杜雪玲， 余如剛， 宋運賢， 張慧君 (淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000)

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金太陽杏花粉量及花粉活力測定研究

杜雪玲， 余如剛， 宋運賢， 張慧君 (淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000)

[目的]比較金太陽杏花粉量及花粉活力的測定方法。[方法]采摘金太陽杏各單株已達氣球期、飽滿、正常、未開裂的花蕾，收集花粉，通過染色法、離體萌發(fā)法測定花粉活力，研究不同濃度的蔗糖、硼酸對花粉萌發(fā)花粉管的影響，并測定每枚花藥花粉量。[結(jié)果]通過2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法測定花粉活力為11.50%。對于離體萌發(fā)法，當培養(yǎng)溫度為25 ℃、培養(yǎng)基pH為6.5、蔗糖濃度為10%、硼酸濃度為25 μg/mL時花粉萌發(fā)花粉管效果最好，此時花粉活力為27.00%。金太陽杏花粉量測定用單枚花藥花粉量來衡量，測得單枚花藥花粉量平均為1 303。[結(jié)論]試驗結(jié)果為提高育種效率提供了理論依據(jù)。

金太陽杏；花粉量；花粉活力

花粉不僅是植物遺傳、育種、進化、生殖的重要研究對象，也是孢粉分析、蜂群培育、藥物制造、醫(yī)療及生理實驗的重要材料。花粉活力是花粉具有生長、萌發(fā)或發(fā)育的能力[1]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及農(nóng)業(yè)常規(guī)雜交育種中，研究花粉的生活力和育性是基礎(chǔ)性工作。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和育種工作通常會遇到由于花期不一致帶來的困難，為解決這一難題，保存花粉的活力成為重要手段，而在貯藏花粉之前必須先檢測花粉的活力。不同種類植物花粉的自然壽命、適宜的貯藏方式及花粉活力適宜的測定方法不同。因此，掌握花粉活力的檢測方法對提高育種效率有重要意義。

花粉活力的測定方法通常有形態(tài)學(xué)測定法、染色法、萌發(fā)測定法、田間授粉測定法和無機酸檢測法。形態(tài)學(xué)測定法的基本原理是根據(jù)花粉自身的形狀來判斷花粉生活力[2]。該方法雖然簡單，但測定有活力的花粉與實際值相差太大，且重復(fù)之間差異比較明顯，一般不采用。田間授粉檢測法的基本原理是根據(jù)果實和種子的形成情況來判斷花粉生活力。雖然該方法較精確和可靠，可以得出花粉的活力，但是費時費力，還受到田間氣候、環(huán)境條件及母本植株性狀的影響。無機酸檢測法是靠經(jīng)過無機酸處理后，花粉會出現(xiàn)萌發(fā)孔有膨脹外突起的現(xiàn)象來判斷花粉是否有活力，但花粉吸水后也會出現(xiàn)這種現(xiàn)象，因此，采用無機酸不能判斷花粉是否真正具有活力[3-4]。染色法雖然簡單、快速且能夠在一定程度上直接反映花粉的活力，但受花粉特性的影響較大，不能直接表現(xiàn)出花粉的萌發(fā)率，所以不同植物應(yīng)采用不同的染色法來檢測花粉的活力。為此，筆者采用染色法中的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法、碘-碘化鉀染色測定法、醋酸洋紅染色測定法測定了金太陽杏花粉活力，以期為提高育種效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料以金太陽杏為供試植物。采集金太陽杏各單株已達氣球期、飽滿、正常、即將開裂的花蕾，用鑷子收集其花藥，在培養(yǎng)皿薄薄鋪一層，25 ℃培養(yǎng)2 d，花粉即可爆出，在貯藏之前檢測花粉活力[5]。

1.2 方法

1.2.1染色法測定花粉活力。

(1)碘-碘化鉀染色測定法。杏花在花粉成熟時積累淀粉較多，通常可用碘-碘化鉀染成藍色。發(fā)育不良的花粉常呈畸形，不積累淀粉，用碘-碘化鉀染色，不呈藍色，而呈黃褐色。取載玻片撒少量花粉，滴1～2滴碘-碘化鉀溶液，35 ℃水浴中溫浴20 min，然后在顯微鏡下觀察，凡被染成藍色的為發(fā)育好、活力強的花粉粒，呈黃褐色的為發(fā)育不良的花粉粒[6]。

(2)醋酸洋紅染色測定法。其染色原理是靠花粉中的脫氫輔酶而染色，有活力的花粉被染成紅色，部分失去活力的呈現(xiàn)粉紅色，無活力或不育的花粉無色[7]。取載玻片撒少量花粉，滴1～2滴醋酸洋紅溶液，染色30 min后顯微鏡下觀察，凡被染成紅色的花粉為有活力的花粉，未被染色的花粉為無活力的花粉[8]。

(3)TTC染色測定法。TTC是一種氧化還原染料，水溶液無色。基本原理：當TTC滲入細胞后，遇到活細胞中的脫氫酶接受氫離子，由無色的氧化型變成紅色的還原型不溶于水的化合物[9]，以此來判斷花粉的生活力。取少量花粉置于載玻片上，加上1滴TTC溶液，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，然后置于35 ℃恒溫箱中染色15～20 min。于10×10倍鏡下觀察，凡具有活力的花粉被染成紅色，部分喪失活力的花粉呈現(xiàn)粉紅色，無色是無活力或不育的花粉粒。制作3個裝片，每片取5個視野，統(tǒng)計其花粉的活力百分率。

1.2.2花粉萌發(fā)測定法。配制蔗糖濃度為5%、10%、15%，硼酸濃度為25、50、75 μg/mL的培養(yǎng)基，pH為6.5，用滴管吸取少量培養(yǎng)基，趁熱滴在載玻片上，放置片刻使其凝固，將少量花粉均勻撒播在培養(yǎng)基上。將制好的片子放在墊有甘油濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在25 ℃溫箱中培養(yǎng)1～2 d。每片取5個視野，待花粉萌發(fā)后置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計發(fā)芽率[10]。

1.2.3花粉量的測定。采集金太陽杏各單株已達氣球期、飽滿、正常、未開裂的花蕾，分別在4 ℃環(huán)境中保存0、4、8 h，各取完整的10朵單花花藥放入1.5 mL離心管中，加入較低濃度番紅溶液1.0 mL，高速離心機中離心3 min，使花粉粒均勻分布于溶液，用移液器吸取1 μL稀釋液(每次吸取時要充分振蕩)滴于載玻片上，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計每滴溶液中花粉粒數(shù)，每朵花觀察3滴，重復(fù)3次[11]，計算每朵花藥的花粉量。

每枚花藥花粉量=每個載玻片總花粉粒數(shù)×1 000/單花花藥數(shù)[2]

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC染色測定金太陽杏花粉活力由表1數(shù)據(jù)計算得總平均數(shù)為11.50%，即TTC染色法測定金太陽杏花粉活力為11.50%。

表1 TTC染色法花粉活力測定結(jié)果

2.2 不同濃度蔗糖、硼酸對花粉萌發(fā)花粉管的影響成熟花粉具有較強的生活力，在適宜的培養(yǎng)條件下便能萌發(fā)和生長?；ǚ鄣拿劝l(fā)和生長與培養(yǎng)條件、氣候、花粉成熟度和植物種類等有關(guān)。硼酸對促進花粉萌發(fā)和花粉管伸長的作用機理是增加糖的吸收、運轉(zhuǎn)和代謝，形成糖硼酸復(fù)合體，增加氧的吸收，并促進花粉管膜成分果膠物質(zhì)的合成。一般來說，花粉中硼的含量是不足的，而在自然條件下，這種不足是由柱頭和花柱內(nèi)的硼所補償?shù)?。因此，在離體培養(yǎng)時，需要添加適量濃度的硼酸，以促進花粉的萌發(fā)和生長。蔗糖對花粉萌發(fā)和花粉管的生長具有明顯的促進作用，主要有2個方面：一方面為花粉萌發(fā)及花粉管的生長提供營養(yǎng)；另一方面維持外界環(huán)境一定的滲透壓，使花粉壁破裂，內(nèi)容物吐出，濃度高時又會造成花粉的質(zhì)壁分離。因此，蔗糖的濃度一定要控制在合理范圍內(nèi)。

由表2可知，在溫度25 ℃、pH 6.5、蔗糖濃度10%、硼酸濃度25 μg/mL條件下花粉的萌發(fā)率最高，即該條件下花粉活力最好，為27.00%。上述條件下花粉的萌發(fā)情況見圖1。

表2 不同濃度的蔗糖和硼酸對花粉萌發(fā)的影響

表3 金太陽杏花粉量測定

2.3 金太陽杏花花粉量的測定取10株單花花藥，記錄每枚花藥花粉量。每朵花取3滴藥液，重復(fù)3次。由表3數(shù)據(jù)計算得金太陽杏每枚花藥花粉量為1 303。

3 討論

花粉活力測定方法中，染色法較簡單、快速，在一定程度上可以直接反映花粉活力，但是受花粉活性的影響，不能直接表現(xiàn)花粉的萌發(fā)率。例如，碘-碘化鉀染色法測定花粉活力時有的發(fā)育不良、畸形的花粉中也有積累的淀粉，用碘-碘化鉀溶液染色時，也出現(xiàn)藍色從而使測量結(jié)果偏大，并且該方法不適合淀粉含量低的花粉，如菊屬植物[10]。另外，該速測方法也在剛竹屬[11]、水稻[12]、苜蓿[13]、辣椒[14]等的花粉速測上得到應(yīng)用。TTC染色法雖然適用范圍很廣，一般用于葫蘆科[15]、當歸[16]、番木瓜[17]、連翹[18]、人心果[19]、一串紅[20]、月季[21]等花粉活力的檢測，但是染色后的花粉顏色差別小，有活力的花粉邊緣被染成紅色，中間呈現(xiàn)黃褐色，而無活力的花粉整個呈現(xiàn)黃褐色，在顯微鏡下不易分辨。醋酸洋紅染色法在苧麻[2]、西葫蘆[15]、鳶尾屬[22]等花粉活力測定上效果不理想，但在澳洲堅果[23]、胡蘿卜[24]、馬鈴薯[25]等花粉活力快速檢測上得到廣泛應(yīng)用?；ǚ垭x體萌發(fā)法中，二細胞型花粉一般在僅含蔗糖和硼酸的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可萌發(fā)，但三細胞型花粉則需加入其他元素，如十字花科、菊科、禾本科。在基本培養(yǎng)基中加入聚乙二烯(PEG)也可明顯提高花粉的萌發(fā)率[26]。

圖1 10%蔗糖、25 μg/mL硼酸條件下花粉萌發(fā)花粉管

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Detection of Pollen Quantity and Vitality of Golden Sun Apricot

DU Xue-ling, YU Ru-gang, SONG Yun-xian et al (College of Life Science, Huaibei Normal University, Huaibei, Anhui 235000)

[Objective] To compare the determination methods for pollen quantity and vitality of Golden Sun Apricot. [Method] Pollen from full normal un-blossomed buds was picked from wild peach at the balloon stage. And the pollen viability was determined by the means of staining method and in vitro germination method. Effects of different concentrations of saccharose and boric acid on the pollen tube germination were researched. And the pollen amount of the single semet was determined. [Result] The pollen viability was determined by TTC staining method was 11.50%.Under 25 ℃ temperature, medium pH 6.5, 10% saccharose concentration, and 25 μg/mL boric acid concentration, the effects of sprouting reached the highest (27.00% pollen viability). The pollen amount of Golden Sun Apricot was measured by determining the pollen amount of the single semet, and the pollen amount of the single semet was 1 303. [Conclusion] The test results provide theoretical foundation for enhancing breeding efficiency.

Golden Sun Apricot; Pollen quantity; Pollen vitality

2014年安徽省資源植物學(xué)重點實驗室項目;2012年安徽省高校自然科學(xué)研究項目。

杜雪玲(1976- )，女，河南扶溝人，副教授，從事植物細胞工程研究。

2016-08-26

S 662.2

A

0517-6611(2016)30-0009-03