章科娜， 丁悅敏， 杜月光， 龔 婉， 張 雄

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053; 2浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310015; 3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，浙江 杭州 310058)

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星形膠質(zhì)細(xì)胞的縫隙連接蛋白43參與冷凍傷后腦水腫的形成*

章科娜1， 丁悅敏2， 杜月光1， 龔 婉1， 張 雄3△

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053;2浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310015;3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，浙江 杭州 310058)

目的： 探討腦水腫后星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達(dá)及其在腦水腫的發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。方法:采用顱骨外液氮冷凍法建立大鼠右側(cè)頂葉皮層腦水腫模型。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、腦水腫模型組和腦水腫模型+縫隙連接阻斷劑(carbenoxolone或octanol)干預(yù)組。干濕重法測定冷凍傷后的腦含水量；甲酰胺法測定大鼠血腦屏障通透性的改變；HE染色觀察冷凍傷腦組織的病理變化；Western blot法和免疫組化檢測Cx43蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:冷凍傷可引起大鼠損傷腦皮層區(qū)的含水量增加，在冷凍傷后24 h腦水腫發(fā)展到高峰。冷凍傷引起損傷腦皮層區(qū)域的血腦屏障通透性增加，范圍大于直接冷凍損傷區(qū)。HE染色觀察顯示冷凍傷中心區(qū)細(xì)胞壞死明顯，而冷凍傷周圍區(qū)域出現(xiàn)水腫。腦冷凍傷引起冷凍傷周圍皮層區(qū)域的Cx43蛋白表達(dá)增加，但冷凍傷中心區(qū)的Cx43蛋白表達(dá)降低。Carbenoxolone或octanol阻斷Cx43的功能，降低了冷凍傷皮層區(qū)的含水量和血屏障通透性。結(jié)論:腦水腫時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞上的Cx43表達(dá)上調(diào)，功能增強(qiáng);阻斷Cx43的功能可在一定程度上減輕腦水腫。

縫隙連接蛋白43； 星形膠質(zhì)細(xì)胞； 腦水腫； 縫隙連接； 冷凍傷

腦水腫是各種顱腦疾病及損傷最常見的并發(fā)癥，會導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高，腦疝形成，危害嚴(yán)重[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在所有創(chuàng)傷性顱腦損傷患者中，腦水腫約占死亡率的50%[2]。因此，研究腦水腫的形成機(jī)制和治療策略具有非常重要的臨床意義。此外，創(chuàng)傷后腦水腫的范圍往往不僅僅局限在損傷部位，通常會向損傷周圍區(qū)域擴(kuò)散進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫范圍的擴(kuò)大。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)多于神經(jīng)元，其中大部分由星形膠質(zhì)細(xì)胞組成。已有研究顯示腦水腫早期主要表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體和突起腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫大，線粒體改變，細(xì)胞核、細(xì)胞膜破壞[3]。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹可能是腦水腫發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要因素?？p隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)是構(gòu)成星形膠質(zhì)細(xì)胞間縫隙連接的主要蛋白質(zhì)，具有特殊結(jié)構(gòu)和重要功能，已有許多研究表明它與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著密不可分的關(guān)系，如腦缺血[4-6]、腦創(chuàng)傷[7]、Alzheimer’s病[8-10]、腦腫瘤[11-12]等。有關(guān)Cx43在腦水腫中變化及其相關(guān)機(jī)制至今尚未明確，因此本研究的主要目的是探討腦水腫后Cx43的表達(dá)和功能的變化，并初步闡述Cx43在腦水腫發(fā)生發(fā)展中的作用。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康清潔級成年SD大鼠，雌雄不限，體重為(230±30)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心。隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦水腫模型組、Cx43阻斷劑carbenoxolone(CBX)組和Cx43阻斷劑octanol組。

2 主要試劑

Carbenoxolone(CBX)、octanol、伊文氏藍(lán)(Evans blue,EB)、Tris-base和TTC購自Sigma；羊抗兔connexin 43多克隆抗體購自Bioworld Technology；羊抗兔GAPDH多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；羊抗兔熒光 II抗和羊抗小鼠熒光 II 抗購自LI-COR；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker購自MBI Fermentas；PVDF膜購自Millipore；SDS 購自Sangon Biotech；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、多聚賴氨酸、30%Arc-Bis(29∶1)、SDS-PAGE及蛋白上樣緩沖液均購自碧云天。

3 主要方法

3.1 大鼠腦水腫模型的建立 參照Kawai等[13]的方法加以改進(jìn)。4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，將其俯臥位固定于腦立體定位儀上，備皮，沿正中切開頭皮，分離骨膜，暴露顱骨表面。以前囟向后3 mm，右旁開矢狀縫4 mm為圓心，以直徑5 mm的圓形區(qū)域?yàn)槔鋬鰠^(qū)。將內(nèi)盛定量液氮的自制冷凍杯的銅管(外徑為5 mm，內(nèi)徑為3 mm)置于該區(qū)域，持續(xù)冷凍80 s，造成右側(cè)頂葉腦皮層水腫。手術(shù)過程中將立體定位儀接通水浴加熱，維持肛溫為37～37.5 ℃。冷凍傷結(jié)束后，立即將頭皮縫合，自由飲食飲水。假手術(shù)組(sham組)與冷凍傷模型組(cryoinjury組)同樣進(jìn)行麻醉、切開頭皮和暴露顱骨，但是不進(jìn)行冷凍。

3.2 腦含水量的測定 為觀察冷凍傷后不同時(shí)點(diǎn)的腦含水量，本實(shí)驗(yàn)于冷凍傷后6 h、24 h和72 h，將大鼠斷頭取腦，取損傷側(cè)半球的全部腦皮層，同時(shí)在對側(cè)半球取全部皮層，剝離血管膜，用濾紙吸去表面的水分和血，稱量腦濕重。然后于100 ℃烘箱中烘24 h至恒重，稱量此時(shí)的腦組織干重。用Elliot公式計(jì)算得到腦組織含水量：腦含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。為比較假手術(shù)組、腦水腫模型組、CBX阻斷劑組和octanol阻斷劑組之間的腦含水量，本實(shí)驗(yàn)在冷凍傷后24 h，將大鼠斷頭取腦，切取腦水腫的主要病變區(qū)域，即冷凍傷中心和周圍2 mm區(qū)域的所有腦皮層，同樣采用干濕重法測定腦含水量。

3.3 血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性的測定 采用甲酰胺法測定BBB通透性的改變。首先制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后于冷凍傷后10 min，經(jīng)尾靜脈注射已過濾的2% EB(1 mL/kg)，24 h后再次麻醉，經(jīng)左心室灌注生理鹽水至右心房流出無色液體為止，斷頭取腦，選取冷凍傷部位呈藍(lán)染的皮層以及左側(cè)半球相應(yīng)區(qū)域的腦皮層，稱濕重。然后將腦皮層剪成小塊置于甲酰胺中，37 ℃孵育48 h。孵育結(jié)束后，低速離心，取上清液，在632 nm處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出EB濃度。

3.4 TTC與EB雙染 大鼠在冷凍傷后10 min，經(jīng)尾靜脈注射已過濾的2% EB生理鹽水溶液，于冷凍傷后24 h經(jīng)左心室灌注生理鹽水，至右心房流出清亮液體為止，然后斷頭取腦，切成2 mm厚的冠狀切片，浸泡于2% TTC溶液中，37 ℃避光孵育20 min，中間過程翻動腦組織以保證其能夠充分與TTC溶液反應(yīng)。染色結(jié)果拍照后保存。

3.5 腦組織石蠟切片樣本的采集 于冷凍傷后各時(shí)點(diǎn)麻醉大鼠，經(jīng)左心室灌注生理鹽水，剪開右心耳放血，至右心房流出清亮液體，再用4%多聚甲醛灌注固定至大鼠肢體變硬。然后斷頭取腦，4%多聚甲醛繼續(xù)固定48 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟，包埋成蠟塊，用于HE染色和免疫組化染色。

3.6 Cx43免疫組化染色 采用免疫組化EnVision法檢測：石蠟切片4 μm，60 ℃烤片后常規(guī)脫蠟、水化；置于3% H2O2中10 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次；將切片于0.01 mol/L的檸檬酸鈉緩沖液中煮沸20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫。0.01 mol/L PBS洗3遍；Cx43 Ⅰ抗(1∶50)4℃孵育過夜；次日，用0.01 mol/L PBS洗3次；II抗37 ℃孵育30 min；0.01 mol/L PBS洗3次；DAB顯色，蘇木素染液復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。光鏡下觀察，胞漿或胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，用平均吸光度表示Cx43的相對表達(dá)量。

3.7 Western blot法檢測Cx43的蛋白水平 將大鼠麻醉，經(jīng)左心室生理鹽水灌注后取腦，分別取冷凍傷中心區(qū)域及冷凍傷周圍2 mm的皮層，加入RIPA裂解液，提取總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度。用裂解液將各組蛋白調(diào)至等濃度后，加入上樣緩沖液后充分混勻，于沸水中變性5 min，將制備好的蛋白樣本置于-20 ℃保存，待用。將蛋白樣品按照每泳道30 μg總蛋白上樣，5%濃縮膠部份采用50 V進(jìn)行電泳，待蛋白進(jìn)入12%分離膠后采用110 V繼續(xù)電泳。電泳結(jié)束后，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別用Cx43(1∶1 000)抗體或GAPDH(1∶1 000)抗體孵育，4 ℃過夜。次日，TBST洗3次，用熒光素標(biāo)記的羊抗兔 II 抗(1∶5 000)、羊抗小鼠II抗(1∶5 000)室溫下避光孵育2 h。TBST洗3次。用Odyssey紅外激光雙色圖像分析系統(tǒng)掃膜。ImageJ圖像分析軟件測定光密度值，進(jìn)行定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)的組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)法，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni方法;以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 冷凍傷引起腦含水量增加

用干濕重法測定大鼠在冷凍傷后6 h、24 h和72 h的腦含水量。從圖1可知，冷凍傷后6 h和24 h，損傷區(qū)域的含水量逐漸增加，與sham組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。在冷凍傷后72 h腦含水量降低，與sham組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。上述結(jié)果說明腦冷凍傷后24 h內(nèi)，腦含水量逐漸增加，約在24 h是腦水腫較嚴(yán)重的時(shí)期，所以本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用冷凍傷后24 h作為主要觀察階段。

Figure 1.Brain water content at 6 h, 24 h and 72 h after cryo-injury.Mean±SD.n=4.**P<0.01vssham group.

圖1 冷凍傷后6 h、24 h和72 h腦含水量的變化

2 冷凍傷引起血腦屏障通透性增加

冷凍傷后10 min經(jīng)尾靜脈注射2% EB溶液，通過觀察腦組織的藍(lán)染現(xiàn)象，可以用于評價(jià)冷凍傷后血腦屏障的受損情況。正常情況下，血腦屏障完整，EB不能通過；當(dāng)血腦屏障受損時(shí)，其通透性增加，EB能夠通過血腦屏障，組織被染成藍(lán)色。因此藍(lán)染程度越深則表明血腦屏障的受損程度越大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血腦屏障受損區(qū)域并不僅僅存在于冷凍傷的位置(相當(dāng)于銅管直徑5 mm的圓形區(qū)域)，而是擴(kuò)散至周圍區(qū)域。在冷凍傷中心直徑約5 mm的圓形皮層區(qū)呈現(xiàn)深藍(lán)色，我們定義為冷凍傷中心區(qū)，在冷凍傷周圍2 mm范圍內(nèi)的皮層區(qū)域呈淺藍(lán)色，我們定義為冷凍傷周圍區(qū)。

經(jīng)EB藍(lán)染的腦組織切成2 mm厚的腦片后再進(jìn)行TTC染色，結(jié)果如圖2所示。紅色著色區(qū)域表示的正常腦組織，藍(lán)染區(qū)域是血腦屏障被破壞的區(qū)域。從TTC和EB雙染的結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)損傷主要存在于腦皮層部位，且壞死區(qū)也主要存在于冷凍傷中心區(qū)域。

3 HE染色觀察

HE染色結(jié)果顯示sham組大鼠腦皮層的細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，未見異常。而冷凍傷后24 h，冷凍傷中心區(qū)的細(xì)胞核固縮，細(xì)胞壞死明顯；在冷凍傷周圍區(qū)主要表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞周圍出現(xiàn)水腫，神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間隙擴(kuò)大，而多數(shù)細(xì)胞核較為正常。HE染色結(jié)果提示冷凍傷周圍區(qū)域大腦皮層出現(xiàn)明顯的水腫病變，見圖3。

Figure 2. TTC and Evans blue double staining of the rat brain at 24 h after cryoinjury.

圖2 冷凍傷后24 h大鼠腦組織的TTC與EB雙染

Figure 3. HE staining in the different areas of brain cortex from sham group and cryoinjury group at 24 h after cryoinjury. The scale bar=50 μm. A: the cortex of sham rats; B: the central area of cortex at 24 h after cryoinjury; C: the surrounding area of cortex at 24 h after cryoinjury.

圖3 冷凍傷后24 h不同損傷皮層區(qū)的HE染色

4 冷凍傷區(qū)域Cx43表達(dá)量降低

用ImageJ軟件分析Cx43和GAPDH的吸光度，用GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)，得到各組Cx43蛋白的相對表達(dá)量。以sham組的Cx43表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，與冷凍傷后各時(shí)點(diǎn)的Cx43蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較，計(jì)算得出圖4的結(jié)果。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，損傷后2 h、6 h、12 h、24 h和72 h損傷中心皮層區(qū)域的Cx43表達(dá)均降低，推測是由于多數(shù)細(xì)胞壞死導(dǎo)致蛋白表達(dá)量降低。

Figure 4. Cx43 expression in sham group and in the central area of injured brain cortex at 2 h, 6 h, 12 h, 24 h and 72 h after cryoinjury. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vssham group.

圖4 冷凍傷后不同時(shí)點(diǎn)損傷中心皮層區(qū)域Cx43的表達(dá)情況

5 冷凍傷周圍區(qū)域Cx43表達(dá)量增加

圖5統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與sham組相比，損傷周圍皮層區(qū)域Cx43的表達(dá)量增加。并且隨著冷凍傷后時(shí)間的延長，即損傷后2 h、6 h、12 h、24 h和72 h，Cx43表達(dá)量逐漸增加。

Figure 5. The protein expression of Cx43 in sham group and in the surrounding area of injured brain cortex at 2 h, 6 h, 12 h, 24 h and 72 h after cryoinjury. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vssham group.

圖5 冷凍傷后不同時(shí)點(diǎn)損傷周圍皮層區(qū)域Cx43的表達(dá)情況

6 腦水腫不同時(shí)期Cx43的免疫組化染色結(jié)果

圖6中棕色著色區(qū)域顯示的是Cx43的陽性表達(dá)區(qū)域，棕色顆粒越多，說明Cx43表達(dá)量越多。與sham組相比，冷凍傷后2 h、6 h、24 h和72 h的腦組織切片中，損傷周圍區(qū)出現(xiàn)了明顯的Cx43陽性表達(dá)區(qū)域，這與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，更加充分地證明了腦水腫時(shí)Cx43蛋白的表達(dá)增加。

7 阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cx43降低了腦含水量

從圖7可知，腹腔注射50 mg/kg CBX或5 mmol/L octanol后，冷凍傷后腦組織的含水量比注射生理鹽水組降低。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，與冷凍傷模型組相比，CBX和octanol阻斷劑組能顯著降低腦含水量(P<0.01)。雖然CBX和octanol能在一定程度上降低腦水腫后腦含水量，但是與sham組相比，腦含水量值還是高于sham組，不能使其降低到正常水平。

Figure 6.The distribution of immunoreactivity of Cx43 in the cortex. The scale bar=150 μm.Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vssham group.

圖6 冷凍傷周圍腦皮層中Cx43表達(dá)增加

Figure 7.Brain water content at 24 h after cryoinjury. Octanol and carbenoxolone were injected intraperitoneally.Mean±SD.n=4.**P<0.01vssham group;##P<0.01vscryoinjury group.

圖7 CBX和octanol阻斷縫隙連接蛋白43降低了腦含水量

8 阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cx43減少了BBB的開放

從圖8中可知，腹腔注射50 mg/kg CBX和5 mmol/L octanol均能夠降低損傷區(qū)腦組織的BBB通透性。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，與注射生理鹽水組相比，CBX阻斷劑組能顯著降低BBB的通透性(P<0.01)，而octanol阻斷劑組的效果則不明顯。

討 論

Cx43是形成星形膠質(zhì)細(xì)胞間縫隙連接的主要蛋白質(zhì)，它允許離子和分子量小于1 kD的小分子物質(zhì)(cAMP、IP3、H2O等)自由擴(kuò)散進(jìn)入相鄰的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的物質(zhì)擴(kuò)散和信息傳遞。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冷凍傷引起腦水腫的過程中Cx43蛋白表達(dá)量增加，并采用腹腔注射CBX和octanol來阻斷縫隙連接，使Cx43功能降低，進(jìn)一步使細(xì)胞間通過縫隙連接的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)降低。由于冷凍傷引起血腦屏障通透性增加，這有助于CBX和辛醇通過受損的血腦屏障到達(dá)大腦皮層發(fā)揮縫隙連接阻斷劑的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射阻斷劑CBX和octanol后，腦含水量比生理鹽水組降低；并且采用CBX后，BBB通透性也較生理鹽水組降低。

Figure 8. BBB permeability at 24 h after cryoinjury. Octanol and carbenoxolone were injected intraperitoneally.Mean±SD.n=5.**P<0.01vssham group;##P<0.01vscryoinjury group.

圖8 CBX和octanol阻斷縫隙連接蛋白43降低了BBB通透性

以上結(jié)果提示星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43參與了冷凍傷后腦水腫的形成過程，并且阻斷Cx43的功能可以改善冷凍傷后腦水腫程度，可能機(jī)制如下：

①本實(shí)驗(yàn)采用顱骨外冷凍傷致使的腦水腫模型是血管源性和細(xì)胞毒性混合型腦水腫，即細(xì)胞內(nèi)、外水腫同步發(fā)展而形成。目前認(rèn)為血腦屏障的功能與結(jié)構(gòu)損壞是血管源性腦水腫的病理基礎(chǔ)，而星形膠質(zhì)細(xì)胞終足上的Cx43參與血腦屏障的形成。Hayashi等[14]將星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦內(nèi)皮細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，誘導(dǎo)出血腦屏障的特性。Simard等[15]在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了Cx43在星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足上廣泛存在。Ezan等[16]在出生后2 d 的小鼠腦組織血管周圍的終足上檢測到有星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43的表達(dá)，且在出生后15 d血管系統(tǒng)完全成熟。并且在GFAP陽性細(xì)胞的Cx43基因敲除小鼠上，發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足出現(xiàn)水腫，部分水通道蛋白4缺失，膠質(zhì)細(xì)胞終足上用于錨定在血管周圍基膜的跨膜受體表達(dá)減少。這些結(jié)果表明Cx43對于維持血腦屏障的完整性具有重要的作用，且Cx43缺失會引起細(xì)胞水腫。此外，韓東等[17]的研究也表明octanol可以降低腦缺血再灌注后血腦屏障的通透性增加程度。本實(shí)驗(yàn)采用CBX治療冷凍傷腦水腫的同時(shí)，由于CBX阻斷了細(xì)胞間縫隙連接，改善了由于損傷引起的BBB通透性的改變。其中可能的機(jī)制一是阻斷縫隙連接后抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的雙向鈣信號傳遞。星形膠質(zhì)細(xì)胞的鈣波可以傳遞給內(nèi)皮細(xì)胞并對細(xì)胞內(nèi)的鈣離子變化產(chǎn)生影響。而內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子的變化被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接破壞和血腦屏障開放的關(guān)鍵原因[18-20]。第二，抑制縫隙連接可以阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞間的有害物質(zhì)及信號的傳遞過程，最終導(dǎo)致BBB通透性的改變。

②星形膠質(zhì)細(xì)胞間由Cx43組成的縫隙連接參與水分和代謝應(yīng)激信號的傳遞?？p隙連接允許分子量小于1 kD或直徑小于1.5 nm的分子通過，是細(xì)胞間物質(zhì)和信息跨膜傳遞的重要通道[21]。顱腦創(chuàng)傷后釋放興奮性氨基酸，如谷氨酸→激活NMDA受體→神經(jīng)細(xì)胞對K+、Ca2+和Na+的通透性增加，胞內(nèi)離子濃度增加→胞內(nèi)滲透壓增加→出現(xiàn)細(xì)胞毒性腦水腫。在體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，與野生型大鼠細(xì)胞相比，Cx43基因敲除大鼠釋放谷氨酸減少，這提示谷氨酸可能通過Cx43構(gòu)成的縫隙連接擴(kuò)散至相鄰細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)[22]。另有研究表明當(dāng)細(xì)胞外K+濃度升高時(shí)，引起Cx43表達(dá)增加，細(xì)胞間隙連接的偶聯(lián)程度增強(qiáng)[23]，而神經(jīng)元興奮釋放到胞外的K+主要通過膠質(zhì)細(xì)胞膜上的內(nèi)向整流鉀離子通道被稀釋，進(jìn)一步介導(dǎo)了腦內(nèi)的水轉(zhuǎn)運(yùn)過程[24]。在本實(shí)驗(yàn)中，冷凍傷引起水腫，導(dǎo)致水分和谷氨酸等參與腦水腫形成的代謝物質(zhì)在胞漿中積聚。這些有害代謝物質(zhì)通過損傷后增加的Cx43及其構(gòu)成的縫隙連接進(jìn)入到相鄰的未受損傷的細(xì)胞中，進(jìn)一步擴(kuò)大了腦水腫的范圍并加重水腫的程度。本實(shí)驗(yàn)通過加入CBX和octanol阻斷縫隙連接，在一定程度了阻止了這些有毒物質(zhì)在細(xì)胞間的傳遞，阻止了腦水腫向周圍組織擴(kuò)散，從而改善了腦水腫程度。

綜上所述，腦水腫引起Cx43表達(dá)上調(diào)，可能通過改變血腦屏障通透性或通過形成更多的縫隙連接或者半通道，促使水腫細(xì)胞的水分和其它有害物質(zhì)擴(kuò)散到周圍的細(xì)胞或者外環(huán)境中，導(dǎo)致水腫范圍擴(kuò)大，加重腦水腫。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Astrocytic connexin 43 is involved in development of cryoinjury-induced cerebral edema

ZHANG Ke-na1, DING Yue-min2, DU Yue-guang1, GONG Wan1, ZHANG Xiong3

(1DepartmentofBasicMedicine,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China;2SchoolofMedicine,ZhejiangUniversityCityCollege,Hangzhou310015,China;3DepartmentofBasicMedicine,CollegeofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China.E-mail:xiongzhang@zju.edu.cn)

AIM: To discuss the change of astrocytic connexin 43 (Cx43) expression in cerebral edema and the potential roles of Cx43 in the development of cerebral edema. METHODS: Cryoinjury-induced cerebral edema model was established in the right parietal lobe cortex in the rats. The animals were divided into sham group, cryoinjury-induced cerebral edema model group, and cryoinjury-induced cerebral edema model injected with carbenoxolone (or octanol) group. Dry and wet weight method was used to measure the content of brain water. Methanamide method was used to evaluate the permeability of blood-brain barrier (BBB) after cryoinjury. HE staining showed the physiological changes in injured brain cortex. The protein expression of Cx43 was detected by Western blot and immunohistochemical staining. RESULTS: The brain water content in the injured cortex of rats was increased and cerebral edema developed to the peak at 24 h after cryoinjury. The permeability of BBB was increased in the injured cortex of the rats, and the area where BBB was damaged was larger than injured area. HE staining showed that many cells were dead in the central area of cryoinjury, and at the same time cerebral edema was appeared obviously in the surrounding area of injured brain cortex. The protein expression of Cx43 was up-regulated in the surrounding area of injured brain cortex, while Cx43 expression decreased in the injured cortex at different periods after cryoinjury. Both the content of brain water in the injured cortex and the permeability of BBB at 24 h after cryoinjury were reduced after injecting carbenoxolone or octanol intraperitoneally to block Cx43. CONCLUSION: The cerebral edema up-regulates the expression of Cx43 and also strengthens its function. Once Cx43 is blocked, the degree of cerebral edema in rats is attenuated.

Connexin 43; Astrocytes; Cerebral edema; Gap junction; Cryoinjury

1000- 4718(2016)11- 1996- 07

2016- 05- 30

2016- 09- 01

浙江省教育廳科研項(xiàng)目(No. Y201120080)；浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金(No. 2014ZY02)

R338.2; R363.1+2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.013

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