楊 倩， 容春莉， 王立立， 宋學(xué)蓮， 齊曉勇

(河北省人民醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

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MPO、MMP-2和MMP-9在兔房顫模型心房肌中的表達(dá)變化*

楊 倩， 容春莉， 王立立， 宋學(xué)蓮， 齊曉勇△

(河北省人民醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

目的： 觀(guān)察兔房顫模型心房肌組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表達(dá)，并探討三者與房顫時(shí)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的關(guān)系。方法:20只新西蘭大白兔，開(kāi)胸后于左心房植入起搏電極，隨機(jī)分為2組：快速心房起搏組(RAP組)以600 min-1的頻率快速起搏心房3周；假手術(shù)組(sham組)不予起搏。起搏前、后行超聲心動(dòng)圖檢查評(píng)價(jià)心房和心室的結(jié)構(gòu)和功能，行心房burst刺激檢測(cè)房顫誘發(fā)率；起搏后采用Masson染色評(píng)價(jià)心房的間質(zhì)纖維化程度，采用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)心房MPO、MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:起搏3周后，與sham組相比，RAP組兔左心房明顯擴(kuò)張伴收縮功能障礙，左心室的結(jié)構(gòu)和功能變化不明顯；RAP組房顫誘發(fā)率和間質(zhì)纖維化百分比均明顯增加，且心房MPO、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加。結(jié)論:持續(xù)快速心房起搏兔房顫模型會(huì)出現(xiàn)明顯心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，心房MPO、MMP-2和MMP-9表達(dá)上調(diào)可能是其潛在的分子機(jī)制。

快速心房起搏； 心房顫動(dòng)； 髓過(guò)氧化物酶； 基質(zhì)金屬蛋白酶

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)，簡(jiǎn)稱(chēng)房顫，是臨床上最常見(jiàn)的心律失常之一[1]。它可以導(dǎo)致心血管疾病的致死率和致殘率增加，嚴(yán)重影響患者的壽命和生活質(zhì)量，增加醫(yī)療支出和社會(huì)負(fù)擔(dān)[2]。近年來(lái)，雖然射頻消融和藥物治療取得了極大的進(jìn)展，房顫的治療仍不盡如人意[3]。因此，深入探討房顫的發(fā)病機(jī)制，從而探索房顫治療的新方法，仍是臨床亟待解決的問(wèn)題。

房顫發(fā)生和維持的主要機(jī)制是心房重構(gòu)，其中心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)不完全可逆，是房顫的中心環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為心房擴(kuò)張和間質(zhì)纖維化[2,4]。近年來(lái)的研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，尤其是MMP-2和MMP-9的表達(dá)及活性增加與心房間質(zhì)纖維化密切相關(guān)[5]；髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)可以催化生成具有強(qiáng)氧化性的次氯酸，促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活化，促進(jìn)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，最終導(dǎo)致房顫[6]。本研究通過(guò)快速心房起搏(rapid atrial pacing，RAP)的方法建立兔房顫模型，觀(guān)察該模型心房肌組織MPO、MMP-2和MMP-9表達(dá)的變化，并探討三者與房顫時(shí)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和材料

選用20只新西蘭大白兔作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體重2.5～3.5 kg，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物心臟起搏器購(gòu)自上海復(fù)旦旦華科技有限公司，電壓5 V，起搏頻率為 600 min-1。采用Philip IU22超聲診斷儀測(cè)定各項(xiàng)心臟超聲指標(biāo)；采用蘇州東方DF-5A型電生理刺激儀行心房burst刺激。MPO抗體購(gòu)自Santa Cruz，MMP-2、MMP-9和內(nèi)參照β-actin抗體均購(gòu)自Protein Tech。

2 主要方法

2.1 兔房顫模型建立 3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉后，將兔仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，備皮，于胸骨左緣第3、4肋間打開(kāi)胸腔，暴露心臟，找到左心房，采用結(jié)扎左心耳的方法將起搏電極固定于左心房，引出電極，關(guān)閉胸腔。電極沿皮下隧道移行至右側(cè)后背部，應(yīng)用電生理刺激儀測(cè)試電極，保證裸露導(dǎo)線(xiàn)與心房肌接觸良好，且與胸壁絕緣。于兔右側(cè)背部脊柱旁制作起搏器囊袋，用慶大霉素沖洗囊袋后，將動(dòng)物起搏器與起搏電極連接固定，起搏器設(shè)置為關(guān)閉狀態(tài)，置于皮下囊袋中[7]。術(shù)后青霉素抗感染治療，恢復(fù)1周。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為2組：快速心房起搏組(RAP 組)：開(kāi)胸、固定左心房電極、持續(xù)起搏3周，每日行心電圖檢查，保證起搏器正常工作；假手術(shù)組(sham組)：開(kāi)胸、固定左心房電極、不起搏。

2.3 超聲心動(dòng)圖指標(biāo)測(cè)定 采用超聲診斷儀于起搏前后行經(jīng)胸?zé)o創(chuàng)心臟超聲檢查，測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心房?jī)?nèi)徑(left atrial diameter，LAD)。于心尖4腔切面及心尖兩腔切面，應(yīng)用雙平面面積長(zhǎng)度法，在二尖瓣開(kāi)放前測(cè)量左心房最大容量(left atrial maximal volume，LAVmax)；在舒張末期(二尖瓣關(guān)閉后)測(cè)量左心房最小容量(left atrial minimal volume，LAVmin)。左心房射血分?jǐn)?shù)(left atrial ejection fraction，LAEF)通過(guò)應(yīng)用公式計(jì)算得出，公式為：LAEF=(LAVmax-LAVmin)/LAVmax×100%[8]。

2.4 房顫誘發(fā)率測(cè)定 采用電生理刺激儀于起搏前后行心房burst刺激測(cè)定房顫誘發(fā)率。給予S1S1刺激，周長(zhǎng)50 ms，電壓為2倍舒張期閾值電壓+0.5 V，重復(fù)8次(前4次每次6 s，后4次每次12 s)[9]。計(jì)算公式：房顫誘發(fā)率(%)=誘發(fā)房顫成功兔只數(shù)/行Burst刺激兔總只數(shù)×100%。

2.5 心房間質(zhì)纖維程度測(cè)定 采用4%多聚甲醛溶液固定左心房組織，石蠟包埋后制成厚度約為5 μm的石蠟切片，行Masson染色。顯微鏡下，心肌間質(zhì)纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色。每個(gè)標(biāo)本選取5個(gè)視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)獲得的圖片進(jìn)行圖像分析，心房纖維化百分比(%)=心房纖維組織面積/(心房纖維組織面積+心房肌組織面積)×100%[9]。

2.6 心房MPO、MMP-2和MMP-9 mRNA的水平測(cè)定 取50 mg左心房心肌組織進(jìn)行研磨，按照說(shuō)明書(shū)，使用TRIzol(Invitrogen)試劑提取標(biāo)本的總RNA。取2 μg總RNA參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，90 ℃ 5 min。PCR引物由Gene Copoeia合成，具體引物序列見(jiàn)表1。將獲得的cDNA按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)方法擴(kuò)增目的基因，PCR熱循環(huán)參數(shù)：96 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照。設(shè)對(duì)照組樣品為1，按2-ΔΔCt方法計(jì)算各目的基因的相對(duì)定量(relative quantification,RQ)值，將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。

2.7 心房MPO、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)測(cè)定 取左心房心肌組織剪碎，用RIPA裂解液抽提心房肌組織總蛋白，Bardford比色法測(cè)定抽提蛋白的濃度。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，蛋白樣品與4×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液混合后電泳，然后經(jīng)半干轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜，PVDF膜經(jīng)5% BSA封閉2 h，用PBS稀釋的Ⅰ抗工作液4 ℃孵育過(guò)夜，再用1×PBST稀釋3 000倍的Ⅱ抗工作液處理90 min，蛋白條帶通過(guò)顯影、定影后，采用UVP分析儀器，對(duì)膠片進(jìn)行掃描，系統(tǒng)自動(dòng)生成每一個(gè)條帶灰度值。

表1 RT-qPCR的引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 19.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組組內(nèi)前后測(cè)量數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物存活情況

20只新西蘭大白兔，快速心房起搏組10只，術(shù)中死亡1只(死因?yàn)閲?yán)重氣胸引起縱隔擺動(dòng))，起搏過(guò)程中通過(guò)每日復(fù)查心電圖，發(fā)現(xiàn)起搏器未能奪獲心房2只(原因?yàn)槠鸩撝诞惓Ｔ龈吆推鸩姌O脫位)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)成功7只。假手術(shù)組10只，術(shù)中死亡2只(死因?yàn)樾姆科茡p引起大出血和麻醉意外)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中行心房burst刺激時(shí)，發(fā)現(xiàn)S1S1刺激(600次/分)未能奪獲心房1只(原因?yàn)槠鸩姌O脫位)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)成功7只。

2 超聲心動(dòng)圖各指標(biāo)的變化

起搏前,2組兔心房和心室的各項(xiàng)超聲指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。起搏3周后，關(guān)閉起搏器，再次對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量后發(fā)現(xiàn)：快速心房起搏組兔左心房較假手術(shù)組明顯擴(kuò)張(圖1)，LAD、LAVmax和LAVmin明顯增加(P<0．05)，LAEF明顯下降(P<0．05)；快速心房起搏組兔左心室的LVEDD與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，LVESD略增加(P<0.05)，LVEF略下降(P<0.05)，見(jiàn)表2。

Figure 1.Echocardiographic images of diastolic and systolic left atria. A: the left atria of sham group after 4 weeks post-operation; B: the left atria of RAP group after 3 weeks of RAP.

圖1 舒張期和收縮期的左心房超聲影像

表2 左心房和左心室結(jié)構(gòu)和功能的變化

3 房顫誘發(fā)率的變化

起搏前行心電圖檢查，假手術(shù)組和快速心房起搏組兔均為竇性心律，經(jīng)心房burst刺激均未能誘發(fā)房顫。起搏3周后，心電圖(圖2)顯示假手術(shù)組家兔仍為竇性心律，經(jīng)心房burst刺激亦均未誘發(fā)房顫；快速心房起搏組家兔起搏器均良好起搏心房(心房刺激2∶1下傳心室，起搏頻率為600次/分，心室率為300次/分)，關(guān)閉心房起搏器后，心電圖證實(shí)其均維持竇性心律，經(jīng)心房burst刺激后，7只兔子中有6只誘發(fā)持續(xù)性房顫(房顫持續(xù)時(shí)間大于30 min)，房顫誘發(fā)率為86%。

Figure 2.ECG recordings in limb leads (paper speed 50 mm/s). A: ECG showed that the rabbit was subjected to RAP at 600 beats/min; B: ECG showed that the rabbit was still in normal sinus rhythm after 3 weeks of RAP when the pacemaker was deactivated; C: ECG showed that after atrial burst pacing, AF was induced as showed disappearance of P-wave, and absolute irregularity of the RR interval.

圖2 肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖

4 心房纖維化程度的變化

起搏3周后，快速心房起搏組心房纖維化百分比較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The left atrial myocardium with Masson trichrome-staining (×200). Mean±SD.n=7.#P<0.05vssham group.

圖3 左心房Masson染色

5 心房MPO、MMP-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)

起搏3周后，快速心房起搏組心房MPO、MMP-2和MMP-9的mRNA水平較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.mRNA levels of MPO, MMP-2 and MMP-9 in the left atria. Mean±SD.n=7.#P<0.05vssham group.

圖4 左心房MPO、MMP-2和MMP-9 mRNA的水平

6 心房MPO、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

起搏3周后，快速心房起搏組心房MPO、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Protein expression of MPO, MMP-2 and MMP-9 in the left atria. Mean±SD.n=7.#P<0.05vssham group.

圖5 左心房MPO、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

討 論

快速心房起搏房顫動(dòng)物模型重復(fù)性好、房顫誘發(fā)率高且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，是近年來(lái)應(yīng)用最廣泛的房顫動(dòng)物模型[10]。兔、犬、綿羊、豬等動(dòng)物均可用于制備該房顫模型，其中應(yīng)用較廣的是兔和犬房顫模型。犬的體積大、成本高，且持續(xù)快速心房起搏會(huì)導(dǎo)致心室率明顯加快，引起犬心衰[11]；如避免心衰，則需行房室結(jié)消融并植入心室起搏器控制心室率，這使得實(shí)驗(yàn)操作的難度明顯增加[12]。兔的體積小、成本低，且有研究顯示持續(xù)快速心房起搏對(duì)兔的心功能無(wú)明顯影響[13]。本研究結(jié)果顯示：起搏3周后，快速心房起搏組7只兔中有6只可誘發(fā)持續(xù)性房顫，房顫誘發(fā)率高，且左心室的結(jié)構(gòu)和功能較基線(xiàn)水平無(wú)明顯變化。

房顫發(fā)生和維持的主要機(jī)制是心房重構(gòu)，包括電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)。結(jié)構(gòu)重構(gòu)不完全可逆，相較于電重構(gòu)，其在房顫中發(fā)揮更為重要的作用，主要表現(xiàn)為心房擴(kuò)張和間質(zhì)纖維化[2,4]。左房擴(kuò)張是房顫的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，LAD增大的患者更容易發(fā)生陣發(fā)性房顫[14]，而LAV較大的房顫患者更易出現(xiàn)復(fù)律后房顫復(fù)發(fā)[15]。心房間質(zhì)纖維化是結(jié)構(gòu)重構(gòu)的特征性改變，持續(xù)性房顫患者心房間質(zhì)纖維化程度明顯高于孤立性房顫患者[16]。本研究結(jié)果顯示：起搏3周后，快速心房起搏組左房容量明顯擴(kuò)張，擴(kuò)張程度是起搏前的近4倍；心房間質(zhì)纖維化明顯增加，約是假手術(shù)組的6倍。

MPO是由中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，其在房顫中發(fā)揮重要作用。它可以催化生成具有強(qiáng)氧化性的次氯酸，促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活化[6]。研究顯示：皮下注射血管緊張素Ⅱ 2周后，野生鼠可見(jiàn)心房MPO、MMP-2和MMP-9表達(dá)明顯增加，心房纖維化和房顫誘發(fā)率明顯增加；MPO基因缺陷鼠心房MPO、MMP-2和MMP-9則呈低水平，心房纖維化不明顯，幾乎不能誘發(fā)房顫；MPO基因缺陷鼠給予重組MPO干預(yù)后，可出現(xiàn)與血管緊張素Ⅱ干預(yù)野生鼠相同程度的MMP-2和MMP-9表達(dá)、心房纖維化和房顫誘發(fā)率[6]。另外，房顫患者心房和血漿MPO水平明顯高于非房顫患者[6]，且射頻消融術(shù)后患者高水平的MPO?？深A(yù)示術(shù)后房顫的復(fù)發(fā)[17]。本研究顯示，起搏3周后，快速心房起搏組兔心房MPO、MMP-2和MMP-9表達(dá)水平較假手術(shù)組均明顯增加，該模型心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)可能與此有關(guān)。

[1] Chugh SS, Havmoeller R, Narayanan K, et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a Global Burden of Disease 2010 Study[J]. Circulation, 2014, 129(8):837-847.[2] Nattel S, Harada M. Atrial remodeling and atrial fibrillation: recent advances and translational perspectives[J]. J Am Coll Cardiol, 2014, 63(22):2335-2345.

[3] January CT, Wann LS, Alpert JS, et al. 2014 AHA/ACC/HRS guideline for the management of patients with atrial fibrillation: a report of the American college of cardiology/American heart association task force on practice guidelines and the heart rhythm society[J]. Circulation, 2014, 130(23): e199-e267.

[4] Iwasaki YK, Nishida K, Kato T, et al. Atrial fibrillation pathophysiology: implications for management[J]. Circulation, 2011, 124(20):2264-2274.

[5] Moe GW, Laurent G, Doumanovskaia L, et al. Matrix metalloproteinase inhibition attenuates atrial remodeling and vulnerability to atrial fibrillation in a canine model of heart failure[J]. J Card Fail, 2008, 14(9):768-776.

[6] Rudolph V, Andrie RP, Rudolph TK, et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation[J]. Nat Med, 2010, 16(4):470-474.

[7] 宋學(xué)蓮, 齊曉勇, 黨 懿, 等. 阿托伐他汀對(duì)快速起搏兔房顫模型心房電重構(gòu)的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(4):623-627.

[8] Fu H, Liu C, Li J, et al. Impaired atrial electromechanical function and atrial fibrillation promotion in alloxan-induced diabetic rabbits[J]. Cardiol J, 2013, 20(1):59-67.

[9] Zhao Y, Gu TX, Zhang GW, et al. Losartan affects the substrate for atrial fibrillation maintenance in a rabbit model[J]. Cardiovasc Pathol, 2013, 22(5): 383-388.

[10]Nishida K, Michael G, Dobrev D, et al. Animal models for atrial fibrillation: clinical insights and scientific opportunities[J]. Europace, 2010, 12(2):160-172.

[11]Nakatani Y, Nishida K, Sakabe M, et al. Tranilast prevents atrial remodeling and development of atrial fibrillation in a canine model of atrial tachycardia and left ventricular dysfunction[J]. J Am Coll Cardiol, 2013, 61(5):582-588.

[12]Shiroshita-Takeshita A, Schram G, Lavoie J, et al. Effect of simvastatin and antioxidant vitamins on atrial fibrillation promotion by atrial-tachycardia remodeling in dogs[J]. Circulation, 2004, 110(16):2313-2319.

[13]He X, Gao X, Peng L, et al. Atrial fibrillation induces myocardial fibrosis through angiotensin II type 1 receptor-specific Arkadia-mediated downregulation of Smad7[J]. Circ Res, 2011, 108(2):164-175.

[14]Cui Q, Zhang W, Wang H, et al. Left and right atrial size and the occurrence predictors in patients with paroxysmal atrial fibrillation[J]. Int J Cardiol, 2008, 130(1):69-71.[15]Marchese P, Bursi F, Delle Donne G, et al. Indexed left atrial volume predicts the recurrence of non-valvular atrial fibrillation after successful cardioversion[J]. Eur J Echocardiogr, 2011, 12(3):214-221.

[16]Geuzebroek GS, van Amersfoorth SC, Hoogendijk MG, et al. Increased amount of atrial fibrosis in patients with atrial fibrillation secondary to mitral valve disease[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2012, 144(2):327-333.

[17]Li SB, Yang F, Jing L, et al. Myeloperoxidase and risk of recurrence of atrial fibrillation after catheter ablation[J]. J Investig Med, 2013, 61(4):722-727.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Expression of MPO, MMP-2 and MMP-9 in atrial myocardium of rabbit atrial fibrillation model

YANG Qian, RONG Chun-li, WANG Li-li, SONG Xue-lian, QI Xiao-yong

(DepartmentofCardiology,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China.E-mail:hbghxiaoyong_q@126.com)

AIM: To investigate the expression of myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in the atrial myocardium, and their potential effects on atrial structural remodeling in a rabbit atrial fibrillation (AF) model. METHODS: The sternotomy was performed and the pacing electrode was fixed to the left atria of 20 New Zealand white rabbits. The animals were randomly divided into 2 groups: rapid atrial pacing (RAP) group and sham group. The rabbits in RAP group were subjected to RAP for 3 weeks. The structure and function of the atria and ventricle were analyzed by echocardiography. Atrial burst stimulation was performed to test AF inducibility. The atrial fibrosis was evaluated by Masson trichrome-staining. The mRNA and protein levels of MPO, MMP-2 and MMP-9 were detected by RT-qPCR and Western blot. RESULTS: After 3 weeks of RAP, obvious left atrial enlargement and dysfunction were observed, but almost no change of left ventricular diameter and function was found in RAP group compared with sham group. AF inducibility, atrial interstitial fibrosis and the mRNA and protein levels of MPO, MMP-2 and MMP-9 were all significantly increased in RAP group compared with sham group. CONCLUSION: Obvious atrial structural remodeling is found in the rabbit AF model induced by sustained RAP, and the up-regulation of MPO, MMP-2 and MMP-9 may be the potential molecular mechanism of atrial structural remodeling.

Rapid atrial pacing; Atrial fibrillation; Myeloperoxidase; Matrix metalloproteinase

1000- 4718(2016)11- 1934- 05

2016- 06- 17

2016- 08- 22

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(No. 20160475)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.003

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