劉雨燕， 許向前， 羅文昭

(河南省中醫(yī)院肛腸科，河南 鄭州 450002)

?

槐榆煎劑對肛腸手術后大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10含量的影響

劉雨燕△， 許向前， 羅文昭

(河南省中醫(yī)院肛腸科，河南 鄭州 450002)

目的： 觀察槐榆煎劑對肛腸手術后大鼠血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-10)含量的影響，初步研究其作用機制。方法:40只Sprague-Dawley大鼠隨機分為正常對照組、模型組以及槐榆煎劑低、高劑量組，每組10只，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量；HE染色法檢測肛周組織的病理學變化；Western blotting法檢測肛周組織中細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和NF-κB的蛋白表達。結果:給予槐榆煎劑干預后，可抑制肛腸手術后大鼠血清中TNF-α、IL-6含量的升高與IL-10含量的降低，減輕大鼠肛周組織的水腫及充血程度，抑制肛腸手術后ICAM-1、VCAM-1和NF-κB蛋白表達的上調。結論:槐榆煎劑可調控血清中TNF-α、IL-6與IL-10的含量，并影響肛周組織中ICAM-1、VCAM-1和NF-κB的表達。

槐榆煎劑； 肛腸手術； 炎性細胞因子

肛腸手術后創(chuàng)口的炎癥反應是肛門直腸疾病患者術后普遍存在的并發(fā)癥，可引發(fā)一系列次級癥狀，如排便困難或尿潴留等，給患者帶來諸多不便，影響手術效果及術后的恢復。我國肛腸疾病的發(fā)病率，女性約為67%，男性約為53.9%，各個年齡段均可發(fā)病，近年來發(fā)病率有逐漸上升的趨勢。

從槐榆煎劑(Huaiyu decoctum，HYD)的組方來看，槐花和地榆清熱解毒，涼血止血；芍藥、虎杖、蒲公英和白花蛇舌草清熱除濕，活血祛瘀，消諸瘡毒；當歸、生地和茜草清熱滋陰，涼血止血。以上諸藥相合具有清熱涼血，止血消瘡毒的功效。國內報道采用槐榆煎加減方治療內痔出血，結果顯示槐榆煎對I期內痔引起的出血的止血效果非常顯著[1]。本實驗觀察槐榆煎劑對肛腸術后大鼠血清中炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-10含量的影響，以及肛周組織細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和NF-κB蛋白表達的影響，探討槐榆煎劑對肛腸術后病理變化的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康清潔級Sprague-Dawley大鼠，40只，雌雄各半，體重為(200±20)g，購自南京君科生物工程有限公司，實驗動物使用許可證號為XYDS(滬)2013-0025，飼養(yǎng)于(23±2)℃室溫，自由飲食，雌雄分籠，適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 實驗試劑 測定TNF-α、IL-6和IL-10的ELISA試劑盒購自R&D；抗ICAM-1、VCAM-1和NF-κB抗體購自Santa Cruz；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 槐榆煎劑組方 槐花、地榆、當歸、生地各12 g，茜草、芍藥各9 g，虎杖、蒲公英各6 g，白及、白花蛇舌草、仙鶴草、荊芥穗各30 g，加水400 mL，加熱至沸，小火加熱1 h，水煎劑制成濃浸膏，參照人體用量，按系數(shù)折算出大鼠用量，加蒸餾水稀釋成灌胃溶液(含生藥200 g/L)。

2 實驗方法

2.1 肛腸手術后模型的建立 用10%水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg)，待大鼠麻醉后仰臥，用酒精將鼠尾近端擦拭消毒，待肛門松弛后，以肛緣為界，切開皮膚至直腸黏膜，切口為三角形，底寬約1.0 cm，高約2.0 cm(皮膚破損高約0.5 cm，黏膜破損高約1.5 cm)，造成皮膚黏膜組織損傷。

2.2 分組與給藥情況 將大鼠隨機分為4組，每組10只：正常對照(normal control)組給予正常飲食；模型(model)組于建模后當天以5 mL生理鹽水灌胃；HYD低劑量組(HYD-low組)于建模后當天給予5 mL灌胃溶液灌胃，每天1次，共給藥21 d；HYD高劑量組(HYD-high組)于建模后當天灌胃5 mL灌胃溶液，每天2次，共給藥21 d。

2.3 標本的采集 各組大鼠給藥完成后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，摘取眼球取血約5 mL，靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，收集上清液置于-20 ℃冰箱中保存。各組大鼠處死后，切除肛緣直至直腸粘膜處的組織，沖洗干凈，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 ELISA檢測血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量 按照ELISA試劑盒說明書進行操作，將各組大鼠血清加入預包被抗NSE特異性抗體的酶標板上，37 ℃溫育30 min，傾去液體，加入酶標試劑50 μL，37 ℃溫育30 min，洗滌，加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL 顯色劑B，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，加入50 μL終止液，于450 nm波長處酶標儀讀數(shù)吸光度值(A)。

2.5 HE染色觀察肛周組織的病理變化 取各組大鼠肛周組織，用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，二甲苯I、II各5 min脫蠟，分別浸入梯度乙醇(100%，95%，80%，75%)，吸干水分，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，伊紅復染2 min，梯度乙醇脫水(95% 1 min×2次，100% 1 min×2次)，二甲苯透明，中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察。

2.6 Western blotting實驗 取各組大鼠肛周組織，加入RIPA裂解液裂解細胞，收集裂解液至離心管，離心后取上清液，用Bradford法進行蛋白定量，調整蛋白量。取適量裂解產(chǎn)物，上樣，進行SDS-PAGE。電泳結束后，轉移至PVDF膜，加入5%的脫脂奶粉的TBST溶液，室溫放置1 h，加入相應 I 抗，4 ℃孵育過夜，洗滌，加入相對應的 II 抗室溫孵育1 h，洗滌，加入ECL化學發(fā)光液孵育3 min，暗盒曝光，顯影沖洗，測定蛋白條帶的積分光密度。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0計算軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。組間差異的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 槐榆煎劑對肛腸術后大鼠血清中TNF-α與IL-6含量水平的影響

如表1所示，模型組大鼠血清中的TNF-α與IL-6含量顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；與模型組相比，HYD低劑量組和HYD高劑量組大鼠血清中的TNF-α與IL-6含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組明顯低于HYD低劑量組。

2 槐榆煎劑對肛腸術后大鼠血清中IL-10含量水平的影響

模型組大鼠血清中的IL-10含量明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；與模型組相比，HYD低劑量組和HYD高劑量組大鼠血清中的IL-10含量顯著上升，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組明顯高于HYD低劑量組，見表1。

表1 各組大鼠血清中TNF-α與IL-6含量水平

Table 1.The content of TNF-α and IL-6 in serum of rats (ng/L. Mean±SD.n=10)

* P<0.05 vs normal control group; # P<0.05 vs model group.

3 各組大鼠肛周組織學觀察

正常對照組黏膜上皮和腺體排列整齊，未見水腫充血；模型組黏膜上皮和腺體大量缺失，黏膜下層血管充血，水腫；HYD低劑量組黏膜部分上皮和腺體缺失，黏膜下層水腫，血管充血，比模型組減輕；HYD高劑量組比HYD低劑量組病變減輕，黏膜上皮較完整，部分腺體缺失，黏膜下層水腫與充血程度減輕，見圖1。

Figure 1. The pathological changes of perianal tissue in each group with HE staining (×400).

圖1 各組大鼠肛周組織的HE染色結果

4 各組大鼠肛周組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達

如圖2所示，Western blotting實驗結果顯示模型組大鼠肛周組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；給予槐榆煎劑處理后，ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組的蛋白表達降低幅度更大。

Figure 2. The protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 in the perianal tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsmodel group.

圖2 各組大鼠肛周組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達變化

5 各組大鼠肛周組織中NF-κB的蛋白表達

如圖3所示，Western blotting實驗結果顯示模型組大鼠組織中NF-κB的蛋白表達顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；HYD低劑量組和HYD高劑量組組織中NF-κB蛋白表達顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組的NF-κB的蛋白表達低于低劑量組。

Figure 3. The protein expression of NF-κB in the perianal tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsmodel group.

圖3 各組大鼠肛周組織中NF-κB的蛋白表達變化

討 論

創(chuàng)傷或手術等造成組織的損傷，促使炎癥介質釋放，激活外周傷害性感受器，信號傳導至下丘腦和大腦皮層，通過大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)對信號的整合，使人產(chǎn)生痛覺[2]。國外學者[3]研究發(fā)現(xiàn)當組織被破壞后，產(chǎn)生痛覺過敏介質如TNF-α、IL-6和IL-10等炎性細胞因子，這些炎性細胞因子參與組織損傷后炎癥的調控，并增加疼痛的敏感性[4]。IL-6和IL-10作為術后創(chuàng)傷血清中炎性和抗炎因子，可作為術后炎癥反應強烈程度的檢測指標[5]。TNF-α和IL-6屬于促炎細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在動物模型中是致痛高敏物質，將TNF-α注射至大鼠坐骨神經(jīng)軸突導致Aδ和C纖維自發(fā)放電異常，大鼠出現(xiàn)機械性痛覺過敏[6]。IL-6能夠刺激活化B細胞增殖，分泌抗體[7]。IL-10是一種活性較強的抗炎因子，能夠下調促炎因子受體的表達，并阻斷細胞因子的級聯(lián)反應，保護脊髓神經(jīng)元，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。報道指出IL-10可抑制致炎致痛的炎癥介質NO的合成與PEG2的產(chǎn)生，并通過抑制促炎細胞因子的釋放[8]，從而發(fā)揮止痛的作用。本研究發(fā)現(xiàn)槐榆煎劑能夠抑制肛腸病術引起大鼠血清中TNF-α、IL-6含量的升高與IL-10含量的降低，同時HE染色顯示槐榆煎劑能夠改善肛周組織充血與水腫程度，推測槐榆煎劑通過降低肛腸術后促炎因子TNF-α和IL-6的含量，進而抑制其致炎癥損傷的作用；提高抗炎因子IL-10的含量，從而降低肛腸病手術后疼痛，改善組織水腫充血的情況?；庇芗鍎┛赡芡ㄟ^抑制炎癥因子的含量，從而減少炎癥因子對外周的刺激減緩疼痛，此外，進一步減少炎癥因子作用于脊髓背角神經(jīng)元NMDA受體與AMPA受體，減少神經(jīng)興奮性和中樞的敏感性，從而緩解組織對刺激的疼痛反應。

黏附分子作為介導細胞與細胞間，細胞與胞外基質相互結合的細胞表面受體，主要參與細胞的識別、活化和信號轉導，在免疫應答和炎癥發(fā)生等方面具有重要作用[9]。VCAM-1通過介導單核細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞黏附至血管內皮表面，促使白細胞往炎癥部位聚集，使血管內皮細胞受損。ICAM-1介導細胞間的黏附，促使相關抗原陽性白細胞黏附于ICAM-1陽性內皮細胞表面，進一步到達炎癥組織，促進炎癥細胞的遷移和趨化[10]。NF-κB參與了許多與炎癥反應有關的基因表達調控，激活后增強各種前炎癥因子的轉錄和表達，導致細胞黏附增強、炎性細胞趨化和細胞外基質降解等[11]。ICAM-1與VCAM-1是NF-κB激活后的下游炎癥因子。本研究發(fā)現(xiàn)，槐榆煎劑在肛腸術后可通過抑制NF-κB通路從而減少黏膜ICAM-1與VCAM-1的表達，抑制白細胞向內皮細胞的遷移，從而抑制炎癥反應，通過抑制炎性細胞的遷移和趨化，減少炎性因子的刺激，從而緩解疼痛。

綜上所述，槐榆煎劑具有減緩肛腸術后的疼痛的作用，是通過調控炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的含量，抑制NF-κB通路，減少ICAM-1與VCAM-1的表達，從而抑制炎癥反應，減緩疼痛。

[1] 司紀廣. 槐榆煎加減治療內痔出血的臨床觀察[J]. 內蒙古中醫(yī)藥, 2015(6):32-33.

[2] 張莉莉， 王虎山， 姜長林， 等. 注射用帕瑞昔布鈉超前鎮(zhèn)痛對開腹手術病人血清白介素-6的影響[J]. 按摩與康復醫(yī)學, 2010, 1(3):6-7.

[3] Toussirot é. Biologics in spondyloarthritis: TNFα inhibitors and other agents[J]. Immunotherapy, 2015, 7(6):669-681.

[4] Esme H, Kesli R, Apiliogullari B, et al. Effects of flurbiprofen on CRP, TNF-α, IL-6, and postoperative pain of thoracotomy[J]. Int J Med Sci, 2011, 8(3):216-221.

[5] 石世堅， 何忠承， 朱元蒿, 等. 地佐辛超前鎮(zhèn)痛對腹腔鏡肝切除術患者血清IL-6、IL-10及術后疼痛的影響[J].中外醫(yī)療，2014(21):86-88.

[6] Wei XH, Zang Y, Wu CY, et al. Peri-sciatic administration of recombinant rat TNF-alpha induces mechanical allodynia via upregulation of TNF-alpha in dorsal root ganglia and in spinal dorsal horn: the role of NF-kappa B pathway[J]. Exp Neurol, 2007, 205(2):471-484.

[7] 沈穎潔， 劉 喆. 手術創(chuàng)傷應激與炎性細胞因子的相關研究進展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報，2011，13(11):75-77.

[8] Song XJ, Huang ZJ, Song WB, et al. Attenuation effect of spinal manipulation on neuropathic and postoperative pain through activating endogenous anti-inflammatory cytokine interleukin 10 in rat spinal cord[J]. J Manipulative Phy-siol Ther, 2016, 39(1):42-53.

[9] 楊 簡， 楊 俊. 細胞黏附分子和動脈粥樣硬化[J]. 醫(yī)學綜述, 2006, 12(21):1307-1309.

[10]Kim SY, Ryu HM, Yang JH, et al. Matemal serum levels of VCAM-1, ICAM-1 and E-selectin in preeclampsia[J]. J Korean Med Sci, 2004, 19(5):688-692.

[11]Pueyo ME, Gonzalez W, Nicoletti A, et al. Angiotensin II stimulates endothelial vascular cell adhesion molecule-1 via nuclear factor-kappaB activation induced by intracellular oxidative stress[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20(3):645-651.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of Huaiyu decoctum on serum concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in rats after anorectal operation

LIU Yu-yan, XU Xiang-qian, LUO Wen-zhao

(DepartmentofProctology,HenanProvinceHospitalofTCM,Zhengzhou450002,China.E-mail:hnszyylyy@126.com)

AIM: To investigate the effects of Huaiyu decoctum on the serum concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in rats after anorectal operation. METHODS: Sprague-Dawley rats (n=40) were randomly divided into 4 groups: normal group, model group, low-dose Huaiyu decoctum group and high-dose Huaiyu decoctum group. The concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in the rat serum were measured by ELISA. The pathologic changes of the anorectal tissues were observed under microscope with HE staining. The protein expression of ICAM-1, VCAM-1 and NF-κB was determined by Western blotting. RESULTS: After Huaiyu decoctum administration, TNF-α and IL-6 concentrations in the serum were significantly decreased, and IL-10 concentration was increased as compared with model group. Moreover, Huaiyu decoctum markedly attenuated edema and hyperemia in the rats after anorectal operation. The protein expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and NF-κB in the anorectal tissues was obviously inhibited by Huaiyu decoctum treatment. CONCLUSION: Huaiyu decoctum improves the recovery of anorectal tissues after operation by decreasing the serum concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10, and reducing the protein expression of ICAM-1, VCAM-1 and NF-κB in the anorectal tissues.

Huaiyu decoctum; Anorectal operation; Inflammatory cytokines

1000- 4718(2016)11- 2091- 04

2016- 05- 23

2016- 08- 29

R259; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.030

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 0371-60905542； E-mail： hnszyylyy@126.com