heilongjiang Institute of Quality Inspection，Harbin 150028,China)

The denitrification phosphorus removal bacteria are separated and purified with the plate streak method, and the best strain 12 are selected for the experiment. By studying the flora of the apparent properties of different carbon and nitrogen sources, temperature, pH value and growth characteristics of phosphorus removal effect on denitrifying phosphorus removal bacteria, this paper provides the new ideas and perspectives for the simultaneous removal of nitrogen and phosphorus removal of sewage reform and innovation.

denitrification phosphorus removal bacteria; plate streak method; biological characteristics; spectrophotometric method

10.19352/j.cnki.issn1671-4679.2016.06.009

2016-09-05

黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目資助(12541680)

張 爽(1972-),女,副教授,研究方向：污水水質(zhì)處理.

Q93-3

A

1671-4679(2016)06-0038-03