汪曉東，甄玉國(guó)*，趙 巍，王蘭惠， 張學(xué)峰， 甄雪冰

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉農(nóng)博瑞奶?？萍佳邪l(fā)中心，吉林長(zhǎng)春 130118）

科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

四種微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

汪曉東1，2，甄玉國(guó)1，2*，趙 巍1，2，王蘭惠1，2， 張學(xué)峰1，2， 甄雪冰1，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉農(nóng)博瑞奶牛科技研發(fā)中心，吉林長(zhǎng)春 130118）

為了解四種不同微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，采用瘤胃體外批次培養(yǎng)，在體外發(fā)酵的底物中分別加入四種微生態(tài)制劑，然后對(duì)瘤胃內(nèi)環(huán)境的pH、氨態(tài)氮 （NH3-N）、干物質(zhì)降解率、產(chǎn)氣量和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)四種微生態(tài)制劑對(duì)瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)會(huì)起到不同的作用，與對(duì)照組相比，微生態(tài)制劑2組、微生態(tài)制劑3組均可顯著降低NH3-N的含量，提高干物質(zhì)的降解率（P＜0.01），而微生態(tài)制劑4組的作用特點(diǎn)在于有效降低NH3-N的含量。通過(guò)多項(xiàng)指標(biāo)綜合指數(shù)（MFAEI）評(píng)定得出微生態(tài)制劑組發(fā)酵效果最佳。

微生態(tài)制劑；產(chǎn)品；體外發(fā)酵；綿羊

微生態(tài)制劑是利用正常微生物或促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)制成的活的微生物制劑。近年來(lái)，利用微生態(tài)制劑調(diào)整或維持動(dòng)物腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，已成為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)之一（李曉麗等，2015；付曉政等，2014；潘美娟等，2014）。本試驗(yàn)選取幾種國(guó)內(nèi)外知名廠家的微生態(tài)制劑產(chǎn)品，旨在比較研究其對(duì)綿羊瘤胃pH、氨態(tài)氮（NH3-N）、干物質(zhì)降解率、產(chǎn)氣量、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及產(chǎn)品來(lái)源 試驗(yàn)綿羊飼養(yǎng)在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場(chǎng)，試驗(yàn)精料B211由長(zhǎng)春博瑞飼料集團(tuán)有限公司提供。試驗(yàn)微生態(tài)制劑產(chǎn)品的形態(tài)和主要成分見表1。

表1 微生態(tài)制劑的形態(tài)和主要成分

1.2 飼養(yǎng)管理 選取3只12月齡體重為 （30± 2.37）kg體況良好、安裝永久性瘤胃瘺管的小尾綿羊（半同胞公羊），用于瘤胃液的采集。精粗比設(shè)定為50∶50；每天飼喂2次（8∶00、16∶00），精料補(bǔ)充料分別在早晚添加；保證充足、清潔飲水，每天觀察羊只健康狀態(tài)，定期清理瘺管4周。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)采取單因子區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用瘤胃體外批次培養(yǎng)的方法，試驗(yàn)設(shè)定精粗比為50∶50，即0.5 g精料+0.5 g羊草，共5個(gè)處理組，每種產(chǎn)品設(shè)置6、12、24 h三個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，最終描繪四種微生態(tài)制劑瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。添加量按產(chǎn)品說(shuō)明書建議用量進(jìn)行添加，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 瘤胃體外批次培養(yǎng)方法

1.4.1 緩沖液配制 緩沖液的配制和加入量、培養(yǎng)裝置的安裝分別參照 Menke和 Steingass （1988）、潘美娟（2014）的方法。

1.4.2 體外批次培養(yǎng)方法 晨飼（8∶00）前1 h從綿羊瘤胃內(nèi)上下左右不同位點(diǎn)用硬質(zhì)PVC管采集足量瘤胃液，灌入經(jīng)預(yù)熱達(dá)39℃并通有CO2的保溫瓶中，灌滿后立即蓋嚴(yán)瓶口，迅速返回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)四層紗布過(guò)濾（期間應(yīng)將溫度保持在39℃左右并盡可能減少與空氣接觸），之后持續(xù)通入CO2氣體5min，然后迅速分裝至上述已預(yù)熱好并通有CO2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（每個(gè)培養(yǎng)瓶加20 mL瘤胃液，40mL緩沖液），開始培養(yǎng)。

1.4.3 測(cè)定指標(biāo)及方法 于培養(yǎng)的第1、2、4、6、12、24 h通過(guò)注射器測(cè)定各發(fā)酵瓶中的產(chǎn)氣量，繪制產(chǎn)氣量變化曲線，于培養(yǎng)的6、12、24 h采集各處理組的產(chǎn)品，立即測(cè)定pH，取1.5 mL培養(yǎng)液于EP管中，10000 r/min離心10min，取1mL上清液，加25%偏磷酸溶液0.2 mL混勻，-20℃保存待測(cè)VFA；另取1.5 mL培養(yǎng)液-20℃保存，待測(cè)NH3-N。pH采用酸度計(jì)直接測(cè)定；VFA采用Agilent Technologies 7890A氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定（馮宗慈和高民，2010）；NH3-N采用亞硝基鐵氰化鈉比色法測(cè)定（王曉磊等，2014）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行比較分析，其中配對(duì)樣本用Duncan’s檢驗(yàn)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃體外培養(yǎng)pH的影響 由表3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，因采用瘤胃體外批次培養(yǎng)，產(chǎn)生的VFA不能被吸收，逐漸積累，導(dǎo)致各組pH呈逐漸下降的趨勢(shì)。24 h時(shí)，微生態(tài)制劑1組的pH顯著低于對(duì)照組、微生態(tài)制劑4組（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)，各組差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 不同微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃體外培養(yǎng)pH的影響

2.2 不同微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃體外培養(yǎng)NH3-N的影響 由表4可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組NH3-N濃度均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在6、12、24 h時(shí)，各個(gè)試驗(yàn)組NH3-N濃度均低于對(duì)照組。其中6 h時(shí)，微生態(tài)制劑3組NH3-N濃度極顯著低于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.01）；12 h時(shí)，與對(duì)照組相比，微生態(tài)制劑4組和微生態(tài)制劑2組NH3-N濃度極顯著降低（P＜0.01），分別降低了23.26%、17.44%；繼續(xù)培養(yǎng)至24 h時(shí)，試驗(yàn)組NH3-N濃度極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），分別降低了19.23%、14.10%、14.10%、11.54%。

表4 不同微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃體外培養(yǎng)NH3-N的影響mg/100mL

2.3 不同微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃干物質(zhì)降解率的影響 由表5可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組干物質(zhì)降解率呈上升趨勢(shì)，其中6 h時(shí)，與對(duì)照組相比，微生態(tài)制劑1組和微生態(tài)制劑2組干物質(zhì)降解率分別提高了8.58%和5.34%，極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；12 h時(shí)，微生態(tài)制劑1組和微生態(tài)制劑2組干物質(zhì)降解率極顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，微生態(tài)制劑4組降解率極顯著低于其他組（P＜0.01）。

表5 不同微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃體外培養(yǎng)干物質(zhì)降解率的影響 %

2.4 不同微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量的影響 由表6可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組的產(chǎn)氣量逐漸提高。其中微生態(tài)制劑1組和微生態(tài)制劑3組在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間產(chǎn)氣量均高于對(duì)照組，微生態(tài)制劑2組和微生態(tài)制劑4組在培養(yǎng)1h時(shí)產(chǎn)氣量低于對(duì)照組，其余培養(yǎng)時(shí)間產(chǎn)氣量均高于對(duì)照組，因?yàn)椴煌⑸鷳B(tài)制劑可以有效提高干物質(zhì)的降解率，所以試驗(yàn)組產(chǎn)生的氣體量均高于對(duì)照組。

表6 不同微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量的影響 mL

2.5 不同微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃體外培養(yǎng)VFA濃度的影響 由表7可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加各組乙酸、丙酸、丁酸和TVFA濃度逐漸上升，培養(yǎng)至6 h時(shí)，與對(duì)照組相比，乙酸的含量提高了1.8%，差異極顯著（P＜0.01），與其他組相比，微生態(tài)制劑1組顯著高于微生態(tài)制劑2組、微生態(tài)制劑3組和微生態(tài)制劑4組（P＜0.05）；丙酸、丁酸的含量微生態(tài)制劑1組顯著高于微生態(tài)制劑3組和微生態(tài)制劑4組 （P＜0.05），從TVFA來(lái)看，TVFA差異極顯著高于微生態(tài)制劑3組和微生態(tài)制劑4組（P＜0.01），其他各組差異均不顯著（P＞0.05）。培養(yǎng)至12 h，微生態(tài)制劑1組的丙酸、丁酸含量顯著高于微生態(tài)制劑4組，其他各組差異不顯著（P＞0.05）。培養(yǎng)至24 h，與對(duì)照相比，乙酸含量均不同程度高于對(duì)照組，其中微生態(tài)制劑1組和微生態(tài)制劑2組乙酸含量顯著提高（P＜0.05），微生態(tài)制劑1組、微生態(tài)制劑3組和微生態(tài)制劑4組丙酸的含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），從TVFA來(lái)看，與對(duì)照組相比，各組TVFA含量分別提高了2.7%、1.8%、1.4%、1.0%，但差異不顯著（P＞0.05）。

表7 不同微生態(tài)制劑對(duì)綿羊瘤胃VFA的影響mmol/L

2.6 不同微生態(tài)制劑對(duì)體外發(fā)酵指標(biāo)影響的綜合評(píng)定 對(duì)不同微生態(tài)制劑體外發(fā)酵指標(biāo)的組合進(jìn)行效應(yīng)綜合評(píng)定時(shí)，以對(duì)照組為參照，根據(jù)多項(xiàng)指標(biāo)綜合指數(shù)（MFAEI）（盧德勛，2003）進(jìn)行。將產(chǎn)氣量、pH、TVFA、NH3-N、干物質(zhì)消失率運(yùn)用綜合評(píng)定指標(biāo)MFAEI進(jìn)行綜合評(píng)定，結(jié)果見表8。

式中:MFAEI為各單項(xiàng)指標(biāo)（SFAEI）的加和值；n為時(shí)間點(diǎn)數(shù)；A1系0.0%各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)值；A2分別為1%、1.5%、2%各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)值；A3是在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)A2總和的平均數(shù)。

表8 不同微生態(tài)制劑對(duì)體外發(fā)酵指標(biāo)影響的綜合評(píng)定

從MFAEI看，只有微生態(tài)制劑1組的多項(xiàng)組合效應(yīng)指數(shù)是正值，MFAEI自高到低的排序?yàn)槲⑸鷳B(tài)制劑1組＞微生態(tài)制劑2組＞微生態(tài)制劑3組＞微生態(tài)制劑4組，因此微生態(tài)制劑1組發(fā)酵效果明顯優(yōu)于其他組。

3 討論

瘤胃發(fā)酵功能受多種因素的影響，主要體現(xiàn)在pH、NH3-N、VFA、干物質(zhì)降解率及產(chǎn)氣量等指標(biāo)上。

瘤胃pH是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵水平的基本指標(biāo)，它主要受唾液、飼糧及瘤胃微生物區(qū)系的影響，本試驗(yàn)中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組pH呈逐漸下降的趨勢(shì)。培養(yǎng)至24 h時(shí)，微生態(tài)制劑1組pH最低，并顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），這可能是由于采用瘤胃體外批次培養(yǎng)，產(chǎn)生的有機(jī)酸不能被吸收，逐漸積累導(dǎo)致的結(jié)果。

瘤胃體外發(fā)酵干物質(zhì)降解率和總產(chǎn)氣量的變化是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵功能的重要指標(biāo)。同時(shí)，一般認(rèn)為飼料干物質(zhì)的降解率與產(chǎn)氣量具有很強(qiáng)的相關(guān)性。干物質(zhì)降解率越高，瘤胃內(nèi)的環(huán)境就越適合微生物發(fā)酵，越有利于提高飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率（付曉政等，2014）。本試驗(yàn)中，因?yàn)槲⑸鷳B(tài)制劑1組和微生態(tài)制劑2組干物質(zhì)的降解率在6 h和12 h時(shí)極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），所以產(chǎn)氣量也相應(yīng)高于對(duì)照組，但各組產(chǎn)氣量差異不顯著（P＞0.05）。

NH3-N是反芻動(dòng)物瘤胃氮代謝過(guò)程中飼料含氮物降解的重要產(chǎn)物，同時(shí)也是瘤胃微生物合成菌體蛋白的主要原料，NH3-N質(zhì)量濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于瘤胃微生物的生長(zhǎng)繁殖，因此保持瘤胃液中適宜的NH3-N質(zhì)量濃度是保證菌體蛋白正常合成的前提條件。本試驗(yàn)中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組NH3-N濃度均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。但在6、12、24 h時(shí)，各個(gè)試驗(yàn)組NH3-N濃度均低于對(duì)照組，這表明添加微生態(tài)制劑能夠提高微生物對(duì)NH3-N的利用率。

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的VFA主要由進(jìn)入瘤胃的飼料中的碳水化合物被瘤胃微生物降解產(chǎn)生，是反芻動(dòng)物體內(nèi)重要的能量來(lái)源，可為反芻動(dòng)物提供所需能量的60%～70%（Dubuc，2009）。同時(shí)，VFA也是維持瘤胃功能及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素 （Li，2012），在瘤胃發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的TVFA中，乙酸、丙酸及丁酸所占比例最高，三者產(chǎn)量之和約占TVFA的95%。本試驗(yàn)中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加各組乙酸、丙酸、丁酸和TVFA逐漸上升，從TVFA來(lái)看，微生態(tài)制劑1組提高幅度最大，這也與微生態(tài)制劑1組pH最低相吻合。

4 結(jié)論

四種微生態(tài)制劑對(duì)瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)均有不同程度的作用，其中微生態(tài)制劑1組作用最為明顯，微生態(tài)制劑2組、微生態(tài)制劑3組的作用特點(diǎn)在于有效降低NH3-N的含量，提高干物質(zhì)降解率，而微生態(tài)制劑4組的作用特點(diǎn)在于有效降低NH3-N的含量。從MFAEI看，微生態(tài)制劑1組發(fā)酵效果明顯優(yōu)于其他組。

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The aim of this experiment was to explore the effect of four kinds of probiotics on rumen fermentation parameters in sheep.Added four kinds of probiotics in vitro fermentation substrates by in vitro rumen batch culture.Analysis the pH，NH3-N，VFA，degradation of dry matter rate and gas production of rumen environment.We found that four kinds of probiotics were varying degrees promoting on fermentation parameters.Compared with the control group，the point of the second probiotics and the third probiotics group was sigmificamtly reduced the concentration of NH3-N，improve dry matter disappearance，the fourth probiotics could reduce the concentration of NH3-N.From the multiple-factors associative effects index（MFAEI）.The results showed that the first productwas the best，the results for the four kinds of probiotics provide a theoretical basis for application in production practice.

probiotics；product；fermentation in vitro；sheep

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20162304

S816.7

A

1004-3314（2016）23-0016-04

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