黃秀敏， 李學(xué)優(yōu)， 葉俊豪， 夏楓耿， 曹 丁 (廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

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1株益生蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

黃秀敏， 李學(xué)優(yōu)， 葉俊豪， 夏楓耿， 曹 丁 (廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

[目的]通過(guò)優(yōu)化蠟樣芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，提高蠟樣芽孢桿菌的生物量。[方法]在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳氮源和碳氮比。[結(jié)果]優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖15.00 g/L，可溶性淀粉40.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，玉米漿干粉30.00 g/L，硫酸銨3.00 g/L,磷酸氫二鉀5.00 g/L，磷酸二氫鈉5.00 g/L，硫酸鎂1.25 g/L，硫酸錳0.60 g/L，氯化鈣2.00 g/L。優(yōu)化后蠟樣芽孢桿菌在50 L不銹鋼發(fā)酵罐中的發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)1.6×1010cfu/mL，較優(yōu)化前提高了1個(gè)數(shù)量級(jí)。[結(jié)論]優(yōu)化后的蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基大大提高了該菌的生物量，為工業(yè)化放大生產(chǎn)提供了參考。

蠟樣芽孢桿菌；發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)化

芽孢桿菌是一類(lèi)兼性厭氧或好氧，革蘭氏陽(yáng)性桿菌的總稱(chēng),產(chǎn)芽孢，生理特征豐富多樣,分布極其廣泛，是植物體表、根際以及土壤、空氣的重要微生物種群。芽孢桿菌是一類(lèi)產(chǎn)生大量不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的多肽抗菌物質(zhì)的物種[1]。

蠟樣芽孢桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，主要分布于塵埃、土壤、植物、水及空氣中，能產(chǎn)生具有抗逆性?xún)?nèi)生芽孢，對(duì)紫外線(xiàn)、離子輻射、熱和抗菌素及其他化學(xué)藥品的抗性較高[2]。蠟樣芽孢桿菌可產(chǎn)生多種有益生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥保健、農(nóng)業(yè)、食品和飼料等各領(lǐng)域有著極其廣泛的應(yīng)用，牧漁養(yǎng)殖業(yè)上用作飼料添加劑，農(nóng)業(yè)上用作生防制劑[3-4]。筆者通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)1株益生蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行了50 L不銹鋼發(fā)酵罐中試試驗(yàn)，以期為蠟樣芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種。蠟樣芽孢桿菌由廣州市微生物研究所提供。

1.1.2培養(yǎng)基。種子和檢測(cè)培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，氯化鈉5.00 g/L，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加20.00 g/L瓊脂粉?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30.00 g/L，酵母粉20.00 g/L，硫酸銨3.00 g/L，磷酸氫二鉀5.00 g/L，磷酸二氫鈉5.00 g/L，硫酸鎂1.25 g/L，硫酸錳0.60 g/L，氯化鈣2.00 g/L，pH 7.0。

1.1.3主要試劑。胰蛋白胨(英國(guó)Oxoid 公司)、瓊脂粉(廣東省廣州環(huán)凱生物科技有限公司)、酵母粉(湖北安琪酵母股份有限公司)、蛋白胨(貴州新華生化科技發(fā)展有限公司)、玉米漿干粉(山東康源生物科技有限公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4主要儀器。生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、752N 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、pHS-25 數(shù)顯酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠(chǎng))、50 L不銹鋼發(fā)酵罐(上海洋格生物工程設(shè)備有限公司)、DHZ-DA大容量全溫振蕩器(江蘇省太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng))。

1.2 方法

1.2.1蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制。將活化好的蠟樣芽孢桿菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，每間隔3 h取樣測(cè)定發(fā)酵液的pH和OD值，繪制菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.2蠟樣芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。從新鮮種子斜面挑取1環(huán)菌體，接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，制成種子液；以1%的接種量將活化好的種子液接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定OD值。

1.2.3發(fā)酵過(guò)程參數(shù)測(cè)量。

1.2.3.1菌體生物量測(cè)定。測(cè)量經(jīng)適當(dāng)稀釋后的發(fā)酵液在600 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.2.3.2pH測(cè)定。用pHS-25數(shù)顯酸度計(jì)測(cè)定。

1.2.3.3菌落計(jì)數(shù)。采用平板菌落計(jì)數(shù)法。

1.2.4最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的確定。

1.2.4.1最佳碳源的確定。分別用30.00 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，其余配方同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.4.2最佳氮源的確定。在篩選出最佳碳源的基礎(chǔ)上，分別用23.00 g/L的酵母粉、玉米漿干粉、蛋白胨、牛肉膏、豆粕粉、硫酸銨替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，其余配方同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.4.3正交試驗(yàn)。采用4因素3水平L9(34)正交表進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，研究影響蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)的主要因素：葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨和玉米漿干粉，求取最佳配比。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.5發(fā)酵中試試驗(yàn)。根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果，在50 L不銹鋼發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)驗(yàn)證，發(fā)酵罐裝液量為25 L。種子培養(yǎng)同搖瓶試驗(yàn)，接種量為4%，培養(yǎng)溫度為37 ℃，通風(fēng)量為10 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，罐壓保持在0.04～0.06 MPa，發(fā)酵過(guò)程中pH保持在7.0左右。每2 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液的OD值，同時(shí)觀(guān)察芽孢形成情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)由圖1可知，蠟樣芽孢桿菌在0～3 h處于遲緩期，3 h以后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD值快速提高，至12 hOD值達(dá)到最高,進(jìn)入穩(wěn)定期，從18 h開(kāi)始，蠟樣芽孢桿菌進(jìn)入衰亡期。在生產(chǎn)中通常使用對(duì)數(shù)期的菌體作為種子，此時(shí)菌體生長(zhǎng)速率最快、代謝旺盛、酶系活躍、活細(xì)菌數(shù)和總細(xì)菌數(shù)大致接近、細(xì)胞的化學(xué)組成形態(tài)理化性質(zhì)基本一致，所以選定蠟樣芽孢桿菌的最佳種齡是12 h。

此外，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，pH逐漸上升，說(shuō)明蠟樣芽孢桿菌在增值過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物為堿性物質(zhì)。

圖1 蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和pH變化曲線(xiàn)

2.2 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.2.1最佳碳源。由圖2可知，可溶性淀粉作為碳源時(shí)蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于其他碳源，OD值達(dá)14，所以最佳碳源為可溶性淀粉，其次是葡萄糖，最差的是玉米淀粉。但是考慮到可溶性淀粉是多糖，而葡萄糖作為速效碳源，能迅速啟動(dòng)菌體生長(zhǎng)，縮短發(fā)酵周期，故選擇葡萄糖和水溶性淀粉搭配使用作為復(fù)合碳源。

圖2 碳源對(duì)蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

2.2.2最佳氮源。由圖3可知，選用玉米漿干粉作為氮源時(shí)的OD值極顯著高于其他組別，蛋白胨和牛肉膏次之。玉米漿干粉是以鮮玉米漿為原料經(jīng)低溫瞬間加熱噴霧干燥而成，其水溶性蛋白質(zhì)保存完好，在微生物發(fā)酵過(guò)程中提供水溶性植物蛋白及水溶性維生素等營(yíng)養(yǎng)元素。使用硫酸銨時(shí)，生物量顯著低于其他組別，說(shuō)明蠟樣芽孢桿菌在有機(jī)氮源中的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源。由于硫酸銨能促進(jìn)芽孢的生成，所以保留硫酸銨作為無(wú)機(jī)氮源。同樣考慮到速效氮源有利于菌體快速啟動(dòng)，縮短遲緩期，同時(shí)蛋白胨的成本遠(yuǎn)低于牛肉膏，故選擇蛋白胨和玉米漿干粉搭配使用作為最佳氮源。

圖3 氮源對(duì)蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

2.2.3正交試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)表2極差大小得出各因素對(duì)蠟樣芽孢桿菌生物量影響的顯著性順序?yàn)橛衩诐{干粉>可溶性淀粉>蛋白胨>葡萄糖。最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A2B3C1D2，即1.5%葡萄糖、4.0%可溶性淀粉、1.0%蛋白胨、3.0%玉米漿干粉。在搖瓶中對(duì)優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得OD值為52.335，與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 50 L不銹鋼發(fā)酵罐中試試驗(yàn)結(jié)果由圖4可知，0～2 h為遲緩期，較搖瓶縮短了1 h，鏡檢菌體稀少；2～12 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體快速增值，12 hOD值達(dá)到最高,為61.505，高于搖瓶正交試驗(yàn)結(jié)果，生物量最大，此時(shí)鏡檢菌體增大、增

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

長(zhǎng)，并開(kāi)始形成芽孢，這是因?yàn)榘l(fā)酵罐攪拌和溶氧量遠(yuǎn)高于搖瓶，更有利于菌體生長(zhǎng)；12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，鏡檢菌體基本全部形成芽孢；20 h進(jìn)入衰亡期，菌體明顯變少，芽孢開(kāi)始脫落。12 h發(fā)酵液活菌計(jì)數(shù)達(dá)1.6×1010cfu/mL，芽孢率為96%。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了蠟樣芽孢桿菌最適發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖15.00 g/L，可溶性淀粉40.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，玉米漿干粉30.00 g/L，硫酸銨3.00 g/L,磷酸氫二鉀5.00 g/L，磷酸二氫鈉5.00 g/L，硫酸鎂1.25 g/L，硫酸錳0.60 g/L，氯化鈣2.00 g/L。優(yōu)化后搖瓶OD值達(dá)52.335，是優(yōu)化前的4倍，50 L不銹鋼發(fā)酵罐中試發(fā)酵的OD值為61.505，發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)1.6×1010cfu/mL，較優(yōu)化前的發(fā)酵液活菌數(shù)提高了1個(gè)數(shù)量級(jí),表明優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基顯著提高了蠟樣芽孢桿菌的生物量，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可為今后規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

圖4 蠟樣芽孢桿菌在50 L發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

[1] STEIN T.Bacillussubtilisantibiotics:Structures,synthesis and specific functions[J].Mol Microbiol,2005,56(4):845-857.

[2] 秦玉昌,潘寶海,于榮，等.芽孢桿菌對(duì)畜禽生產(chǎn)性能的影響[J].中國(guó)飼料,2004(16):8-10.

[3] 聶實(shí)踐，林伯荃，朱桂茹，等.益生多(S-586)飼用微生態(tài)制劑的防病作用實(shí)驗(yàn)[J].飼料研究,1999(5):27-28.

[4] 張惠云.微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].飼料博覽,2000，21(6):46-47.

Optimization of Fermentation Medium for A ProbioticBacilluscereus

HUANG Xiu-min,LI Xue-you, YE Jun-hao et al (Guangzhou Institute of Microbiology,Guangzhou,Guangdong 510663)

[Objective] To increase the biomass ofBacilluscereusby optimizing the its fermentation medium.[Method] On the basis of initial fermentation medium,the single factor experiment and orthogonal experiment were used to determine the optimum carbon and nitrogen ratios in fermentation medium.[Result] The optimized fermentation medium was:15.00 g/L glucose,40.00 g/L soluble starch,10.00 g/L peptone,corn steep powder 30.00 g/L,3.00 g/L ammonium sulfate,5.00 g/L dipotassium hydrogenphosphate,5.00 g/L dihydrogen phosphate sodium,1.25 g/L magnesium sulfate,0.60 g/L manganese sulfate,and 2.00 g/L calcium chloride.After optimization,fermented viable cell count ofBacilluscereusin 50 L cans reached up to 1.6 ×1010cfu/mL,which improved an order of magnitude comparing with that before optimization.[Conclusion] The optimized culture medium greatly enhances the biomass ofBacilluscereus,which provides references for the large-scale production in industrialization.

Bacilluscereus; Fermentation culture medium; Optimization

廣東省廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201605040004)；廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016B090918055)。

黃秀敏(1990- )，女，廣東梅州人，助理工程師，從事微生物研究。

2016-09-14

S 182

A

0517-6611(2016)30-0007-02