杜雪玲， 余如剛， 宋運(yùn)賢， 張慧君 (淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000)

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金太陽杏花粉量及花粉活力測(cè)定研究

杜雪玲， 余如剛， 宋運(yùn)賢， 張慧君 (淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000)

[目的]比較金太陽杏花粉量及花粉活力的測(cè)定方法。[方法]采摘金太陽杏各單株已達(dá)氣球期、飽滿、正常、未開裂的花蕾，收集花粉，通過染色法、離體萌發(fā)法測(cè)定花粉活力，研究不同濃度的蔗糖、硼酸對(duì)花粉萌發(fā)花粉管的影響，并測(cè)定每枚花藥花粉量。[結(jié)果]通過2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法測(cè)定花粉活力為11.50%。對(duì)于離體萌發(fā)法，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃、培養(yǎng)基pH為6.5、蔗糖濃度為10%、硼酸濃度為25 μg/mL時(shí)花粉萌發(fā)花粉管效果最好，此時(shí)花粉活力為27.00%。金太陽杏花粉量測(cè)定用單枚花藥花粉量來衡量，測(cè)得單枚花藥花粉量平均為1 303。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為提高育種效率提供了理論依據(jù)。

金太陽杏；花粉量；花粉活力

花粉不僅是植物遺傳、育種、進(jìn)化、生殖的重要研究對(duì)象，也是孢粉分析、蜂群培育、藥物制造、醫(yī)療及生理實(shí)驗(yàn)的重要材料?；ǚ刍盍κ腔ǚ劬哂猩L(zhǎng)、萌發(fā)或發(fā)育的能力[1]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及農(nóng)業(yè)常規(guī)雜交育種中，研究花粉的生活力和育性是基礎(chǔ)性工作。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和育種工作通常會(huì)遇到由于花期不一致帶來的困難，為解決這一難題，保存花粉的活力成為重要手段，而在貯藏花粉之前必須先檢測(cè)花粉的活力。不同種類植物花粉的自然壽命、適宜的貯藏方式及花粉活力適宜的測(cè)定方法不同。因此，掌握花粉活力的檢測(cè)方法對(duì)提高育種效率有重要意義。

花粉活力的測(cè)定方法通常有形態(tài)學(xué)測(cè)定法、染色法、萌發(fā)測(cè)定法、田間授粉測(cè)定法和無機(jī)酸檢測(cè)法。形態(tài)學(xué)測(cè)定法的基本原理是根據(jù)花粉自身的形狀來判斷花粉生活力[2]。該方法雖然簡(jiǎn)單，但測(cè)定有活力的花粉與實(shí)際值相差太大，且重復(fù)之間差異比較明顯，一般不采用。田間授粉檢測(cè)法的基本原理是根據(jù)果實(shí)和種子的形成情況來判斷花粉生活力。雖然該方法較精確和可靠，可以得出花粉的活力，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還受到田間氣候、環(huán)境條件及母本植株性狀的影響。無機(jī)酸檢測(cè)法是靠經(jīng)過無機(jī)酸處理后，花粉會(huì)出現(xiàn)萌發(fā)孔有膨脹外突起的現(xiàn)象來判斷花粉是否有活力，但花粉吸水后也會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象，因此，采用無機(jī)酸不能判斷花粉是否真正具有活力[3-4]。染色法雖然簡(jiǎn)單、快速且能夠在一定程度上直接反映花粉的活力，但受花粉特性的影響較大，不能直接表現(xiàn)出花粉的萌發(fā)率，所以不同植物應(yīng)采用不同的染色法來檢測(cè)花粉的活力。為此，筆者采用染色法中的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法、碘-碘化鉀染色測(cè)定法、醋酸洋紅染色測(cè)定法測(cè)定了金太陽杏花粉活力，以期為提高育種效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料以金太陽杏為供試植物。采集金太陽杏各單株已達(dá)氣球期、飽滿、正常、即將開裂的花蕾，用鑷子收集其花藥，在培養(yǎng)皿薄薄鋪一層，25 ℃培養(yǎng)2 d，花粉即可爆出，在貯藏之前檢測(cè)花粉活力[5]。

1.2 方法

1.2.1染色法測(cè)定花粉活力。

(1)碘-碘化鉀染色測(cè)定法。杏花在花粉成熟時(shí)積累淀粉較多，通常可用碘-碘化鉀染成藍(lán)色。發(fā)育不良的花粉常呈畸形，不積累淀粉，用碘-碘化鉀染色，不呈藍(lán)色，而呈黃褐色。取載玻片撒少量花粉，滴1～2滴碘-碘化鉀溶液，35 ℃水浴中溫浴20 min，然后在顯微鏡下觀察，凡被染成藍(lán)色的為發(fā)育好、活力強(qiáng)的花粉粒，呈黃褐色的為發(fā)育不良的花粉粒[6]。

(2)醋酸洋紅染色測(cè)定法。其染色原理是靠花粉中的脫氫輔酶而染色，有活力的花粉被染成紅色，部分失去活力的呈現(xiàn)粉紅色，無活力或不育的花粉無色[7]。取載玻片撒少量花粉，滴1～2滴醋酸洋紅溶液，染色30 min后顯微鏡下觀察，凡被染成紅色的花粉為有活力的花粉，未被染色的花粉為無活力的花粉[8]。

(3)TTC染色測(cè)定法。TTC是一種氧化還原染料，水溶液無色。基本原理：當(dāng)TTC滲入細(xì)胞后，遇到活細(xì)胞中的脫氫酶接受氫離子，由無色的氧化型變成紅色的還原型不溶于水的化合物[9]，以此來判斷花粉的生活力。取少量花粉置于載玻片上，加上1滴TTC溶液，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，然后置于35 ℃恒溫箱中染色15～20 min。于10×10倍鏡下觀察，凡具有活力的花粉被染成紅色，部分喪失活力的花粉呈現(xiàn)粉紅色，無色是無活力或不育的花粉粒。制作3個(gè)裝片，每片取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)其花粉的活力百分率。

1.2.2花粉萌發(fā)測(cè)定法。配制蔗糖濃度為5%、10%、15%，硼酸濃度為25、50、75 μg/mL的培養(yǎng)基，pH為6.5，用滴管吸取少量培養(yǎng)基，趁熱滴在載玻片上，放置片刻使其凝固，將少量花粉均勻撒播在培養(yǎng)基上。將制好的片子放在墊有甘油濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在25 ℃溫箱中培養(yǎng)1～2 d。每片取5個(gè)視野，待花粉萌發(fā)后置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率[10]。

1.2.3花粉量的測(cè)定。采集金太陽杏各單株已達(dá)氣球期、飽滿、正常、未開裂的花蕾，分別在4 ℃環(huán)境中保存0、4、8 h，各取完整的10朵單花花藥放入1.5 mL離心管中，加入較低濃度番紅溶液1.0 mL，高速離心機(jī)中離心3 min，使花粉粒均勻分布于溶液，用移液器吸取1 μL稀釋液(每次吸取時(shí)要充分振蕩)滴于載玻片上，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)每滴溶液中花粉粒數(shù)，每朵花觀察3滴，重復(fù)3次[11]，計(jì)算每朵花藥的花粉量。

每枚花藥花粉量=每個(gè)載玻片總花粉粒數(shù)×1 000/單花花藥數(shù)[2]

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC染色測(cè)定金太陽杏花粉活力由表1數(shù)據(jù)計(jì)算得總平均數(shù)為11.50%，即TTC染色法測(cè)定金太陽杏花粉活力為11.50%。

表1 TTC染色法花粉活力測(cè)定結(jié)果

2.2 不同濃度蔗糖、硼酸對(duì)花粉萌發(fā)花粉管的影響成熟花粉具有較強(qiáng)的生活力，在適宜的培養(yǎng)條件下便能萌發(fā)和生長(zhǎng)?；ǚ鄣拿劝l(fā)和生長(zhǎng)與培養(yǎng)條件、氣候、花粉成熟度和植物種類等有關(guān)。硼酸對(duì)促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的作用機(jī)理是增加糖的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝，形成糖硼酸復(fù)合體，增加氧的吸收，并促進(jìn)花粉管膜成分果膠物質(zhì)的合成。一般來說，花粉中硼的含量是不足的，而在自然條件下，這種不足是由柱頭和花柱內(nèi)的硼所補(bǔ)償?shù)?。因此，在離體培養(yǎng)時(shí)，需要添加適量濃度的硼酸，以促進(jìn)花粉的萌發(fā)和生長(zhǎng)。蔗糖對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，主要有2個(gè)方面：一方面為花粉萌發(fā)及花粉管的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)；另一方面維持外界環(huán)境一定的滲透壓，使花粉壁破裂，內(nèi)容物吐出，濃度高時(shí)又會(huì)造成花粉的質(zhì)壁分離。因此，蔗糖的濃度一定要控制在合理范圍內(nèi)。

由表2可知，在溫度25 ℃、pH 6.5、蔗糖濃度10%、硼酸濃度25 μg/mL條件下花粉的萌發(fā)率最高，即該條件下花粉活力最好，為27.00%。上述條件下花粉的萌發(fā)情況見圖1。

表2 不同濃度的蔗糖和硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的影響

表3 金太陽杏花粉量測(cè)定

2.3 金太陽杏花花粉量的測(cè)定取10株單花花藥，記錄每枚花藥花粉量。每朵花取3滴藥液，重復(fù)3次。由表3數(shù)據(jù)計(jì)算得金太陽杏每枚花藥花粉量為1 303。

3 討論

花粉活力測(cè)定方法中，染色法較簡(jiǎn)單、快速，在一定程度上可以直接反映花粉活力，但是受花粉活性的影響，不能直接表現(xiàn)花粉的萌發(fā)率。例如，碘-碘化鉀染色法測(cè)定花粉活力時(shí)有的發(fā)育不良、畸形的花粉中也有積累的淀粉，用碘-碘化鉀溶液染色時(shí)，也出現(xiàn)藍(lán)色從而使測(cè)量結(jié)果偏大，并且該方法不適合淀粉含量低的花粉，如菊屬植物[10]。另外，該速測(cè)方法也在剛竹屬[11]、水稻[12]、苜蓿[13]、辣椒[14]等的花粉速測(cè)上得到應(yīng)用。TTC染色法雖然適用范圍很廣，一般用于葫蘆科[15]、當(dāng)歸[16]、番木瓜[17]、連翹[18]、人心果[19]、一串紅[20]、月季[21]等花粉活力的檢測(cè)，但是染色后的花粉顏色差別小，有活力的花粉邊緣被染成紅色，中間呈現(xiàn)黃褐色，而無活力的花粉整個(gè)呈現(xiàn)黃褐色，在顯微鏡下不易分辨。醋酸洋紅染色法在苧麻[2]、西葫蘆[15]、鳶尾屬[22]等花粉活力測(cè)定上效果不理想，但在澳洲堅(jiān)果[23]、胡蘿卜[24]、馬鈴薯[25]等花粉活力快速檢測(cè)上得到廣泛應(yīng)用?；ǚ垭x體萌發(fā)法中，二細(xì)胞型花粉一般在僅含蔗糖和硼酸的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可萌發(fā)，但三細(xì)胞型花粉則需加入其他元素，如十字花科、菊科、禾本科。在基本培養(yǎng)基中加入聚乙二烯(PEG)也可明顯提高花粉的萌發(fā)率[26]。

圖1 10%蔗糖、25 μg/mL硼酸條件下花粉萌發(fā)花粉管

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Detection of Pollen Quantity and Vitality of Golden Sun Apricot

DU Xue-ling, YU Ru-gang, SONG Yun-xian et al (College of Life Science, Huaibei Normal University, Huaibei, Anhui 235000)

[Objective] To compare the determination methods for pollen quantity and vitality of Golden Sun Apricot. [Method] Pollen from full normal un-blossomed buds was picked from wild peach at the balloon stage. And the pollen viability was determined by the means of staining method and in vitro germination method. Effects of different concentrations of saccharose and boric acid on the pollen tube germination were researched. And the pollen amount of the single semet was determined. [Result] The pollen viability was determined by TTC staining method was 11.50%.Under 25 ℃ temperature, medium pH 6.5, 10% saccharose concentration, and 25 μg/mL boric acid concentration, the effects of sprouting reached the highest (27.00% pollen viability). The pollen amount of Golden Sun Apricot was measured by determining the pollen amount of the single semet, and the pollen amount of the single semet was 1 303. [Conclusion] The test results provide theoretical foundation for enhancing breeding efficiency.

Golden Sun Apricot; Pollen quantity; Pollen vitality

2014年安徽省資源植物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目;2012年安徽省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目。

杜雪玲(1976- )，女，河南扶溝人，副教授，從事植物細(xì)胞工程研究。

2016-08-26

S 662.2

A

0517-6611(2016)30-0009-03