尹居鑫, 李祖宏, 牟 穎, 呂紹武, 羅貴民

(1. 吉林大學分子酶學工程教育部重點實驗室, 2. 生命科學學院, 長春 130012;3. 浙江大學智能系統(tǒng)與控制研究所, 杭州 310027)

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具有谷胱甘肽過氧化物酶活力的含硒三肽

尹居鑫1,2, 李祖宏1,3, 牟 穎1,3, 呂紹武1,2, 羅貴民1

(1. 吉林大學分子酶學工程教育部重點實驗室, 2. 生命科學學院, 長春 130012;3. 浙江大學智能系統(tǒng)與控制研究所, 杭州 310027)

合成了由硒代半胱氨酸(U)、 谷氨酰胺(Q)和色氨酸(W)組成的QUW, QWU, WQU, WUQ, UWQ和UQW 6個具有谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活力的含硒三肽; 采用雙酶偶聯(lián)法進行了GPx活力測定和穩(wěn)態(tài)動力學分析; 通過噻唑藍(MTT)比色法、 劃痕愈合實驗和Western blot技術表征了含硒三肽對肝癌HepG2細胞生長和遷移能力的影響. 結果表明, 當U位于氨基端時, 含硒三肽的GPx活力高于U位于中間位置或者羧基端時. UWQ催化谷胱甘肽(GSH)還原H2O2的活力最高, 其催化機制為乒乓機制. UWQ可使HepG2細胞運動能力減弱, 降低肝癌細胞的浸潤轉移能力.

谷胱甘肽過氧化物酶; 模擬物; 含硒三肽

Fig.1 Catalytic triad of GPx(PDB data: 1gp1)[3]

谷胱甘肽過氧化物酶(GPx, EC.1.11.1.9)是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一[1,2], 結構解析結果表明, 硒代半胱氨酸(Sec, U)、 谷氨酰胺(Gln, Q)和色氨酸(Trp, W)組成了天然GPx的催化三聯(lián)體(圖1)[3], 但未闡明催化三聯(lián)體中各氨基酸的催化貢獻規(guī)律. GPx能發(fā)揮維持體內(nèi)活性氧(ROS)平衡的重要作用, 對預防和治療癌癥、 心血管病等多種疾病效果明顯[4]. 但作為天然GPx催化中心的U由終止密碼子UGA編碼, 難以采用基因工程方法量產(chǎn), 限制了其深入研究和應用, 因此GPx模擬物的研究成為該領域的熱點之一[5]. 為了模擬GPx活性部位的結構, 已合成了多種類型的以Ebselen為代表的有機硒化合物[6]. 雖然引入個別氨基酸會使Ebselen展示不同的GPx活力, 但這些氨基酸殘基對活性中心硒原子(Se)活性的影響尚不明確[7,8].

本文合成了由天然GPx催化三聯(lián)體U, W和Q形成的QUW, QWU, WQU, WUQ, UQW和UWQ 6個具有GPx活力的含硒三肽, 研究了催化三聯(lián)體中各氨基酸殘基的活力貢獻規(guī)律; 并以肝癌為研究對象[9], 表征了活力最佳的UWQ抗肝癌細胞轉移的能力. 本文結果對設計高活力含硒肽或氨基酸摻雜化合物等GPx模擬物, 深入研究其抗癌機制具有一定的指導意義.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

N-芴甲氧羰基-N-叔丁氧羰基-L-色氨酸[Fmoc-Trp(Boc)-OH]、N-芴甲氧羰基-N-三苯甲基-L-谷氨酰胺[Fmoc-Gln(Trt)-OH]、N-芴甲氧羰基-N-叔丁氧羰基-L-色氨酸-4-芐氧基芐酯[Fmoc-Trp(Boc)-Wang-Resin]、N-芴甲氧羰基-N-三苯甲基-L-谷氨酰胺-4-芐氧基芐酯[Fmoc-Gln(Trt)-Wang-Resin]、N-羥基苯并三氮唑(HOBt)、 三氟乙酸(TFA)和1,2-乙二硫醇(EDT), 吉爾生化(上海)有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈, 美國TND公司; 還原型谷胱甘肽(GSH)、 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷(NADPH)、 谷胱甘肽還原酶(GR)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗, Sigma公司; 杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)及胎牛血清, Gibco公司; 其它試劑均為國產(chǎn)分析純; 參照文獻[10]方法制備N-芴甲氧羰酰基-1,4-對甲氧基芐基-硒代半胱氨酸[Fmoc-Sec(PMB)-OH]; 人肝癌細胞(HepG2細胞)來源于中國科學院上海細胞庫.

MIKRO-22型臺式高速離心機(德國Hettich公司); HZQ-X100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術公司); Waters 600型高效液相色譜(HPLC)儀(美國Waters公司); ALPHA 2-4型凍干機(德國CHIST公司); MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司); IMT-2型倒置顯微鏡(日本Olympus公司).

1.2 含硒三肽的制備

采用Fmoc固相肽合成法合成含硒三肽, 用反相高效液相色譜進行分離純化[11], 經(jīng)冷凍干燥后含硒三肽樣品純度可達95%以上. 含硒三肽樣品通過質譜和氫化物原子熒光光譜鑒定為二聚體.

1.3 性能表征

采用酶偶聯(lián)法[4]進行含硒三肽的GPx活力測定和穩(wěn)態(tài)動力學分析. 將37 ℃下每分鐘氧化1 μmol NADPH所需含硒三肽的量定義為1個酶活力單位, 比活力用U/μmol表示. 進行動力學分析時, 保持一種底物的濃度不變, 改變另一種底物的濃度, 通過測定NADPH在340 nm處光吸收值的變化來確定其初速度. 采用噻唑藍(MTT)比色法測定含硒三肽對人肝癌細胞HepG2的體外殺傷作用[12]. 采用劃痕愈合實驗測定含硒三肽對人肝癌細胞HepG2體外遷移能力的影響[13]. 建模前裂痕寬度為Wbefore, 24 h后的裂痕寬度為Wafter, 遷移距離為Wbefore-Wafter. 相對遷移率定義為遷移距離與建模前裂痕寬度的比值, 即(Wbefore-Wafter)/Wbefore×100%. 采用Western blot技術[14]檢測含硒三肽對HepG2細胞中MMP-9和AFP蛋白表達情況的影響.

2 結果與討論

2.1 含硒三肽的酶學性質分析

對比6個含硒三肽的GPx活力數(shù)據(jù)(見表1)可知, 其活力順序為UWQ>UQW>WUQ/QUW>QWU/WQU. 含硒三肽中U所處位置的不同會導致其GPx活力存在差異, 即U位于氨基端時其GPx活力明顯高于U位于中間位置或者羧基端時. 前文[15]已證實, 將含有氨基/亞氨基的基團引入到催化中心Se原子附近能明顯提高模擬物的GPx活力. 這是由于硒原子附近引入的氨基/亞氨基可以將催化中間體硒醇活化為在動力學上更有活性的硒醇陰離子[16], 從而提高酶活力. 當U位于氨基端時, W和Q分子內(nèi)的亞氨基/氨基(酰胺鍵)結構所處空間位置與催化中心的Se原子相距較遠, 對催化的貢獻比U分子內(nèi)的游離氨基小很多; 當U位于羧基端時, U分子內(nèi)的游離羧基不利于底物H2O2將Se原子氧化為亞硒酸而進入催化循環(huán)[17], 因此GPx的活力最低.

Table 1 GPX-like activies of 3P and other GPX mimics

由動力學參數(shù)可知, 在UWQ和UQW中, W和Q所處位置不同對形成催化中間體的貢獻相近, 因

Fig.2 Double-reciprocal plots for the reduction of H2O2 by GSH catalyzed by UWQ

Table 2 Kinetic parameters of GPx mimics

此kmax(UWQ)和kmax(UQW)值接近.Km是酶的特征常數(shù)之一, 其值可反映酶與底物的親和力大小:Km值大表明親和力小;Km值小表明親合力大. 在天然GPx的結構中, Q中酰胺鍵的氧原子可與底物GSH的游離氨基形成氫鍵從而增加底物結合能力[19], 而位于羧基端QUWQ的自由度比位于中間位置QUQW的自由度大, 更容易與GSH的游離氨基形成氫鍵, 因此Km,GSH(UWQ)

2.2 UWQ對人肝癌HepG2細胞的生物活性

Fig.3 Cell viability of HepG2 cells treated by WUQ for 24 h

體外細胞實驗可用于評價模擬物的藥效, UWQ是一種分子量小、 結構簡單且活性較高的GPx模擬物, 本文以HepG2細胞為對象, 研究了UWQ對其生長增殖及運動侵襲性的影響. MTT法因具有靈敏度高及重復性好的優(yōu)點而成為評價細胞存活的重要手段, 由圖3可見, 不同濃度的UWQ可使HepG2細胞的存活率降低, 隨著UWQ濃度的增加, HepG2細胞存活率降低更加顯著, 呈現(xiàn)劑量依賴關系. 在UWQ的濃度為10 μmol/L時, HepG2細胞的存活率下降至約50%, 以Ebselen為陽性對照, 在相同的實驗條件下, Ebselen的濃度達到32 μmol/L時才能使HepG2細胞存活率下降至約50%. 上述結果表明, UWQ可以有效殺傷HepG2細胞, 降低其細胞存活率, 且殺傷效果強于Ebselen.

細胞遷移是細胞正常的生理學過程, 采用劃痕愈合實驗可以研究細胞的遷移能力. 劃痕24 h后, 用顯微鏡測量劃痕寬度, 觀察各組細胞劃痕的“愈合”情況, 遷移率高的實驗組中細胞相對遷移能力強. 結果表明, 未加UWQ的HepG2細胞基本爬滿劃痕區(qū)域[圖4(A)], 其遷移率為91.5%, 達到劃痕愈合; 而加入UWQ后, HepG2細胞的遷移能力明顯降低, 細胞劃痕愈合能力隨著UWQ濃度的增加而減弱, 當加入的UWQ濃度為15 μmol/L時, 遷移率僅為15.8%[圖4(B)]. 實驗結果表明, GPx模擬物UWQ可使HepG2細胞的運動侵襲能力顯著下降, 這是由于癌細胞與正常細胞相比處于氧化還原異常的狀態(tài)[20], 而細胞內(nèi)的抗氧化酶GPx能降低細胞內(nèi)ROS水平, 削弱癌細胞的生存優(yōu)勢, 降低其運動侵襲能力, 因此GPx模擬物UWQ能發(fā)揮降低癌細胞運動侵襲能力的作用.

Fig.4 Cell migratory ability(A) and relative wound closue(B) of HepG2 cells treated by WUQ for 24 h

基底的降解是腫瘤侵襲和轉移的重要過程, 基質金屬蛋白酶MMP-9是參與基底降解的最重要基質金屬蛋白酶(MMP)之一[21]. 通過Western blot技術檢測了UWQ對HepG2細胞中MMP-9表達的影響[圖5(A)]. HepG2細胞中MMP-9明顯表達, 分別在92000和83000處顯示前體(pro-MMP-9)和活化型(MMP-9)的特異條帶. 加入不同濃度的UWQ均能抑制該蛋白的表達[圖5(B)], 經(jīng)5, 10和15 μmol/L UWQ處理的HepG2細胞中pro-MMP-9(MMP-9)的表達率分別為61.2%(66.3%), 40.9%(45.8%)和26.3%(24.7%), 表明UWQ可抑制92000前體生成, 進而導致83000活化型的減少. 上述結果說明, UWQ能明顯抑制MMP-9的表達, 且呈現(xiàn)一定的計量依賴關系. 由于癌細胞的浸潤和轉移的起始都是從分泌基質金屬蛋白酶開始的, 而UWQ抑制MMP-9蛋白表達即可減少基底的降解, 從而降低了腫瘤細胞的侵襲性. 由于癌細胞內(nèi)異常增加的活性氧(ROS)具有刺激其增殖、 轉移及提高基因突變率等生物學功能[22], 而GPx模擬物UWQ可以高效地清除癌細胞內(nèi)的ROS, 通過抑制MMP-9蛋白表達的方式降低腫瘤細胞的侵襲性, 這與劃痕愈合實驗結果一致.

Fig.5 Western blot analysis of MMP-9 and AFP protein expression(A) and relative protein expression(B) in HepG2 cells treated by WUQ for 24 h(B) Error bars represent mean±SE for n=3. # p<0.05; ## p<0.01.

肝癌的侵襲和轉移是其最主要的生物特征, 甲胎蛋白(AFP)是肝癌發(fā)生、 侵襲過程中表達的重要蛋白質, 是肝癌診斷的標志性蛋白. 采用不同劑量的UWQ處理HepG2細胞12 h后, 提取細胞總蛋白進行Western blot檢測. 結果表明, 與未經(jīng)UWQ處理的HepG2細胞相比, 經(jīng)UWQ處理的HepG2細胞的AFP蛋白表達均被抑制, 且呈現(xiàn)劑量依賴關系, 當UWQ濃度為15 μmol/L時抑制率可達83.7%[圖5(B)]. HepG2細胞表達的AFP蛋白是促進癌細胞的生長、 增殖及遷移等生理現(xiàn)象的重要蛋白, 而能夠抑制AFP蛋白表達的UWQ可以有效抑制上述生理現(xiàn)象的產(chǎn)生, 與細胞存活率、 劃痕愈合及MMP-9蛋白表達的研究結果一致.

綜上所述, 合成了由天然GPx催化三聯(lián)體U, W和Q組成的6個具有GPx活力的含硒三肽, 研究了催化三聯(lián)體中各氨基酸殘基的活力貢獻規(guī)律, 證明了活力最佳的UWQ是一種能有效抑制肝癌侵襲和轉移的GPx模擬物, 具有開發(fā)成預防和治療肝癌藥物的應用前景.

[1] Flohé L., Günzler W. A., Schock H. H.,FEBSLett., 1973, 32(1), 132—134

[2] Toppo S., Flohé L., Ursini F., Vanin S., Maiorino M.,Biochim.Biophys.Acta, 2009, 1790(11), 1486—1500

[3] Epp O., Ladenstein R., Wendel A.,Eur.J.Biochem., 1983, 133(1), 51—69

[4] Lv S. W., Wang X. G., Mu Y., Zang T. Z., Liu J. Q., Shen J. C., Luo G. M.,FEBSJ., 2007, 274(15), 3846—3854

[5] Dong Z. Y., Luo Q., Liu J. Q.,Chem.Soc.Rev., 2012, 41, 7890—7908

[6] Mugesh G., du Mont W. W., Sies H.,Chem.Rev., 2001, 101, 2125—2180

[7] Satheeshkumar K., Mugesh G.,Chem.Eur.J., 2011, 17(17), 4849—4857

[8] Selvakumar K., Shah P., Singh H. B.,Chem.Eur.J., 2011, 17(45), 12741—12755

[9] Chen W. Q., Zheng R. S., Zeng H. M., Zou X. N., Zhang S. W., He J.,ChinaCancer, 2015, 24(1), 1—10(陳萬青, 鄭榮壽, 曾紅梅, 鄒小農(nóng), 張思維, 赫捷. 中國腫瘤, 2015, 24(1), 1—10)

[10] Koide T., Itoh H., Otaka A.,Yasui H., Kuroda M., Esaki N., Soda K., Fuji N.,Chem.Pharm.Bull., 1993, 41(3), 502—506

[11] Cheng B. P., Li L. S., Zhou R. D., Li L., Zhang H. F.,Chem.J.ChineseUniversities, 2015, 36(5), 872—880(程彪平, 李來生, 周仁丹, 李良, 張宏福. 高等學?；瘜W學報, 2015, 36(5), 872—880)

[12] Liu Z. J., Hou Y. L., Zhang G. G., Xu N., Mi B., Gong P., Zhao Y. F.,Chem.Res.ChineseUniversities, 2015, 31(4), 235—243

[13] Wang C., Shen N., Yan G. L.,Sui C. H., Zhuang J. J., Lü S. W., Luo G. M., Mu Y.,Int.J.Pept.Res.Ther., 2014, 20(3), 307—324

[14] Wang W. Q., Shi A. P., Fan Z. M.,Chem.Res.Chinese.Universities, 2014, 30(2), 108—113

[15] Lü B. C., Dong S., Xue Q., Zong H., Lü S. W., Luo G. M.,Chem.J.ChineseUniversities, 2013, 34(9), 2146—2151(呂冰聰, 董森, 薛嶠, 宗慧, 呂紹武, 羅貴民. 高等學校化學學報, 2013, 34(9), 2146—2151)

[16] Iwaoka M., Tomoda S.,J.Am.Chem.Soc., 1994, 116(6), 2557—2561

[17] Takebe G., Yarimizu J., Saito Y.,Hayashi T., Nakamura H., Yodoi J., Nagasawa S., Takahashi K.,J.Biol.Chem., 2002, 277(43), 41254—41258

[18] Bell I., Hilvert D.,Biochemistry., 1993, 32(50), 13969—13973

[19] Ren B., Huang W., Akesson B., Ladenstein R.,J.Mol.Biol., 1997, 268(5), 869—885

[20] Lau A. T., Wang Y., Chiu J. F.,J.Cell.Biochem., 2008, 104(2), 657—667

[21] Siegel R., Naishadham D., Jemal A.,Ca-Cancer.J.Clin., 2013, 63(1), 11—30

[22] Marina S. K., Elizaveta S. E.,Plos.One., 2013, 8(10), e77469

? Supported by the National Major Scientific Instruments Development Project, China(No.2013YQ470781) and the Natural Science Foundation of Jilin Province, China(No.20130101159JC).

Tripeptide Containing Selenium with Glutathione Peroxidase Activity?

YIN Juxin1,2, LI Zuhong1,3, MU Ying1,3, Lü Shaowu1,2*, LUO Guimin1

(1.KeyLaboratoryforMolecularEnzymologyandEngineering,MinistryofEducation,2.CollegeofLifeSciences,JilinUniversity,Changchun130012,China;3.InstituteofCyber-SystemsandControl,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)

Six selenium-containing tripeptides(QUW, QWU, WQU, WUQ, UWQ and UQW) were synthesized by solid-phase synthesis technology based on the catalytic triad of native glutathione peroxidase(GPx). The GPx activities and the kinetics of the tripeptide were determined by the enzyme coupling method. The effects of tripeptide on HepG2 cells growth and migration were assessed using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay, wound assay and Western blot method. The results showed that the GPx activity of the tripeptide with U at the amino terminal was higher than that of U at the middle position or the carboxyl terminal. Among the six tripeptide, the activity of UWQ catalyzed by glutathione(GSH) reduced by hydrogen peroxide(H2O2) was higher than those of other tripeptides, and its catalytic mechanism was Ping-Pong mechanism. UWQ can dosedependently discrease migration speed of HepG2 cells to exercise, and reduce the invasion and metastasis of HepG2 cells.

Gluathione peroxidase; Mimics; Tripeptide containing selenium

2016-02-18.

日期: 2016-06-16.

國家重大科學儀器設備開發(fā)專項(批準號: 2013YQ470781)和吉林省自然科學基金(批準號: 20130101159JC)資助.

10.7503/cjcu20160101

O629; Q554+.6

A

?2016-02-17. 網(wǎng)絡出版日期: 2016-06-15.

聯(lián)系人簡介: 呂紹武, 男, 博士, 副教授, 主要從事模擬酶方面的研究. E-mail: lvsw@jlu.edu.cn