丁 煌， 李靜嫻， 楊筱倩， 唐 標(biāo)， 劉曉丹， 唐映紅， 鄧常清， 黃小平

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)分子病理實(shí)驗(yàn)室，中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

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黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)糖復(fù)氧后細(xì)胞自噬和PI3K信號(hào)通路的影響*

丁 煌， 李靜嫻， 楊筱倩， 唐 標(biāo)， 劉曉丹， 唐映紅， 鄧常清， 黃小平△

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)分子病理實(shí)驗(yàn)室，中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

目的： 探討黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪后再?gòu)?fù)糖復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的影響及作用機(jī)制。方法:以PC12細(xì)胞建立OGD/R自噬性損傷模型，觀察黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對(duì)細(xì)胞自噬的影響，并通過(guò)PI3K Ⅰ/Akt/mTOR和PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號(hào)通路研究黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍的作用機(jī)制。結(jié)果:氧糖剝奪2 h復(fù)糖復(fù)氧24 h后，PC12細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值增加。黃芪甲苷、人參皂苷Rg1及黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍均能下調(diào)OGD/R后PC12細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值，且配伍組的效應(yīng)強(qiáng)于藥物單用組。機(jī)制研究表明，人參皂苷Rg1單用及黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍能升高PI3K Ⅰ、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平，配伍的效應(yīng)強(qiáng)于藥物單用；黃芪甲苷單用及黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍均能抑制PI3K Ⅲ、beclin-1蛋白表達(dá)，而配伍還能上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，且配伍的效應(yīng)強(qiáng)于藥物單用組。結(jié)論:PC12細(xì)胞在缺糖缺氧2 h再?gòu)?fù)糖復(fù)氧24 h后，細(xì)胞出現(xiàn)自噬；黃芪甲苷和人參皂苷Rg1均能減輕OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬，且2者配伍對(duì)細(xì)胞自噬具有協(xié)同抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K Ⅰ/Akt/mTOR和PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號(hào)通路有關(guān)。

黃芪甲苷； 人參皂苷Rg1； PC12細(xì)胞； 自噬； PI3K Ⅰ/Akt/mTOR信號(hào)通路； PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號(hào)通路

細(xì)胞自噬是細(xì)胞受到刺激后，通過(guò)溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身代謝需要和某些細(xì)胞器更新的過(guò)程[1]。已有研究表明，在神經(jīng)細(xì)胞氧糖剝奪后再?gòu)?fù)糖復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模擬的腦缺血再灌注損傷模型中，缺糖缺氧可誘發(fā)自噬性損傷[2-3]。黃芪和三七是臨床治療心腦血管疾病的常用有效中藥，二者常配伍使用。我們前期研究表明，黃芪的有效成分黃芪甲苷和三七的有效成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1配伍可發(fā)揮抗缺血性腦損傷的作用，其作用可能主要來(lái)自于黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的配伍[4]。藥物相互作用研究表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1對(duì)PC12細(xì)胞缺糖缺氧2 h再?gòu)?fù)糖復(fù)氧24 h引起的細(xì)胞自噬性損傷具有抑制作用，兩藥配伍對(duì)細(xì)胞自噬性損傷具有協(xié)同抑制作用，但其機(jī)制還不清楚。因此，本研究采用PC12細(xì)胞氧糖剝奪后再?gòu)?fù)糖復(fù)氧模擬細(xì)胞缺血再灌注損傷模型，研究黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍對(duì)細(xì)胞自噬性損傷的作用機(jī)制，為其合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑 胰蛋白酶、Hochest 33258(Solarbio)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(HyClone)；無(wú)糖Earle’s培養(yǎng)基(Biotopped)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)、兔抗大鼠Tyr607磷酸化Ⅰ型磷脂酰肌醇3-激酶(class Ⅰphospho-phosphoinositide 3-kinase, p-PI3K Ⅰ)抗體、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Sigma)；二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)(MP Biomedicals)；兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白3(microtubule -associated protein 1 light chain 3，LC3) 抗體(MBL)；兔抗大鼠Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(class Ⅲ phosphoinositide 3-kinase, PI3K Ⅲ)抗體(Cell Signaling Technology)；兔抗大鼠beclin-1 抗體、兔抗大鼠Ser2481磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phospho-mammalian target of rapamycin, p-mTOR)抗體(Abcam)；兔抗大鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(中國(guó)博奧森)；兔抗大鼠Tyr315/316/312磷酸化蛋白激酶B(phospho- protein kinase B, p-Akt)抗體(Santa Cruz Biotechnology)；小鼠抗大鼠β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗兔、羊抗小鼠的 II 抗(Proteintech)；熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明(tetraethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC)標(biāo)記的羊抗兔II抗(Boster)；曲拉通X-100(上海國(guó)藥集團(tuán))； ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Tamper Evident Seal)；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)(Selleck)；雷帕霉素(rapamycin，Rapa)(Gene Operation)。

1.2 細(xì)胞株 PC12細(xì)胞是來(lái)源于大鼠的高分化、永生性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，美國(guó)模式培養(yǎng)物收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)中的編號(hào)為CRL-1721，購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心。

1.3 受試藥物 黃芪甲苷、人參皂苷Rg1購(gòu)自中國(guó)成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%。黃芪甲苷以含0.1% DMSO的PBS溶解，人參皂苷Rg1以PBS溶解。

2 方法

2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)及OGD/R自噬性損傷模型的建立 根據(jù)我們以往的研究，PC12細(xì)胞在缺糖缺氧2 h再?gòu)?fù)糖復(fù)氧24 h后，細(xì)胞產(chǎn)生自噬性損傷，且損傷程度達(dá)高峰。因此，在本研究中，采用缺糖缺氧2 h再?gòu)?fù)糖復(fù)氧24 h制作細(xì)胞自噬性損傷模型。細(xì)胞以DMEM高糖培養(yǎng)基(含4.5 g/L葡萄糖、10%胎牛血清和1%青鏈霉素)于37 ℃、20% O2、75% N2、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，2 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后傳代培養(yǎng)。以1×107/L密度接種于12孔或96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后再加終濃度50 μg/L的NGF誘導(dǎo)分化48 h后[5]，棄原培養(yǎng)液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于G0期。然后進(jìn)行如下處理：細(xì)胞加無(wú)糖Earle’s培養(yǎng)液，置于三氣培養(yǎng)箱中(5% CO2、1% O2、94% N2)模擬缺糖缺氧培養(yǎng)2 h后，換成DMEM高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)糖復(fù)氧24 h，復(fù)制OGD/R模型。

2.2 自噬標(biāo)志蛋白LC3的測(cè)定 根據(jù)我們對(duì)藥物相互作用的研究，表明在缺糖缺氧2 h再?gòu)?fù)糖復(fù)氧24 h后，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1以IC50劑量進(jìn)行1∶1配伍時(shí)對(duì)細(xì)胞自噬的抑制呈協(xié)同作用，因此，我們選用該劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1的IC50分別為3.45 mg/L 1.71 mg/L。實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、黃芪甲苷組、人參皂苷Rg1組、配伍組、3-MA(自噬抑制劑)組及雷帕霉素(自噬誘導(dǎo)劑)組。正常對(duì)照組換DMEM高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。模型組造模。3-MA終濃度為25 mmol/L[6-7]，雷帕霉素終濃度為200 nmol/L[8]。均于缺糖缺氧前30 min加入藥物，再進(jìn)行缺糖缺氧和復(fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)。每組重復(fù)3次。細(xì)胞處理完成后以Western blot法測(cè)定LC3蛋白表達(dá)。操作步驟簡(jiǎn)述如下：吸去培養(yǎng)上清液，PBS洗滌，刮下細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后棄去上清，加入100 μL蛋白裂解液和1 μL蛋白酶抑制劑，充分混勻后冰上靜置20 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA試劑盒測(cè)定總蛋白含量；取30 μg蛋白100 ℃水浴10 min變性后，120 V恒壓電泳70 min后，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，再分別與兔抗大鼠LC3的I 抗(1∶500)和小鼠抗大鼠β-actin的I 抗(1∶1 000)混合，4 ℃靜置過(guò)夜，TBS洗3次后TBST洗1次，然后分別加羊抗兔 II 抗(1∶2 000)或羊抗小鼠 II抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，TBS洗3次后TBST洗1次，暗室中加ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影；Image Pro-Plug 6.0圖像分析軟件測(cè)定目的條帶的累積吸光度(IA)值，以目的條帶的IA與β-actin條帶的IA的比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。自噬發(fā)生后，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ，分子量為18 kD)會(huì)酶解切掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型LC3(即LC3-Ⅱ，分子量為16 kD)，通過(guò)Western blot法可以分別檢測(cè)到這2個(gè)蛋白質(zhì)，計(jì)算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以反映自噬的程度。

2.3 PI3K Ⅰ/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、黃芪甲苷組，人參皂苷Rg1組、配伍組和雷帕霉素(mTOR抑制劑)+黃芪甲苷組、雷帕霉素+人參皂苷Rg1組、雷帕霉素+配伍組、雷帕霉素組。均于缺糖缺氧前30 min向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入藥物，再同上進(jìn)行缺糖缺氧和復(fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)。每組重復(fù)3次。以Western blot法測(cè)定細(xì)胞p-PI3K Ⅰ、p-Akt和p-mTOR的蛋白水平，測(cè)定方法同2.2。各種 I 抗的稀釋倍數(shù)為兔抗大鼠p-PI3K Ⅰ(1∶500)、兔抗大鼠p-Akt(1∶500)、兔抗大鼠p-mTOR(1∶500)和小鼠抗大鼠β-actin(1∶1 000)。以目的條帶的IA與β-actin條帶的IA的比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、黃芪甲苷組，人參皂苷Rg1組、配伍組、3-MA(PI3K Ⅲ抑制劑)+黃芪甲苷組、3-MA+人參皂苷Rg1組、3-MA+配伍組和3-MA組。藥物處理同前。每組重復(fù)3次。以Western blot法測(cè)定細(xì)胞PI3K Ⅲ、beclin-1及Bcl-2的蛋白水平。測(cè)定方法同2.2。各 I 抗的稀釋倍數(shù)為兔抗大鼠PI3K Ⅲ(1∶500)、兔抗大鼠beclin-1(1∶500)、兔抗大鼠Bcl-2(1∶500)和小鼠抗大鼠β-actin(1∶1 000)。以目的條帶的IA與β-actin條帶的IA的比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。各指標(biāo)數(shù)據(jù)經(jīng)分析均為正態(tài)分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對(duì)OGD/R后PC12細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響

由圖1可見(jiàn)，缺糖缺氧2 h復(fù)糖復(fù)氧24 h后，細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)減少、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，黃芪甲苷組、人參皂苷Rg1組、黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍組及3-MA組LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)增加、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(P<0.01)，且黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍的效應(yīng)大于各藥物單用(P<0.01)，與3-MA比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與模型組比較，雷帕霉素組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加(P<0.05)。

2 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對(duì)PI3K Ⅰ/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

由圖2、表1可見(jiàn)，與正常組比較，模型組p-PI3K Ⅰ水平顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，人參皂苷Rg1組、配伍組、人參皂苷Rg1+雷帕霉素組、配伍+雷帕霉素組的p-PI3K Ⅰ水平顯著增多(P<0.01)；黃芪甲苷組、黃芪甲苷+雷帕霉素及雷帕霉素組對(duì)PI3K Ⅰ蛋白的磷酸化無(wú)顯著影響。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍組的效應(yīng)大于兩藥單用組(P<0.01)；配伍+雷帕霉素組效應(yīng)大于黃芪甲苷+雷帕霉素與人參皂苷Rg1+雷帕霉素組(P<0.01)，與配伍組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

Figure 1.Comparison of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in the PC12 cells with different treatments. AST IV: astragaloside IV; Rg1: Ginsenoside Rg1. Mean±SD.n=3.▲▲P<0.01vsnormal group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group;★★P<0.01vscombination group.

圖1 各組細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比較

Figure 2.The images of Western blot for determining the protein levels of p-PI3K Ⅰ, p-Akt, p-mTOR in the PC12 cells with different treatments. 1: normal; 2: model; 3: astragaloside IV; 4: ginsenoside Rg1; 5: combination; 6: astragaloside IV + Rapa; 7: ginsenoside Rg1+ Rapa; 8: combination + Rapa; 9: Rapa.

圖2 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞p-PI3KⅠ、p-Akt和p-mTOR的蛋白水平

與正常組比較，模型組的p-Akt蛋白水平顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，人參皂苷Rg1組、配伍組、人參皂苷Rg1+雷帕霉素組、配伍+雷帕霉素組的p-Akt蛋白水平顯著增高(P<0.05)；黃芪甲苷組、黃芪甲苷+雷帕霉素及雷帕霉素組對(duì)Akt蛋白的磷酸化無(wú)顯著影響。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍組的效應(yīng)大于單用組(P<0.01)；配伍+雷帕霉素

表1 各組細(xì)胞p-PI3K Ⅰ、p-Akt和p-mTOR蛋白水平的比較

組效應(yīng)顯著大于黃芪甲苷+雷帕霉素與人參皂苷Rg1+雷帕霉素組(P<0.05)，與配伍組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

與正常組比較，模型組的p-mTOR蛋白水平顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，人參皂苷Rg1組、配伍組、人參皂苷Rg1+雷帕霉素組及配伍+雷帕霉素組的p-mTOR蛋白水平顯著增高(P<0.05)；雷帕霉素及黃芪甲苷+雷帕霉素組可進(jìn)一步下調(diào)p-mTOR的蛋白水平(P<0.05)。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍組的p-mTOR蛋白磷酸化水平顯著高于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1單用組及配伍+雷帕霉素組(P<0.05)；配伍+雷帕霉素組p-mTOR的蛋白量顯著高于黃芪甲苷+雷帕霉素組、人參皂苷Rg1+雷帕霉素組(P<0.05)。

3 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對(duì)PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號(hào)通路的影響

由圖3、表2可見(jiàn)，與正常組比較，模型組PI3K Ⅲ的蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)。與模型組比較，藥物組除人參皂苷Rg1外均能顯著下調(diào)PI3K Ⅲ蛋白表達(dá)(P<0.05)，且配伍組的效應(yīng)顯著大于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1單用組(P<0.01)；配伍+3-MA組的效應(yīng)顯著大于其它藥物組(P<0.05)；黃芪甲苷+3-MA的效應(yīng)顯著強(qiáng)于3-MA組(P<0.05)；配伍組的效應(yīng)強(qiáng)于3-MA組(P<0.05)。

Figure 3.The images of Western blot for determining the protein levels of PI3K Ⅲ, beclin-1, Bcl-2 in the PC12 cells with different treatments. 1: normal; 2: model; 3: astragaloside IV; 4:ginsenoside Rg1; 5: combination; 6: astragaloside IV + 3-MA; 7: ginsenoside Rg1 + 3-MA; 8: combination + 3-MA; 9: 3-MA.

圖3 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K Ⅲ、beclin-1和Bcl-2的蛋白水平

與正常組比較，模型組的beclin-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，藥物組除人參皂苷Rg1組外均能顯著降低beclin-1蛋白表達(dá)(P<0.01)，且配伍組的效應(yīng)顯著強(qiáng)于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1單用組(P<0.01)；配伍+3-MA組的效應(yīng)顯著大于其它藥物組(P<0.05)。配伍組、黃芪甲苷+3-MA組效應(yīng)均強(qiáng)于3-MA組(P<0.05)，配伍組與黃芪甲苷+3-MA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

與正常組比較，模型組的Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，配伍與配伍+3-MA能顯著升高Bcl-2蛋白的表達(dá)(P<0.05)，且配伍組Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著高于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1單用組(P<0.05)；配伍+3-MA組的Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著高于黃芪甲苷+3-MA與人參皂苷Rg1+3-MA組(P<0.05)；配伍+3-MA組與配伍組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

表2 各組細(xì)胞PI3K Ⅲ、beclin-1和Bcl-2蛋白表達(dá)的比較

討 論

自噬既可以作為一種防御機(jī)制清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器、代謝產(chǎn)物，進(jìn)行亞細(xì)胞水平上的重構(gòu)，保護(hù)受損的細(xì)胞，同時(shí)它作為一種細(xì)胞死亡程序誘導(dǎo)細(xì)胞主動(dòng)性死亡[8-9]。根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)到達(dá)溶酶體腔途徑的不同，自噬可以分為大自噬、小自噬以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬3種形式，通常所說(shuō)的“自噬”主要指大自噬，其過(guò)程大致包括：自噬的誘導(dǎo)(形成自噬前體)、自噬體的形成、自噬溶酶體的形成以及內(nèi)容物的降解[10]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期研究結(jié)果，在建立PC12細(xì)胞氧糖剝奪后再?gòu)?fù)糖復(fù)氧細(xì)胞自噬性損傷模型的基礎(chǔ)上，利用LC3蛋白判斷藥物對(duì)自噬的影響。LC3是自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，Atg)8的同源物，自噬產(chǎn)生過(guò)程中LC3在半胱氨酸蛋白酶Atg4的作用下脫去羥基端變成LC3-Ⅰ，隨后LC3-Ⅰ被Atg7激活并轉(zhuǎn)位到Atg3，在Atg3的作用下與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)連接并酯化形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體的內(nèi)膜和外膜，促進(jìn)自噬體膜的延長(zhǎng)與融合，參與自噬體的形成。LC3-Ⅱ?yàn)榉核貥拥鞍?，始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，被用來(lái)作為自噬體形成的標(biāo)記，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小在一定程度上反映了自噬體的數(shù)量和細(xì)胞自噬水平的高低[1, 11-12]。

本研究結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞在OGD 2 h、復(fù)氧復(fù)糖24 h后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，表明OGD/R后，產(chǎn)生了細(xì)胞自噬。黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、2藥配伍以及自噬抑制劑3-MA均能顯著降低自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)，且黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍的效應(yīng)強(qiáng)于單用。自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可使OGD/R誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值進(jìn)一步升高。表明黃芪甲苷與人參皂苷Rg1能阻止OGD/R后PC12細(xì)胞自噬的發(fā)生，且二者配伍后的作用增強(qiáng)。

PI3K Ⅰ/Akt/mTOR和PI3K Ⅲ/becline1/Bcl-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在自噬的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[13-14]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種在進(jìn)化上較為保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在2種不同的復(fù)合物形式，其中mTORC1對(duì)雷帕霉素敏感。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)足夠時(shí)，mTORC1與失調(diào)51樣激酶(uncoordinated-51-like-kinase, ULK)復(fù)合物結(jié)合，促使ULK1(或ULK2)及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Atg13磷酸化，調(diào)節(jié)自噬的起始階段從而對(duì)自噬產(chǎn)生抑制作用。但是當(dāng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)不足(如缺糖缺氧)或雷帕霉素刺激下，mTORC1與ULK復(fù)合物分離，使mAtg13去磷酸化，介導(dǎo)自噬前體的形成、成核與延伸，從而誘導(dǎo)自噬[15-16]。激活的PI3K Ⅰ能在細(xì)胞中產(chǎn)生第二信使磷脂酰肌醇-3、4、5-三磷酸(phosphoinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3)，PIP3在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1，PDK1)的協(xié)助下，激活A(yù)kt，激活的Akt能夠抑制結(jié)節(jié)性硬化癥1/2(tuberous sclerosis complex，TSC1/2)復(fù)合物，從而激活mTORC1，進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素通過(guò)抑制mTORC1進(jìn)而使細(xì)胞產(chǎn)生自噬[17-18]。

研究結(jié)果表明，OGD/R后，PC12細(xì)胞的p-PI3K Ⅰ、p-Akt、p-mTOR蛋白減少，表明OGD/R抑制了PI3K Ⅰ、Akt、mTOR蛋白的磷酸化，從而通過(guò)抑制PI3K Ⅰ/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)了自噬發(fā)生。人參皂苷Rg1、兩藥配伍、人參皂苷Rg1+雷帕霉素、配伍+雷帕霉素均可以使磷酸化的PI3K Ⅰ、Akt、mTOR蛋白增多，且配伍的效應(yīng)強(qiáng)于黃芪甲苷或人參皂苷Rg1單用。黃芪甲苷對(duì)p-PI3K Ⅰ、p-Akt、p-mTOR蛋白水平無(wú)影響。雷帕霉素對(duì)PI3K Ⅰ、Akt蛋白的磷酸化無(wú)明顯影響，但顯著抑制mTOR蛋白的磷酸化，且能阻斷人參皂苷Rg1及黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對(duì)mTOR蛋白的激活作用。表明人參皂苷Rg1可以通過(guò)激活PI3K Ⅰ/Akt/mTOR信號(hào)通路減輕GOD/R誘導(dǎo)的自噬性損傷，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對(duì)該信號(hào)通路的激活有促進(jìn)作用。

Beclin-1是酵母自噬基因Atg6的同源基因，beclin-1蛋白含有BH3(Bcl-2-homology3)結(jié)構(gòu)域，可以通過(guò)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain，CCD)和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域(evolutionarily conserved domain，ECD)與PI3K Ⅲ結(jié)合，形成beclin 1- PI3K Ⅲ復(fù)合體，介導(dǎo)自噬前體和自噬體膜的形成，從而上調(diào)細(xì)胞自噬水平[19-20]。Bcl-2含有BH3 受體，Bcl-2蛋白和PI3K Ⅲ分別結(jié)合beclin-1的不同區(qū)域，在正常情況下beclin-1與Bcl-2 家族蛋白持續(xù)結(jié)合，阻止beclin-1蛋白與PI3K Ⅲ結(jié)合，或者減少PI3K Ⅲ磷酸化活性，從而抑制自噬[3, 21-22]。所以，PI3K Ⅲ和beclin1作為正調(diào)控因子，抗凋亡因子Bcl-2作為負(fù)調(diào)控因子共同參與調(diào)控自噬，且自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤通過(guò)抑制PI3K-Ⅲ的活性而抑制自噬[23]。

本研究結(jié)果表明，OGD/R細(xì)胞的PI3K Ⅲ、beclin-1及Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明OGD/R后PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號(hào)通路被激活。藥物組除人參皂苷Rg1組外均可顯著下調(diào)PI3K Ⅲ和beclin-1蛋白表達(dá)，且黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍降低PI3K Ⅲ、beclin-1蛋白表達(dá)的效應(yīng)強(qiáng)于藥物單用組。配伍+3-MA組及配伍組還能顯著升高Bcl-2蛋白的表達(dá)，其它各藥物對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的下降無(wú)顯著影響。表明黃芪甲苷可能通過(guò)下調(diào)OGD/R后PI3K Ⅲ與beclin-1蛋白的表達(dá)，減少二者的結(jié)合，從而抑制PI3K Ⅲ/beclin-1信號(hào)通路阻止自噬的發(fā)生或抑制自噬的活性；黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對(duì)PI3K Ⅲ/beclin-1信號(hào)通路的抑制作用有增強(qiáng)作用。除此之外，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍還可上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，可能使Bcl-2蛋白與beclin-1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PI3K Ⅲ，導(dǎo)致PI3K Ⅲ與beclin-1的結(jié)合減少，延緩自噬體的發(fā)生，進(jìn)一步達(dá)到增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞自噬的抑制作用。

綜上所述，在缺糖缺氧2 h再?gòu)?fù)糖復(fù)氧24 h后，PC12細(xì)胞出現(xiàn)自噬，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1均能減少OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，且黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍對(duì)PC12細(xì)胞自噬性損傷具有協(xié)同增效作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K Ⅰ/Akt/mTOR、PI3K Ⅲ/becline-1/Bcl-2信號(hào)通絡(luò)有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 余小慧)

Effects of astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 on autophagy and PI3K signaling pathways of PC12 cells induced by oxygen glucose deprivation/ reoxygenation

DING Huang, LI Jing-xian, YANG Xiao-qian, TANG Biao, LIU Xiao-dan, TANG Ying-hong, DENG Chang-qing, HUANG Xiao-ping

(MolecularPathologyLaboratory,KeyLaboratoryofHunanProvinceforPreventionandTreatmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineonCardio-CerebralDiseases,KeyLaboratoryofHunanUniversitiesforCellBiologyandMolecularTechniques,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China.E-mail:jialeliu@hotmail.com)

AIM: To probe the effect and the mechanism of astragaloside IV and ginsenoside Rg1 on autophagy of PC12 cells induced by oxygen glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R). METHODS: The autophagy injury model of PC12 cells induced by OGD/R was established(PC12 cells were exposed to 2 h of OGD followed by 24 h of reoxygenation). The effects of astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 on autophagy of PC12 cells were observed, and the mechanism was studied through PI3K Ⅰ/Akt/mTOR and PI3K Ⅲ/becline-1/Bcl-2 signaling pathways. RESULTS: After OGD/R, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰin PC12 cells was increased. Astragaloside IV, ginsenoside Rg1 and astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 restrained the increase in LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ, the effect of the combination was greater than using the drug alone. Ginsenoside Rg1, astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 up-regulated the phosphorylation level of PI3K Ⅰ, Akt and mTOR. The effects of the combination were stronger than those of using the drug alone. Astragaloside IV, astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 inhibited the protein expression of PI3K Ⅲ and becline-1, the effects of the combination were better than those of single astragaloside IV and single ginsenoside Rg1. Meanwhile, the combination treatment increased Bcl-2 protein expression. CONCLUSION: The autophagy of PC12 cells induced by OGD/R is inhibited by astragaloside IV and ginsenoside Rg1. Furthermore, astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 plays synergitic inhibition on autophagy, the mechanism may be related to PI3K Ⅰ/Akt/mTOR and PI3K Ⅲ/becline-1/Bcl-2 signaling pathways.

Astragaloside IV; Ginsenoside Rg1; PC12 cells; Autophagy; PI3K Ⅰ/Akt/mTOR signaling pathway; PI3K Ⅲ/becline-1/Bcl-2 signaling pathway

1000- 4718(2016)11- 2003- 07

2016- 06- 06

2016- 09- 30

湖南省科技廳一般項(xiàng)目(No.2014SK3001)；中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管疾病的相關(guān)基礎(chǔ)研究；“中醫(yī)藥防治心腦血管疾病基礎(chǔ)研究”湖南省自然科學(xué)創(chuàng)新群體基金

R363.2

A

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