杜月光， 顧晶晶， 柴可夫

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 1病理教研室, 2中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所， 浙江 杭州 310053)

?

糖腎方對糖尿病腎病大鼠血液流變學(xué)及內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響*

杜月光1， 顧晶晶1， 柴可夫2△

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)1病理教研室,2中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所， 浙江 杭州 310053)

目的： 觀察糖腎方對糖尿病腎病(DN)大鼠血液流變學(xué)及內(nèi)皮功能的影響。方法:采用高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立2型糖尿病合并DN大鼠模型，將建模成功大鼠隨機(jī)分為DN模型組、糖腎方組和纈沙坦組，同時設(shè)正常對照組。藥物干預(yù)12周后，全自動生化分析儀檢測大鼠空腹血糖(FBG)、血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平；微循環(huán)血流儀檢測腎微循環(huán)變化；血液流變儀檢測血液流變學(xué)指標(biāo)；ELISA技術(shù)檢測尿白蛋白以及血清假血友病因子(vWF)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)含量。結(jié)果:與正常對照組比較，DN模型組大鼠FBG、血清TC、TG和尿白蛋白明顯升高(P<0.05)，血清vWF濃度升高(P<0.01)；與DN模型組比較，糖腎方組和纈沙坦組的FBG差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，血清TC、TG和尿白蛋白明顯降低(P<0.05)，vWF降低(P<0.01)。與正常對照組比較，DN模型組的血漿黏度,卡松黏度,全血高切、中切黏度，紅細(xì)胞聚集指數(shù),剛性指數(shù)及電泳時間均顯著升高，紅細(xì)胞變形指數(shù)降低(P<0.01)。與DN模型組比較，治療組的血漿黏度,卡松黏度,全血高切、中切和低切黏度，紅細(xì)胞聚集指數(shù),剛性指數(shù)及電泳時間均明顯降低(P<0.01)，紅細(xì)胞變形指數(shù)升高，但無顯著性差異。與正常對照組比較，DN模型組的腎皮質(zhì)微循環(huán)血流量減少(P<0.01)。與DN模型組比較，糖腎方組的腎皮質(zhì)微循環(huán)明顯增加(P<0.05)，纈沙坦組無明顯改變。結(jié)論:糖腎方能降低實驗性DN大鼠的血脂水平，改善血液流變性和內(nèi)皮功能，從而改善微循環(huán)，對糖尿病腎臟具有一定的保護(hù)作用。

糖尿病腎??； 糖腎方； 微循環(huán)； 內(nèi)皮功能； 血液流變學(xué)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，主要是由糖尿病糖脂代謝紊亂引起的以腎小球血管損傷為主的病變，最終引起腎小球和腎功能衰竭，是終末性腎病的主要原因。目前，DN確切的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，近年來，許多文獻(xiàn)報道，糖尿病腎病患者存在著血液流變學(xué)顯著異常及內(nèi)皮細(xì)胞損傷[1-2]。血液流變學(xué)異常及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷已成為糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制[3]。因此，及時有效地改善血液流變學(xué)和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，對防治糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生具有重要的意義。糖腎方(Tangshen formula,TS)是柴可夫等[4]根據(jù)DN氣陰兩虛兼有血瘀的病機(jī)而擬定的益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)的經(jīng)驗方，具有益氣養(yǎng)陰、活血化淤功效，臨床治療消渴日久、氣陰不足、淤血痰濁之糖尿病腎病，效果明顯；前期多次實驗表明糖腎方對糖尿病腎臟有保護(hù)作用，其機(jī)制包括降低血脂、抗自由基抑制炎癥等多個方面，提示其作用的多靶點(diǎn)、多方位[5-6]。為了進(jìn)一步證實該方的療效，闡明其作用機(jī)制，本研究從血液流變學(xué)、內(nèi)皮細(xì)胞功能及腎臟微循環(huán)的角度探討糖腎方對早期DN大鼠的保護(hù)作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量為(180±20)g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號為SCXK(滬)：2008-0016。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心，SYXK許可證號為(浙)2013-0184，室溫18～22 ℃，相對濕度40%～70%，通風(fēng)良好，大鼠自由攝食、飲水，12 h交替照明。

1.2 藥物 糖腎方由黃芪、葛根、靈芝、女貞子、大黃、丹參6味中藥組成，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部，由浙江省中醫(yī)院藥劑室煎制為含生藥2 g/mL的濃縮液，4℃冰箱保存。纈沙坦(valsatan)膠囊，由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，每粒80 mg。

1.3 試劑和主要儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma。血清假血友病因子(von Willebrand’s factor，vWF)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)ELISA 試劑盒購自上海森雄生物有限公司。7020型全自動生化分析儀為HITACHI產(chǎn)品；激光多普勒微循環(huán)血流儀為Moor產(chǎn)品；全自動血液流變儀(型號FASCO-3020B)為重慶大學(xué)維多生物公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 動物模型的復(fù)制 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，在文獻(xiàn)[7]的基礎(chǔ)上略作修改，進(jìn)行動物模型復(fù)制：采用高脂高糖飼料(10%蛋黃粉、10%豬油、10%蔗糖和0.5%膽固醇，其余為基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)聯(lián)合STZ 30 mg/kg尾靜脈注射造模，STZ注射后72 h后，尾尖采血檢測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，以FBG≥11.2 mmol/L為2型糖尿病模型。繼續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)，每隔2周尾靜脈采血檢測隨機(jī)血糖，留取24 h尿液，記錄尿量并檢測尿白蛋白(urine albumin, U-alb)，當(dāng)血糖持續(xù)≥16.7 mmol/L及24 h尿白蛋白排泄率與正常大鼠有顯著差異確定為DN模型。

2.2 動物分組與給藥 將DN成模大鼠隨機(jī)分為DN模型組、糖腎方組和纈沙坦組，同時設(shè)正常對照組(normal組)。糖腎方組大鼠予以糖腎方13 g·kg-1·d-1(為成人日用量的10倍)；纈沙坦組大鼠給予纈沙坦25 mg·kg-1·d-1(纈沙坦為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，對糖尿病腎臟有保護(hù)作用，因此作為西藥對照)；正常對照組和DN模型組大鼠每日給予蒸餾水4 mL。各組大鼠每天灌胃1次，連續(xù)12周。

2.3 檢測指標(biāo)與方法 實驗結(jié)束前 1 天，使用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，用于測定尿微量白蛋白指標(biāo)。大鼠禁食不禁水10 h，稱取體重。用3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，從腹中線打開腹腔，暴露兩側(cè)腎臟，用激光多普勒血流儀測定大鼠腎皮質(zhì)微循環(huán)血流量；心臟取血4.5 mL，一部分置于含肝素的抗凝管中，混勻，用于測定血液流變學(xué)指標(biāo)：血漿黏度、卡松黏度、全血黏度、紅細(xì)胞變形指數(shù)、聚集指數(shù)、剛性指數(shù)和電泳時間；一部分用于分離血清，檢測FBG、總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)及vWF和PAI-1的濃度。FBG、TC和TG采用全自動生化分析儀檢測；U-alb、vWF和PAI-1的濃度采用ELISA 技術(shù)，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析，對各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。

結(jié) 果

1 各組血糖、血脂及腎功能的比較

表1結(jié)果顯示，與正常對照組比較，DN模型組的FBG、血清TC和TG明顯升高(P<0.01)，U-alb增加(P<0.05)。與DN模型組比較，糖腎方組的TC和TG顯著下降，U-alb降低(P<0.05)，F(xiàn)BG有一定程度的降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；纈沙坦組的TC、TG和U-alb排泄率顯著下降(P<0.05)，F(xiàn)BG下降不明顯。糖腎方組和纈沙坦組兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)的變化

2 各組大鼠血液黏滯性的比較

表2結(jié)果顯示，與正常對照組比較，DN模型組血漿黏度、卡松黏度及全血高、中切黏度均顯著升高(P<0.01)，低切黏度有一定程度的升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與DN模型組比較，糖腎方組和纈沙坦組血液黏滯性各指標(biāo)明顯降低(P<0.01)；糖腎方組和纈沙坦組兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

3 各組大鼠紅細(xì)胞流變性的比較

與正常對照組比較，DN模型組紅細(xì)胞剛性指數(shù)及電泳時間均顯著增高，變形指數(shù)降低(P<0.01)，紅細(xì)胞聚集指數(shù)有一定程度的增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與DN模型組比較，糖腎方組和纈沙坦組紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)和電泳時間顯著降低(P<0.01)，變形指數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；糖腎方組和纈沙坦組兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表2。

表2 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的變化

4 各組大鼠vWF和PAI-1的比較

與正常對照組相比，模型組大鼠vWF明顯增高(P<0.01)，PAI-1有一定程度的增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與DN模型組相比，糖腎方組和纈沙坦組vWF均明顯降低(P<0.01)，PAI均有一定程度的降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。糖腎方組和纈沙坦組兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見表3。

5 各組大鼠腎臟皮質(zhì)微循環(huán)血流量的比較

表3結(jié)果顯示，與正常對照組比較，DN模型組腎臟皮質(zhì)微循環(huán)血流量顯著降低(P<0.01)；與DN模型組比較，糖腎方組明顯增加腎臟皮質(zhì)血流(P<0.05)，纈沙坦組腎臟皮質(zhì)微循環(huán)血流增加不明顯。

表3 各組大鼠血清vWF、PAI-1的濃度和腎皮質(zhì)血流的變化

Table 3.The changes of the content of vWF and PAI-1 and renal cortex blood flow in the rats with different treatments(Mean±SD.n=6)

**P<0.01 vs normal group; △P<0.05, △△P<0.01 vs DN group.

討 論

糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥，也是終末期腎病的主要原因。DN的發(fā)生是多因素共同參與、相互作用的結(jié)果。血液流變學(xué)異常及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷已成為糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制[3]。本實驗結(jié)果顯示，造模12周后，DN大鼠尿白蛋白增加，F(xiàn)BG、TC和TG水平增高，血黏粘度、卡松黏度和全血黏度升高，紅細(xì)胞聚集性和剛性增強(qiáng)，變形能力降低，紅細(xì)胞電泳時間延長，提示DN大鼠有腎功能障礙以及高血脂和血液黏滯度的異常，與臨床特點(diǎn)一致。vWF被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙的標(biāo)志物，并且是糖尿病微血管病變的獨(dú)立危險因子，其水平隨著 DN 的嚴(yán)重程度而增加[8-9]。此外內(nèi)皮功能異常還表現(xiàn)為PAI-1 活性增高導(dǎo)致纖溶活性降低，PAI-1的升高可促進(jìn)糖尿病腎纖維化的進(jìn)展[10-11]。本實驗結(jié)果顯示DN大鼠血清中vWF和PAI-1含量增加，但PAI-1含量無差異顯著性；大鼠腎臟皮質(zhì)微循環(huán)血流量顯著降低，提示DN大鼠存在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及腎微循環(huán)的異常。

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，糖尿病腎病是消渴日久，治不得法，傷陰耗氣，再加以瘀、痰、濕等相互積聚于腎之絡(luò)脈，逐步使腎體受損，腎用失司所致[12]，故予補(bǔ)益腎陰、活血通絡(luò)方劑治療該病，可達(dá)標(biāo)本兼顧之功效。糖腎方由黃芪、葛根、靈芝、女貞子、大黃、丹參6味中藥組成。葛根解熱生津為君藥，黃芪善益氣扶正，二藥合用具益氣生津之功，靈芝能益肝心脾肺腎之氣，女貞子滋腎水，補(bǔ)肝陰，清虛熱，酒制大黃活血化瘀之力強(qiáng)，與丹參合用推動血行，清除體內(nèi)痰濁瘀血，故諸藥配伍能直中病機(jī)，調(diào)暢全身氣血運(yùn)行，使脈絡(luò)得養(yǎng)。

前期研究結(jié)果顯示糖腎方對糖尿病腎臟有保護(hù)作用，其機(jī)制包括降低血脂，抗自由基，以及通過抑制炎癥等多個方面[5-6]。為進(jìn)一步闡明其機(jī)制，本項目觀察糖腎方對血液流變學(xué)的影響及內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。本實驗研究結(jié)果顯示，與模型組比較，糖腎方治療組U-alb 排泄降低，提示糖腎方具有保護(hù)腎臟的作用，這與以往的研究一致[5]。同時本研究結(jié)果還顯示，糖腎方干預(yù)可使血脂、血漿黏度、卡松黏度、全血黏度等指標(biāo)降低，還可降低紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)和電泳時間，可降低vWF和PAI-1含量，有效提高DN大鼠腎臟皮質(zhì)血流量，提示糖腎方對于改善DN血液流變學(xué)指標(biāo)以及內(nèi)皮細(xì)胞功能有較好的效果?，F(xiàn)代中醫(yī)研究認(rèn)為[13]血流變、血脂等指標(biāo)的變化可反映糖尿病腎病模型中瘀血阻絡(luò)證候的存在，并且糖尿病腎病瘀毒阻滯腎絡(luò)與炎癥發(fā)病學(xué)說之間具有一定的相關(guān)性[14]。由此我們推測，糖腎方對糖尿病腎臟的保護(hù)作用可能通過改善血液流變學(xué)和內(nèi)皮細(xì)胞的功能，從而改善腎微循環(huán)實現(xiàn)的，與中醫(yī)的治則“益氣養(yǎng)陰，活血通絡(luò)”相一致。

[1] Wu S, Li X, Zhang H. Effects of metformin on endothelial function in type 2 diabetes[J]. Exp Ther Med, 2014,7(5):1349-1353.

[2] Krasnicki P, Dmuchowska DA, Proniewska-Skretek E, et al. Ocular haemodynamics in patients with type 2 diabetes and coronary artery disease[J]. Br J Ophthalmol,2014,98(5):675-678.

[3] Tasyurek HM, Altunbas HA, Balci MK, et al. Incretins: their physiology and application in the treatment of diabetes mellitus[J].Diabetes Metab Res Rev, 2014,30(5):354-371.

[4] 柴可夫， 牛永寧， 孔麗婭.益氣養(yǎng)陰活血方對糖尿病早期微血管病變患者干預(yù)的臨床研究[J].浙江中醫(yī)雜志,2014,49(2):98-99.

[5] 杜月光， 錢俊文， 宋光明， 等.糖腎顆粒對2型糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及對炎癥的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013,31(10):2217-2220.

[6] 柴可夫， 楊明華， 楊蘇蓓， 等.糖腎顆粒對糖尿病腎病大鼠腎損害保護(hù)作用的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2008,26(9):1860-1863.

[7] 李 霜, 王圓圓, 劉麗榮， 等.黏著斑激酶在2 型糖尿病大鼠腎組織中的表達(dá)變化及意義[J].中國病理生理雜志,2013,29(8):1400-1405.

[8] Aso Y, Fujiwara Y, Tayama K, et al.Elevation of von Wi-llebrand factor in plasma in diabetic patients with neuropathic foot ulceration[J]. Diabet Med, 2002, 19(1):19-26.

[9] Taniguchi S, Hashiguchi T, Ono T, et al. Association between reduced ADAMTS13 and diabetic nephropathy[J]. Thromb Res, 2010, 125(6):310-316.

[10]Shirakawa J, Togashi Y, Tajima K, et al. Plasminogen activator inhibitor -1 is associated with renal dysfunction independent of BMI and serum lipid levels in patients with type 2 diabetes [J]. Diabetes Res Clin Pract, 2012, 97(1):9-12.

[11]Festa A, Williams K, Tracy RP, et al. Progression of plasminogen activator inhibitor-1 and fibrinogen levels in relation to incident type 2 diabetes[J]. Circulation, 2006, 113(14):1753-1759.

[12]郭立芳, 李林林, 張雪云, 等.糖尿病腎病的中醫(yī)藥研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2011,17(13):2049-2052.

[13]宋家瑛．糖尿病腎病血瘀證的辨證特點(diǎn)及對患者血液流變學(xué)影響的觀察[J]．天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2001,20(3): 8-9.

[14]樸春麗, 南紅梅, 姜 喆, 等.從炎癥發(fā)病機(jī)制探討中醫(yī)治療糖尿病腎病的思路與方法[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,25(4):365-367.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Influence of Tangshen formula on endothelial function and hemorheology in diabetic nephropathy rats

DU Yue-guang1, GU Jing-jing1, CHAI Ke-fu2

(1PathologyDepartment,2NationalTCMClinicalResearchCenter,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China.E-mail:ckf666@163.com)

AIM: To explore the influence of Tangshen formula (TS) on endothelial function and blood rheology in diabetic nephropathy (DN) rats. METHODS: The DN rat model was established by intravenous injection of low-dose (30 mg/kg) streptozotocin (STZ) after having the high-fat/high-glucose diets for one month. The animals were divi-ded into DN model group, TS group and valsartan group. Fasting blood glucose (FBG), serum total cholesterol (TC), serum triglyceride (TG), renal cortex blood flow and hemorheology were monitored. The content of von Willebrand’s factor (vWF) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) in the serum was determined by ELISA. RESULTS: Compared with normal group, FBG,TC,TG, vWF and PAI-1 were increased in DN model group (P<0.01). Compared with DN model group, TC, TG, vWF and PAI-1 were decreased in TS group and valsartan group (P<0.05), and no significant difference of FBG was observed. Compared with normal group, plasma viscosity, Casson viscosity, whole blood high/medium/low-shear viscosity, erythrocyte aggregation index, erythrocyte rigidity index and erythrocyte electrophoresis time were increased, and erythrocyte deformation index was decreased in DN model group (P<0.01). Compared with DN model group, plasma viscosity, Casson viscosity, whole blood high/medium/low-shear viscosity, erythrocyte aggregation index, erythrocyte rigidity index and erythrocyte electrophoresis time were decreased (P<0.05), but there was no significant difference for erythrocyte deformation index in TS group. Compared with normal group, the renal cortex microcirculation blood flow in DN model group was significantly decreased. Compared with DN model group, the renal cortex microcirculation blood flow was significantly increased in TS group (P<0.05), and no significant change in valsartan group was found. CONCLUSION: Tangshen formula plays a protective role in the kidney of diabetic rats by improving the blood rheology and endothelial function, thus ameliorating the renal cortex microcirculation blood flow in experimental diabetic rats.

Diabetic nephropathy; Tangshen formula; Microcirculation; Endothelial function; Hemorheology

1000- 4718(2016)11- 2079- 04

2016- 06- 08

2016- 09- 01

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81273615)

R285; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.027

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 13588111461； E-mail: ckf666@163.com