王 萍， 曾玉蘭， 熊 瑋， 彭紅星

(華中科技大學(xué)附屬梨園醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430077)

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TLR4/NF-κB在煙霧暴露大鼠肺血管重塑中的表達(dá)及意義*

王 萍， 曾玉蘭△， 熊 瑋， 彭紅星

(華中科技大學(xué)附屬梨園醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430077)

目的：觀察煙霧暴露環(huán)境下肺血管Toll 樣受體4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)亞基P65蛋白和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)，探討TLR4及NF-κB信號(hào)通路在大鼠肺血管重塑中的可能作用機(jī)制。方法:SPF級(jí)健康雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為對(duì)照組(control組)、煙霧暴露4周組(S4組)、煙霧暴露8周組(S8組)和煙霧暴露12周組(S12組)，每組各12只。制備煙霧暴露大鼠模型，HE染色法觀察肺血管形態(tài)學(xué)變化，并測(cè)量各組大鼠肺血管管壁面積/血管總面積(WA%)和血管壁厚度/血管外徑(WT%)。免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肺血管TLR4、P65和PCNA的表達(dá)，蛋白含量用平均積分吸光度來(lái)表示。RT-qPCR檢測(cè)肺血管TLR4的mRNA 表達(dá)，并分析各組肺血管WA%、WT%、TLR4蛋白和TLR4 mRNA、P65蛋白、PCNA蛋白與肺血管重塑的相關(guān)性及TLR4蛋白與WA%、WT%、P65蛋白、PCNA蛋白之間的相關(guān)性。結(jié)果:與對(duì)照組比，煙霧暴露組大鼠肺血管WA%及WT%都明顯增高，且WA%及WT%與煙霧暴露時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；煙霧暴露組肺血管TLR4蛋白、P65蛋白、PCNA蛋白和TLR4 mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組比顯著增加，且與煙霧暴露時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論:煙霧暴露上調(diào)大鼠肺血管TLR4 蛋白的表達(dá)，TLR4和NF-κB P65蛋白的表達(dá)量與肺血管重塑程度呈正相關(guān)性。肺血管重塑可能與TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)。

Toll樣受體4； 核因子-κB； 增殖細(xì)胞核抗原； 肺血管重塑

肺血管重塑是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、肺動(dòng)脈高壓、肺纖維化等呼吸疾病的特征性病理改變，也是疾病發(fā)生發(fā)展中不可缺少的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]，而肺血管平滑肌細(xì)胞異常增殖在血管重塑過程中起主導(dǎo)性作用[2]。煙霧暴露可通過炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激，血管活性介質(zhì)的調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)免疫應(yīng)答通路的激活等途徑引起肺血管平滑肌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致管壁增厚，管腔狹窄，血管管腔纖維化或完全閉塞[3]。研究表明Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)在肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)，TLR4及其信號(hào)通路核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)可能有促進(jìn)肺血管重塑的發(fā)生[4]。而目前對(duì)TLR4的研究多集中在炎癥損傷，氣道高反應(yīng)及氣道高分泌等方面[5-6]，對(duì)血管重塑研究較少有報(bào)道。為探討TLR4跟肺血管重塑的相關(guān)性，以及可能的發(fā)生機(jī)制，我們制備煙霧暴露大鼠肺血管重塑的模型，觀察不同煙霧暴露下大鼠肺部病理形態(tài)學(xué)和肺血管變化，檢測(cè)肺血管TLR4、NF-κB亞基P65和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達(dá)，從而來(lái)初步判斷肺血管TLR4、NF-κB P65和PCNA的表達(dá)與肺血管重塑的關(guān)系，為肺血管重塑的機(jī)制及靶向治療提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠48只，體重200～220 g(華中科技大學(xué)附屬梨園醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng))；兔抗TLR4多克隆抗體、兔抗P65多克隆抗體、小鼠抗PCNA單克隆抗體均購(gòu)自武漢谷歌生物公司；DAB顯色試劑盒(DAKO)；TRIzol試劑盒(Ambion)；Mix試劑盒、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒均購(gòu)自Invitrogen。TLR4、β-actin引物由武漢谷歌生物公司合成；光學(xué)顯微鏡(Olympus)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(TOYOBO)；N2分光光度計(jì)(上海精科)；HMIAS-2000彩色圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像公司)。

2 方法

2.1 煙霧暴露模型制備及分組 參照許三林等[7]的方法制備大鼠被動(dòng)吸煙裝置。煙熏箱大小為115 cm×65 cm×50 cm，每側(cè)各留9個(gè)直徑2.5 cm的通氣孔。被動(dòng)吸煙實(shí)驗(yàn)中，10支香煙捆扎為一組后點(diǎn)燃并置于煙熏箱中的支架上。利用CY-100B數(shù)字測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)煙熏箱中的氧濃度，并根其據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果調(diào)節(jié)煙熏箱通氣孔數(shù)，使煙熏箱中的氧濃度基本維持在20%～21%之間。每天吸煙2次，間隔4 h。

健康雄性大鼠48 只隨機(jī)分為:對(duì)照組(control組)，對(duì)照組大鼠置于小鋼絲籠內(nèi)，除常規(guī)喂養(yǎng)外不做其他處理；煙霧暴露組分為4周組(S4組)、8周組(S8組)、12周組(S12組)，每組各12只。暴露組大鼠鋼絲籠于煙霧暴露時(shí)間內(nèi)分別置于煙熏箱內(nèi)，每天吸煙2次，每次吸煙10支，每次30 min，中間間隔4 h。香煙采用武漢市售紅金龍牌香煙，每支焦油含量為15 mg。

2.2 病理標(biāo)本制作 各組大鼠造模完成后，用1%戊巴比妥鈉(90 mg/kg)麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后處死，開胸，結(jié)扎右主支氣管，迅速取右肺，分離右肺動(dòng)脈，凍存于-80 ℃冰箱，以備 RT-qPCR檢測(cè)用，左肺用 4%多聚甲醛經(jīng)氣管充分灌注直至胸膜平整，結(jié)扎左主支氣管后剪下，放入4%的中性甲醛固定液，取材、脫水、石蠟包埋、切片，用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

2.3 肺血管HE染色及病理學(xué)觀察 取厚度約為4 μm病理切片，用HE染色法進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺泡及肺血管的病理學(xué)變化，每張切片隨機(jī)選取斷面積較圓直徑為100～200 μm的肺動(dòng)脈5支，用HMIAS-2000型醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)對(duì)血管形態(tài)進(jìn)行測(cè)量分析，測(cè)量血管的內(nèi)徑，外徑，計(jì)算出血管壁厚度，血管壁面積及血管總面積，并記錄管壁面積/血管總面積(vascular wall area/total vascular area， WA%)和血管壁厚度/血管外徑(vascular wall thickness/vascular external diameter， WT%)。

2.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肺動(dòng)脈TLR4、NF-κB P65和PCNA蛋白的表達(dá) 采用PV6000二步法免疫組化染色法，取厚度約4 μm病理切片，常規(guī)脫蠟后，滴加3%過氧化氫室溫孵育5～10 min，后嚴(yán)格按照試劑盒說明書分別滴加TLR4、P65和PCNA多克隆抗體進(jìn)行染色顯色。數(shù)碼相機(jī)于400倍視野下隨機(jī)采集每張切片中5條直徑為100～200 μm的動(dòng)脈圖像，用HMIAS-2000病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性染色動(dòng)脈的吸光度(A)，用平均積分吸光度(IA)來(lái)表示平均蛋白含量。

2.5 RT-qPCR檢測(cè)肺動(dòng)脈TLR4的mRNA 表達(dá) 先嚴(yán)格按TRIzol試劑盒說明書步驟提取各組肺動(dòng)脈總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)，吸光度在1.8～2.0之間的用于實(shí)驗(yàn)，按PCR反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s， 40個(gè)循環(huán)。最后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算并讀出各組Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算目的mRNA的含量。PCR引物序列見表1。

表1 引物序列及其產(chǎn)物大小

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HE染色結(jié)果

對(duì)照組肺部結(jié)構(gòu)大致正常，肺泡較完整，肺動(dòng)脈管腔較大，血管平滑肌較均勻，管壁較光滑，管壁及周圍較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。煙霧暴露組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)都有不同程度破壞，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺血管都有不同程度增生，管壁增厚或管腔變形，管壁及周圍可見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以煙霧暴露12周組改變最為明顯，見圖1。

Figure 1.Pulmonary vascular manifestations of rats in each group with HE staining (×400).

圖1 各組大鼠肺動(dòng)脈HE染色圖

煙霧暴露組肺血管重塑定量分析觀察指標(biāo)(WA%和WT%)都明顯高于對(duì)照組，且跟煙霧暴露時(shí)間呈正比關(guān)系，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺血管形態(tài)學(xué)定量分析及TLR4蛋白、P65蛋白、PCNA蛋白和TLR4 mRNA的表達(dá)結(jié)果

Table 2.The quantitative analysis of the morphological changes, the protein expression of TLR4, P6 and PCNA, and the mRNA expression of TLR4 in the pulmonary vessels (Mean±SD.n=12)

Group WA%WT%TLR4P65PCNATLR4mRNAControl34.16±1.0822.18±1.220.28±0.090.16±0.030.25±0.041.00±0.12S447.75±0.91*40.45±1.09*0.34±0.07*0.27±0.02*0.32±0.05*1.31±0.23*S861.73±1.05*#51.56±1.38*#0.48±0.05*#0.32±0.05*#0.41±0.05*#1.57±0.21*#S1269.84±0.79*#△63.58±1.67*#△0.53±0.06*#△0.45±0.03*#△0.51±0.02*#△3.81±0.68*#△

WA%： vascular wall area/total vascular area； WT%： vascular wall thickness/vascular external diameter； TLR4: Toll-like receptor 4； P65： NF-κB subunit P65 protein； PCNA： proliferating cell nuclear antigen.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsS4 group;△P<0.05vsS8 group.

2 免疫組化方法檢測(cè)各組肺動(dòng)脈TLR4、P65和PCNA的表達(dá)

TLR4位于胞質(zhì)及胞膜，NF-κB P65位于胞核，PCNA也位于胞核，均以呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。染色結(jié)果提示對(duì)照組肺動(dòng)脈陽(yáng)性染色較少，而隨著煙霧暴露時(shí)間增加，煙霧暴露組肺動(dòng)脈染色加深，且以S12組最為顯著，見圖2。

煙霧暴露組肺血管的TLR4、P65和PCNA蛋白的IA值較對(duì)照組比均顯著增高，且S4、S8和S12組間，TLR4、P65、PCNA的蛋白水平隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)而增加，與煙霧暴露量呈正相關(guān)性，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見表2。

Figure 2.The protein expression of TLR4, P65 and PCNA in the pulmonary vascular tissues in each group (immunohistochemical staining, ×400).

圖2 免疫組化染色觀察各組大鼠肺血管TLR4、P65和PCNA蛋白的表達(dá)

3 各組大鼠肺動(dòng)脈TLR4的mRNA表達(dá)

從表2可見，煙霧暴露組肺血管TLR4的mRNA表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，其表達(dá)量與煙霧暴露時(shí)間呈正相關(guān)性，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。

討 論

肺血管重塑的機(jī)制目前仍不太明確，其病理生理實(shí)質(zhì)也是血管的慢性炎癥反應(yīng)[8]。吸煙、細(xì)菌感染等是引起肺部慢性炎癥和血管重塑的重要因素，其發(fā)生機(jī)制目前也還不是太明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立吸煙大鼠肺血管重塑模型，經(jīng)HE染色觀察到煙霧暴露后各組大鼠肺血管都發(fā)生了不同程度的炎癥浸潤(rùn)及管壁變形，增厚，管腔狹窄等，以吸煙12周組血管的改變最為明顯，且進(jìn)一步通過計(jì)算證實(shí)血管重塑的客觀指標(biāo)(WA%和WT%)與煙霧暴露時(shí)間呈正相關(guān)性，這與秦艷艷等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，提示煙霧暴露致使肺血管重塑大鼠模型制備成功，且肺血管重塑的程度隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重。

TLR4在肺內(nèi)肺外廣泛分布，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥因子合成和分泌、調(diào)控機(jī)體免疫、識(shí)別和清除病毒等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TLR4還可能在血管重塑中起核心作用，NF-κB作為TLR4下游最為重要的轉(zhuǎn)錄子，在TLR4與受體結(jié)合后，TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活，啟動(dòng)血管炎癥反應(yīng)[10]。唐曉敏等[11]發(fā)現(xiàn)TLR4通過激活NF-κB信號(hào)通路參與血管緊張素-II所致的高血壓大鼠的血管重塑；田剛等[12]發(fā)現(xiàn)COPD患者肺血管中TLR4及NF-κB水平明顯高于非COPD組，且發(fā)現(xiàn)其水平與肺血管壁周圍炎癥浸潤(rùn)程度，肺血管平滑肌細(xì)胞增生程度都呈正相關(guān)性；Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)TLR4通過激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)IL-1、IL-6、VEGF、BFGF等細(xì)胞因子的分泌與合成，促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，導(dǎo)致肺動(dòng)脈血管外膜，中膜及內(nèi)膜增厚，管腔變形，加劇肺動(dòng)脈高壓。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化和RT-qPCR結(jié)果提示，煙霧暴露組大鼠肺血管TLR4蛋白水平及TLR4的mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，且隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，S4、S8和S12各組間TLR4蛋白及mRNA表達(dá)都逐漸升高；而HE染色提示隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，S4、S8和S12各組間肺血管重塑程度逐漸加重；肺血管重塑的客觀指標(biāo)(WA%和WT%)與TLR4蛋白表達(dá)量趨勢(shì)一致。以上結(jié)果表明煙霧暴露可引起肺血管重塑，肺血管重塑程度與TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)量變化有關(guān)。由此我們推測(cè)TLR4可能參與肺血管重塑。

免疫組化觀察還發(fā)現(xiàn)，煙霧暴露組大鼠肺血管P65蛋白水平明顯高于對(duì)照組，其表達(dá)量隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增加；S4、S8、S12各組間，P65蛋白與TLR4蛋白的變化趨勢(shì)一致。以上結(jié)果表明NF-κB信號(hào)通路在肺血管重塑中存在，肺血管重塑可能與TLR4水平上調(diào)后NF-κB信號(hào)通路活化加強(qiáng)有關(guān)。平滑肌細(xì)胞增殖是肺血管重塑的重要病理特征之一，檢驗(yàn)平滑肌細(xì)胞增殖是探索血管重構(gòu)的一個(gè)敏感實(shí)用指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)PCNA蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)煙霧暴露組大鼠肺血管的PCNA蛋白水平顯著高于對(duì)照組，且隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，S4、S8、S12各組間PCNA蛋白表達(dá)量也逐漸增加，其變化趨勢(shì)與肺血管重塑的程度呈一致性，與TLR4蛋白、P65蛋白的變化趨勢(shì)也呈一致性，相關(guān)性分析提示PCNA蛋白與TLR4蛋白亦呈正相關(guān)性。以上結(jié)果說明PCNA表達(dá)跟TLR4變化有關(guān)。韋江紅等[14]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)PCNA的表達(dá)受TLR4/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控，TLR4/NF-κB信號(hào)通路活化，PCNA蛋白表達(dá)增加，氣道平滑肌細(xì)胞增殖加速，凋亡抑制，支氣管哮喘大鼠的氣道重塑加重，TLR4/NF-κB不僅能誘導(dǎo)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，而且還能調(diào)控肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞合成和分泌。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由此我們也推測(cè)肺血管PCNA的表達(dá)可能受TLR4/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控，TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活后，血管炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子合成和分泌增加，通過細(xì)胞因子的相互作用及級(jí)聯(lián)生物學(xué)放大效應(yīng)，導(dǎo)致肺血管平滑肌細(xì)胞增殖加速，肺血管重塑加重。

綜上所述，煙霧暴露大鼠肺血管TLR4蛋白表達(dá)增加，TLR4蛋白及NF-κB蛋白跟肺血管重塑程度呈正相關(guān)性，肺血管重塑可能與TLR4/ NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)。目前COPD及肺纖維化，肺動(dòng)脈高壓等血管炎癥性肺部疾病發(fā)病率及死亡率還在逐年升高，研究血管重塑的可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)可能的作用靶點(diǎn)，如下調(diào)TLR4表達(dá)或?qū)ふ襎LR4的拮抗劑對(duì)控制疾病的進(jìn)程及提供有效的靶向治療有重要意義。

[1] Judge EP, Gaine SP. Management of pulmonary arterial hypertension[J]. Curr Opin Crit Care, 2013, 19(1):44-50.

[2] 吳媛媛，王貴佐，李滿祥，等. 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的分子信號(hào)機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 33(12):1852-1855.

[3] Peinado VI, Pizarro S, Barebera JA. Pulmonary vascular involvement in COPD[J]. Chest, 2008, 134(4):808-814.

[4] Budulac SE, Boezen HM, Hiemstra PS, et al. Toll-like receptor polymorphisms and chronic obstructive pulmonary disease[J]. PLoS One, 2012, 7(8):e43124.

[5] 蘇苗賞， 徐漫歡， 李昌崇， 等. TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在年幼期哮喘大鼠氣道炎癥中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2008, 24(1):15-19.

[6] Chen L, Wang T, Zhang JY, et al. Toll-like receptor 4 relates to lipopolysaccharide-induced mucus hyper secretion in rat airway[J]. Arch Med Res, 2009, 40(1):10-17.

[7] 許三林， 吳人亮， 陳春蓮， 等. 上皮鈣粘附素在吸煙小鼠肺上皮損傷修復(fù)中表達(dá)的研究[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 1999, 22(7):417-419.

[8] 王曉芳， 陸蔚萱. 肺血管重塑中的炎癥機(jī)制[J]. 國(guó)際呼吸雜志，2012, 32(23):1816-1819.

[9] 秦艷艷， 杜永成， 胡曉蕓， 等. 煙霧暴露大鼠肺血管重塑及其與過氧化物酶增殖體表達(dá)的關(guān)系[J]. 國(guó)際呼吸雜志, 2012, 32(7):513-516.

[10]Spirig R, Tsui J, Shaw S. The emerging role of TLR and innate immunity in cardiovascular disease[J]. Cardiol Res Prac, 2012,2012:181394.

[11]唐曉敏， 呂紅娟， 王 霞， 等. Toll樣受體4在血管緊張素II所致高血壓小鼠血管重構(gòu)中作用[J]. 中華老年心腦血管病雜志, 2013, 15(1):67-70.

[12]田 剛， 陳恩竹， 于文成. 鱗癌COPD病人血管重建與TLR4和NF-κB表達(dá)檢測(cè)[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 27(4):332-334.

[13]Yang SK, Wang YC, Chao CC, et al. Dynamic cross-talk analysis among TNF-R, TLR-4 and IL-1R signalings in TNFα-induced inflammatory responses [J]. BMC Med Genomics, 2010, 3:19.

[14]韋江紅， 莫碧文， 黃劍偉. Toll樣受體4/核因子-κB對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥和重構(gòu)的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011, 27(5):962-967.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Expression and significance of TLR4/NF-κB in pulmonary vascular remodeling in smoking rats

WANG Ping, ZENG Yu-lan, XIONG Wei, PENG Hong-xing

(DepartmentofRespiratoryMedicine,LiyuanHospital,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430077,China.E-mail:zyldhdt@126.com)

AIM: To observe the expression of Toll-like receptor 4 (TLR4), nuclear factor-κB subunit P65 protein (NF-κB P65) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the pulmonary vascular tissues of the rats exposed to smoke, and to explore the possible mechanism of TLR4/NF-κB signaling pathway in pulmonary vascular remodeling. METHODS: SPF male healthy rats (n=48) were randomly divided into control group, smoke exposure for 4 weeks group (S4 group), smoke exposure for 8 weeks group (S8 group) and smoke exposure for 12 weeks group (S12 group), with 12 rats in each group. HE staining was used to observe the morphological changes of pulmonary vessels, and then the pulmonary vascular wall area/total vascular area (WA%) and vascular wall thickness/vascular external diameter (WT%) were measured by the medical image analysis system. The expression of TLR4, NF-κB P65 and PCNA in the pulmonary vascular tissues was detected by immunohistochemical staining. The protein content was expressed by the average integral absorbance. The mRNA expression of TLR4 in the pulmonary vessels was detected by RT-qPCR. The relationships between WA%, WT%,TLR4 protein, TLR4 mRNA, P65 protein, PCNA protein and pulmonary vascular remodeling, and another relationships between WA%, WT%, P65 protein, PCNA protein and TLR4 protein were analyzed.RESULTS: The WA% and WT% in smoke exposure groups significantly increased compared with control group, and the ratio was proportional to the time of smoke exposure. The protein expression of TLR4, p65 and PCNA, and the mRNA expression of TLR4 in smoke exposure groups also increased significantly compared with control group. CONCLUSION: The extent of pulmonary vascular remodeling in the rats increases when the protein expression of TLR4 is up-regulated. There is a positive correlation between pulmonary vascular remodeling and the protein expression of TLR4 and NF-κB P65. Pulmonary vascular remodeling may be related to the activation of TLR4/NF-κB signaling pathway.

Toll-like receptor 4; Nuclear factor-κB; Proliferating cell nuclear antigen; Pulmonary vascular remodeling

1000- 4718(2016)11- 2083- 05

2016- 06- 03

2016- 09- 13

華中科技大學(xué)自主創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(No.2015QN027)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.028

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