方 潔 徐 浩 魏 芬,2 李菁楠 丁承超 劉武康 丁之恩

(安徽農(nóng)業(yè)大學1 ，合肥 230036)

(安徽工商職業(yè)學院2，合肥 230036)

菜籽粕發(fā)酵脫毒效果模糊評判

方 潔1徐 浩1魏 芬1,2李菁楠1丁承超1劉武康1丁之恩1

(安徽農(nóng)業(yè)大學1，合肥 230036)

(安徽工商職業(yè)學院2，合肥 230036)

為了有效降低或脫除菜籽粕中抗營養(yǎng)因子含量，增強安全性，以菜籽粕為原料，就單菌、混菌及二次發(fā)酵方式開展發(fā)酵脫毒研究。以植酸、硫苷、芥子堿和異硫氰酸酯含量為考核指標，在此基礎(chǔ)上建立模糊綜合評判模型。結(jié)果表明：混菌發(fā)酵和二次發(fā)酵脫毒綜合效果較好，在混菌發(fā)酵中，硫苷、異硫氰酸酯、植酸和芥子堿的降解率分別達到75.12%、82.47%、87.56%、56.00%；在二次發(fā)酵中硫苷、異硫氰酸酯、植酸和芥子堿的降解率分別達到76.87%、78.57%、82.58%、68.00%。此外，模糊綜合評價結(jié)果顯示：二次發(fā)酵粕在等級評價中，達到I級水平，脫除抗營養(yǎng)因子效果最好。

菜籽粕脫毒 單菌發(fā)酵 混菌發(fā)酵 二次發(fā)酵 模糊綜合評價

菜籽粕是僅次于豆粕的植物蛋白源，我國年產(chǎn)量約有700萬t[1]。其蛋白質(zhì)含量較高, 氨基酸組成較平衡, 但菜籽粕含有硫代葡萄糖苷(簡稱硫苷)及其降解產(chǎn)物異硫氰酸酯，以及植酸、芥子堿等抗營養(yǎng)因子, 并且作為飼料適口性差，過多采食該類食物的動物易產(chǎn)生中毒現(xiàn)象，造成臟器(如甲狀腺和肝臟)損傷，這種毒性特點制約了菜籽粕的利用價值及其產(chǎn)品開發(fā)[2-3]。在脫毒方法研究中，采用微生物降解脫毒，具有成本低，操作簡便，營養(yǎng)損失小的特點。

目前，對菜籽粕發(fā)酵脫毒的研究主要集中在微生物菌種分離、篩選[4]。此外，有研究表明，菜籽粕的脫毒作用主要是由霉菌、細菌引起的,放線菌次之,在適宜溫度下，酵母菌能將無機氮轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì),使蛋白含量增加[5]。對于葡萄糖和硫酸銨添加量、料水比、接種量、起始pH、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間等發(fā)酵脫毒條件控制也有研究報道[6]。同時，有研究表明，采用分步發(fā)酵脫除抗營養(yǎng)物質(zhì)效果較好，不僅能減少抗營養(yǎng)因子，并且營養(yǎng)物質(zhì)也有所提高，脫毒產(chǎn)品風味較好[7]。但是，從模糊綜合評價角度來評判菜籽粕脫毒綜合效果和發(fā)酵條件的互補效益研究較少。

為進一步有效脫除菜籽粕抗營養(yǎng)因子含量，本研究通過聯(lián)合模糊綜合評價模型對菜籽粕、單菌發(fā)酵粕、混菌發(fā)酵粕及二次發(fā)酵粕中抗營養(yǎng)物質(zhì)成分進行綜合評價。利用數(shù)學理論對抗營養(yǎng)因子試驗數(shù)據(jù)進行處理和運算,使得菜籽粕抗營養(yǎng)因子含量評價結(jié)果有理可依。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

菜籽粕原料(原料粕)：合肥鑫海油脂有限公司，60 ℃干燥2 h，粉碎，60目過篩，干燥器內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

氯化鈀：上海滬試實驗室器材股份有限公司；植酸鈉：上海源葉生物科技公司；D201大孔陰離子交換樹脂：安徽皖東化工有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162：上海一恒科技有限公司；超凈工作臺SW-CJ-2D：蘇州凈化設(shè)備有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋41280：上海華線醫(yī)用核子儀器公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菜籽粕微生物脫毒試驗1.2.1.1 菌株培養(yǎng)及種子液制備

微生物菌種(黑曲霉、啤酒酵母、枯草芽孢桿菌和保加利亞乳桿菌)取自安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品學院實驗室備用菌。分別接種一環(huán)到100 mL已滅菌液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，制成母液，再分別吸取母液1 mL到100 mL已滅菌液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，即為種子液，其中保加利亞乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基，枯草芽抱桿菌接種到腦心浸出液(BHI)肉湯培養(yǎng)基，黑曲霉、啤酒酵母分別接種到改良馬丁培養(yǎng)基。

1.2.1.2 菜籽粕發(fā)酵培養(yǎng)基制備

取40%菜籽粕，加入碳源和氮源(0.25%葡萄糖和1.5%硫酸銨)和60%水，混勻，分裝于培養(yǎng)皿上，每個培養(yǎng)皿裝量15 g，自然pH，121 ℃滅菌15 min，配置成菜籽粕發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.1.3 單菌種固體發(fā)酵

吸取各種子液1.5 mL分別接種到菜籽粕發(fā)酵培養(yǎng)基上，平行3次，33 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，發(fā)酵完成后干燥粉碎過60目篩干燥器保存?zhèn)溆?，重復試?次。

1.2.1.4 混菌發(fā)酵

依據(jù)菌株復配原理和菌株生長繁殖進程，以4種菌株種子液1∶1∶1∶1的比例接種到已滅菌的菜籽粕發(fā)酵培養(yǎng)基上，控制總接種量為10%(各0.375 mL)，33 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，發(fā)酵完成后干燥粉碎過60目篩干燥器保存?zhèn)溆茫貜驮囼?次。

1.2.1.5 二次發(fā)酵

二次發(fā)酵首先以黑曲霉與啤酒酵母為1∶1的混合比例接種到已滅菌的菜籽粕發(fā)酵培養(yǎng)基上，控制總接種量為10%(各0.75 mL)，33 ℃有氧發(fā)酵2 d。發(fā)酵完成后，粉碎過60目篩，60 ℃干燥2 h，得到一步發(fā)酵粕。然后以一步發(fā)酵粕加入60%水分含量配置一步發(fā)酵粕培養(yǎng)基，再以保加利亞乳桿菌與枯草芽孢桿菌為1∶1的混合比例接種到已滅菌的一步發(fā)酵粕培養(yǎng)基上，控制總接種量10%(各0.75 mL)，33 ℃厭氧發(fā)酵2 d，發(fā)酵完成后干燥粉碎過60目篩干燥器保存?zhèn)溆茫貜驮囼?次。

1.2.1.6 考核指標

菜籽粕微生物脫毒試驗考核指標及測定方法見表1。

表1 考核指標及測定方法

1.2.2 模糊綜合評價

根據(jù)菜籽粕微生物脫毒試驗結(jié)果，參照張欣等[12]對河口濕地的水環(huán)境質(zhì)量的模糊綜合評價方法，改進評價等級，建立菜籽粕模糊綜合評價模型。

1.2.2.1 模糊綜合評判的數(shù)學模型建立

根據(jù)菜籽粕毒性大小影響因素，同時經(jīng)文獻報道分析研究[13]，最終確立評判菜籽粕脫毒效果影響較大的4個相關(guān)評價因素U,即U={u1(硫苷含量),u2(異硫氰酸酯含量),u3(植酸含量),u4(芥子堿含量)}。依據(jù)發(fā)酵后的硫苷、異硫氰酸酯、植酸、芥子堿含量與飼料標準及國標中規(guī)定的含量等級標準，確定4個評價等級，即V={Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ}，如表2。

表2 菜籽粕脫毒效果評價等級各物質(zhì)含量/mg/g

1.2.2.2 隸屬函數(shù)與模糊矩陣的確定

采用模糊分布曲線中的“梯形分布”確定各個元素的隸屬函數(shù),確定隸屬函數(shù)的表達式。

Ⅰ級脫毒效果隸屬函數(shù)表達式為：

Ⅱ,Ⅲ級脫毒效果隸屬函數(shù)表達式為：

Ⅳ級脫毒效果隸屬函數(shù)表達式為：

式中：xi為第i個評價因子的實測值；sij-1,sij,sij+1分別為各評價因子的第j-1,j,j+1級標準值。

把各評價因子的實測值代入相應(yīng)的隸屬函數(shù),計算出每一個評價因子對于各評價等級的隸屬度,得到U和V之間的模糊關(guān)系矩陣R。

式中：rij(i=1,2,3,4;j=1,2,3,4)為第i種抗營養(yǎng)物質(zhì)可以被評為第j級菜籽粕脫毒質(zhì)量的可能性,即i對j的隸屬度。

1.2.2.3 各評價因子權(quán)重分配矩陣的建立

由于各個評價因素在菜籽粕總脫毒中所起的作用是不同的,對菜籽粕脫毒效果進行合理的分析就需要對各個評價因素進行權(quán)重計算。這樣既突出了評價中主要評價因子的作用,還充分考慮了不同脫毒標準值的差異。

權(quán)重的計算公式:

Wi=Ci/Si

式中：Wi為第i種抗營養(yǎng)因子的權(quán)重值;Ci為第i種抗營養(yǎng)因子的實測值;Si為第i種各種抗營養(yǎng)因子標準值的算數(shù)平均值。

進行歸一化運算得:

式中：m=1,2,…,4;n=1,2,…,4。得到1個1×4的模糊矩陣,即各評價因子的權(quán)重分配矩陣A。

A=(a1,a2,a3,a4)

1.2.2.4 確定模糊綜合評判矩陣

在確定了U與V之間的模糊關(guān)系矩陣R與權(quán)重分配矩陣A之后,要得到菜籽粕脫毒效果的模糊綜合評判結(jié)果還需要進行A與R的模糊關(guān)系合成計算,最終得到V上的一個模糊子集B，即模糊綜合評判的數(shù)學模型。

B=A°R={b1,b2,b3,b4}

bj=(∨*(ai∧*rij)j=(1,2,3,4),記為M(∧*,∨*)

式中：° 表示模糊矩陣合成算子,即M(∧*,∨*)。根據(jù)最大隸屬度原則,選擇max(bj)1×4作為對菜籽粕脫毒效果評價的評判依據(jù)。

1.2.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003軟件，應(yīng)用矩陣函數(shù)進行矩陣運算。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽粕發(fā)酵脫毒結(jié)果

2.1.1 單菌發(fā)酵結(jié)果

對原料粕和4種單菌發(fā)酵粕中各抗營養(yǎng)因子進行測定，重復3次，求平均值，見表3。

表3 單菌發(fā)酵粕中各抗營養(yǎng)因子測定結(jié)果/mg/g

從表3中，可以看出保加利亞乳桿菌、黑曲霉、啤酒酵母分別使硫苷、芥子堿、植酸含量降到最低，可能是因為不同菌種產(chǎn)酶種類及數(shù)量不同。此外，經(jīng)過黑曲霉發(fā)酵的菜籽粕，異硫氰酸酯含量達到最低，可能是因為黑曲霉喜好異硫氰酸酯，能將經(jīng)硫苷分解的異硫氰酸酯消耗掉。

2.1.2 混菌發(fā)酵結(jié)果

經(jīng)過混菌發(fā)酵的菜籽粕，硫苷、異硫氰酸酯、植酸和芥子堿含量分別降低到0.73、0.27、5.00、4.40 mg/g。對比原料粕中各抗營養(yǎng)因子含量，可以得出，混菌發(fā)酵粕中各抗營養(yǎng)因子含量均有效的得到控制，綜合脫毒效果較佳。

2.1.3 二次發(fā)酵結(jié)果

經(jīng)過二次發(fā)酵的菜籽粕，硫苷、異硫氰酸酯、植酸和芥子堿含量分別降低到0.68、0.33、7.00、3.20 mg/g。同混菌發(fā)酵結(jié)果相近，能達到綜合脫除抗營養(yǎng)因子的目的。此外，經(jīng)過二次發(fā)酵得到的發(fā)酵粕風味較好，可能是因為在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了乳酸等小分子物質(zhì)。

2.1.4 單菌、混菌及二次發(fā)酵各抗營養(yǎng)因子降解率結(jié)果

將6種發(fā)酵粕與原料粕中各抗營養(yǎng)因子含量進行對比，得到降解率含量如圖1。

圖1 單菌、混菌及二次發(fā)酵各抗營養(yǎng)因子降解率

從圖1可以看出，不同菌種對于不同的抗營養(yǎng)因子脫除效果不同，保加利亞乳桿菌對于硫苷及異硫氰酸酯降解率達到最大，分別為74.83%、74.67%；啤酒酵母對于植酸的降解率達到71.39%；黑曲霉對于芥子堿的降解率達到76.00%。此外，混菌發(fā)酵與二次發(fā)酵對抗營養(yǎng)因子的脫除效果較好，在混菌發(fā)酵中，硫苷、異硫氰酸酯、植酸和芥子堿的降解率分別為75.12%、82.47%、87.56%、56%；在二次發(fā)酵中硫苷、異硫氰酸酯、植酸和芥子堿的降解率分別為76.87%、78.57%、82.58%、68%。混菌發(fā)酵和二次發(fā)酵可能由于產(chǎn)酶種類比較豐富，對各抗營養(yǎng)因子的脫除都有一定的效果，而單菌發(fā)酵可能對某種抗營養(yǎng)因子脫除效果有優(yōu)勢。

2.2 模糊綜合評判試驗結(jié)果

根據(jù)菜籽粕發(fā)酵脫毒試驗結(jié)果，參評對象及參評因子實測值見表4，表4中的序號對應(yīng)各參評對象，結(jié)果中用序號指代。

表4 各抗營養(yǎng)因子測定結(jié)果/mg/g

2.2.1 模糊關(guān)系矩陣的確定

將原料粕中各參評因子的實測值代入隸屬函數(shù)表達式，計算出每一個評價因子對于各評價等級的隸屬度，得到模糊矩陣R1的結(jié)果。

同理可得其他6種發(fā)酵粕對應(yīng)的模糊矩陣：

2.2.2 權(quán)重的計算

依據(jù)權(quán)重的計算公式，原料粕權(quán)重分配矩陣計算過程見表5。

表5 原料粕抗營養(yǎng)因子含量大小評價權(quán)重計算結(jié)果

得到歸一化權(quán)重分配矩陣為:A1=(0.1510.316 0.276 0.257)。

同理可得其余6種發(fā)酵粕權(quán)重分配矩陣：

A2=(0.257 0.194 0.346 0.194)

A3=(0.163 0.283 0.231 0.324)

A4=(0.120 0.279 0.258 0.342)

A5=(0.118 0.249 0.318 0.318)

A6=(0.156 0.230 0.143 0.471)

A7=(0.150 0.291 0.206 0.353)

2.2.3 模糊綜合評判結(jié)果

由模糊算法計算模糊子集B結(jié)果：

B1=A1゜R1=(0 0.009 0.142 0.849)

maxbj=0.849,所以原料菜籽粕含抗營養(yǎng)因子等級為Ⅳ。同理得出：

B2=A2゜R2=(0.170 0.752 0.069 0)

B3=A3゜R3=(0.354 0.598 0.047 0)

B4=A4゜R4=(0.120 0.612 0.267 0)

B5=A5゜R5=(0.118 0.775 0.110 0)

B6=A6゜R6=(0.317 0.588 0.094 0)

B7=A7゜R7=(0.695 0.305 0 0)

單菌發(fā)酵粕和混菌發(fā)酵粕抗營養(yǎng)因子含量等級被評為Ⅱ級，其中混菌發(fā)酵粕被評價的最大隸屬度的值最小，為0.588，而又在等級Ⅰ中又占了0.317，優(yōu)于各單菌發(fā)酵粕。二次發(fā)酵粕抗營養(yǎng)因子含量等級為Ⅰ級，綜合評價效果最好。

3 結(jié)論

采用模糊綜合評判在菜籽粕脫除抗營養(yǎng)因子效果中的運用,利用數(shù)學理論對抗營養(yǎng)因子實驗數(shù)據(jù)進行處理和運算,使得菜籽粕抗營養(yǎng)因子含量評價結(jié)果有理可依。今后在菜籽粕脫毒效果評價中也可廣泛推廣模糊綜合評判的方法,為菜籽粕蛋白資源的利用提供科學可靠的依據(jù)。利用模糊綜合評判的方法不僅可以從總體上把握菜籽粕抗營養(yǎng)因子含量,還可以從局部看到變化,評判結(jié)果更為全面、有效。

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Fuzzy Evaluation for Detoxification Effect of Rapeseed Meal After Fermenting

Fang Jie1Xu Hao1Wei Fen1,2Li Jingnan1Ding Chengchao1Liu Wukang1Ding Zhien1

(Anhui Agricaltural University1，Hefei 230036)(Anhui Vocational College of Business2，Hefei 230036)

This experiment’s purpose was to effectively reduce or remove the content of anti-nutritional factors in rapeseed meal and to enhance security. Using rapeseed meal as raw material, the way of fermentation was chosen among single fermentation, mixed fermentation and two-step fermentation. Fuzzy comprehensive evaluation model based on the assessment indicators about the contents of glucosinolates, isothiocyanate, phytic acid and sinapine. The results showed that: mixed fermentation and two-step fermentation were better, the contents of glucosinolate, isothiocyanate, phytic acid and sinapine in the mixed fermentation improved by 75.12%, 82.47%, 87.56% and 56% respectively; and in the two-step fermentation improved by 76.87%, 78.57%, 82.58% and 68% respectively. In addition, fuzzy comprehensive evaluation results show: the two-step fermentation meal reached I level in grade evaluation, the removal of anti-nutritional factors was best.

rapeseed meal detoxification, single fermentation, mixed fermentation, two-step fermentation, fuzzy comprehensive evaluation

TQ645.9+9

A

1003-0174(2016)03-0096-05

國家科技支撐計劃(2012BAD14B13)

2014-08-07

方潔，女，1989年出生，碩士，食品科學

丁之恩，男，1956年出生，教授，功能食品