王木蘭，潘永明，金 敏，徐孝平，王德軍，馬全鑫，陳民利

(1.正大青春寶藥業(yè)有限公司，杭州 310023；2.浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

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研究報告

丹酚酸A對心肌缺血再灌注損傷大鼠心率變異性和心肌損傷的影響

王木蘭1，潘永明2，金 敏1，徐孝平2，王德軍2，馬全鑫2，陳民利2

(1.正大青春寶藥業(yè)有限公司，杭州 310023；2.浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

丹酚酸A；心肌缺血再灌注損傷；心率變異性；抗氧化；大鼠

缺血性心臟病是導致死亡和致殘的主要原因，常與急性冠脈栓塞有關。臨床上主要以溶栓或經(jīng)皮冠脈介入治療為主，但隨后再灌注誘發(fā)的心臟功能障礙包括心肌頓抑、心律失常和細胞凋亡，常被稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MI/RI)[1]。研究發(fā)現(xiàn)心臟植物神經(jīng)功能失衡與心源性猝死發(fā)生密切相關，而心率變異性(heart rate variability, HRV)作為預測心血管事件和心源性猝死發(fā)生的一種無創(chuàng)性指標已被臨床所證實[2]，能客觀反映交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)活性變化及其均衡性。丹酚酸A(salvianolic acid A，SAA)是丹參一種水溶性酚酸類化合物，具有顯著的抗氧化、抗血栓、抗肝纖維化、抗心肌缺血和神經(jīng)保護作用[3]。已有研究表明，丹酚酸A對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護作用[4-5]。但丹酚酸A對MI/RI模型大鼠心電圖和心率變異性的影響還尚未見報道。為此，本研究基于心電圖觀測和HRV分析技術，探討丹酚酸A對MI/RI大鼠HRV和心肌損傷的影響，為丹酚酸A改善心臟植物性神經(jīng)調控提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，SPF級，300～350 g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供【SCXK(滬)2012-0002】；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心屏障系統(tǒng)【SYXK(浙)2013-0184】，室溫為22±1℃，相對濕度為50%～70%，飼喂全價營養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水。

1.2 主要儀器及藥物試劑

1.3 分組

60只大鼠隨機分為偽手術(sham)組，心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)模型組，SAA 高、中、低(2、1、0.5 mg/kg)劑量組，陽性對照(2 mg/kg Diltiazem)組；每組10只。

1.4 方法

1.4.1 大鼠 MI/RI模型的制備

術前禁食12 h，以3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉(1.5 mL/kg)大鼠，仰臥位固定于手術臺，用針形電極刺入四肢皮下，無創(chuàng)生理信號遙測處理系統(tǒng)記錄大鼠II導聯(lián)心電圖，氣管插管，接ALC-V9呼吸機通氣(頻率為60次/min，呼吸比率為2∶1，潮氣量為30 mL/kg)。于胸骨左側第四肋間切口，開胸暴露心臟，在左心耳與肺動脈圓錐之間的左冠狀動脈(LAD)起始下方2～3 mm處，用6-0醫(yī)用無損傷帶線縫合針于左心耳下方進針，將縫合線穿于自制的冠脈阻斷塑料管。然后分別尾靜脈注射給予相應藥物，MI/RI模型組和偽手術組給予等體積5%葡萄糖氯化鈉注射液，給藥容量為5 mL/kg。除偽手術組縫合線空置、不拉緊縫合線外，其它組給藥10 min后拉緊縫合線，以塑料管球端壓迫結扎LAD 30 min后，放松結扎線，再灌注2 h。以左室前壁紫紺和同步心電圖II導聯(lián)J點(QRS波群與T波交點)增高為結扎成功標志，以左室前壁由紫紺逐漸紅潤和J點降低1/2為再灌注成功標志。

1.4.2 心電圖檢測和HRV分析

用EMKA無創(chuàng)生理信號遙測處理系統(tǒng)，監(jiān)測和記錄各組大鼠II導聯(lián)心電圖，采樣頻率為 1 000 Hz。然后用ECG-AUTO V3.2.0.2分析軟件，進行模塊化分析大鼠在結扎前、缺血期、再灌注5～120 min時的心電圖J點變化，計算在再灌注期J點總和(-J)、J點平均值(Average of J point)、J點的最低值(minimum of J point)和最大值(maximum of J point)。同時自動分析連續(xù) RR間期(RRI)，并手工剔除異常的RRI后，行HRV分析，時域指標包括RR間期的標準差(SDNN)，相鄰RR間期差值平方和的均方根(RMSSD)，HRV三角指數(shù)(tr.Ind)；按文獻[6]行Hamming快速分析RR間期功率譜，獲取極低頻波譜VLF(0.003～0.04 HZ)、低頻波譜LF(0.04～1Hz)、高頻波譜HF(1～3 Hz)和總功率(TP)，并對LF和HF進行標準化，計算[LFnu或HFnu=LF或 HF/(TP-VLF)×100]和平衡指數(shù)LF/HF。

1.4.3 生化指標測定

大鼠心肌缺血再灌注損傷2 h后，取腹主靜脈肝素抗凝血，在7020生化分析儀上測定血漿AST、LDH、CK和CK-MB活性，并在DU-800紫外/可見分光光度計上測定血漿SOD、MDA和NO水平，所有檢測均按試劑盒說明書進行。

1.4.4 伊文思藍和TTC雙重染色測定心肌梗死面積

按文獻方法[7]，從大鼠右心室注射5%伊文思藍1 mL；2 min后待大鼠鞏膜藍染后，立即從右心室注射10% 氯化鉀溶液使心臟停跳，迅速取出心臟，置入2%的瓊脂糖PBS緩沖液2 min后，剔除右心室和心耳等組織，放入-20℃冰箱中冷凍20 min后，將心肌每隔2 mm橫斷切成5片，置入1% TTC溶液中，37℃孵育15 min。伊文思藍染色區(qū)為非缺血區(qū)，TTC染色區(qū)為紅色的，表明缺血仍存活組織為危險區(qū)(AAR)，非TTC染色區(qū)為灰白色，表明為梗死區(qū)(IS)，行數(shù)碼拍照后，用Image-J圖像分析軟件進行面積分析，并計算梗死區(qū)(IS)占危險區(qū)(ARR)的百分比。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 SAA對MI/RI大鼠心電圖J點的影響

與偽手術組比，MI/RI模型大鼠心電圖J點冠脈結扎后明顯抬高(P<0.01)，再灌注后J點有所降低，但各時間點仍顯著高于偽手術組(P<0.01)，同時再灌注期-J值和J點平均值均顯著高于偽手術組(P<0.01)。與MI/RI模型組比，高、中、低劑量的SAA組和地爾硫組大鼠再灌注期心電圖J點曲線均低于MI/RI模型組(P<0.05,P<0.01)。地爾硫組和2 mg/kg SAA組均能顯著降低再灌注期大鼠J點最低值、-J值和J點平均值(P<0.05，P<0.01)；且0.5 mg/kg和1 mg/kg SAA組亦能顯著降低再灌注期大鼠-J值和J點平均值(P<0.05)(圖1)。

注：不同時間點J點(A)，缺血期J點(B)，再灌注期J點最低值(C)和J點最大值(D)，再灌注期總J點(E)和J點平均值(F)；與偽手術組比，ΔΔP<0.01；與MI/RI模型組比，*P<0.05，**P<0.01；。

2.2 SAA 對MI/RI大鼠心肌梗死的影響

注：心肌伊文思藍和TTC雙重染色結果(A)和IS/ARR(B)；與偽手術組比，ΔΔP<0.01；與MI/RI模型組比，*P<0.05，**P<0.01；。

2.3 SAA對MI/RI大鼠血漿心肌酶的影響

2.4 SAA對MI/RI大鼠HRV的影響

2.5 SAA對MI/RI大鼠SOD、MDA和NO含量的影響

注：AST(A)，LDH(B)，CK-MB(C)和CK(D)；與偽手術組比，ΔΔP<0.01；與MI/RI模型組比，*P<0.05，**P<0.01；。

注：RR間期(A)，SDNN(B)，RMSSD(C)，tr. Ind(D)，TP(E)，LFnu(F)，HFnu(G)和LF/HF(H)；與偽手術組比，ΔΔP<0.01；與MI/RI模型組比，*P<0.05，**P<0.01；。

注：SOD(A)，MDA(B)和 NO(C)；與偽手術組比，ΔΔP<0.01；與MI/RI模型組比，*P<0.05，**P<0.01；。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷可引起心肌細胞膜受損、細胞變性或壞死，使得細胞膜通透性增高，導致心肌細胞內的AST、LDH、CK等酶漏出并釋放入血，故心肌受損程度與CK、LDH等酶呈正相關[9]。另外，再灌注損傷時，由于大量的氧自由基產生和細胞膜脂質過氧化反應增強，進而影響心肌細胞膜的流動性，同時血管內皮細胞受損又可引起內源性NO合成減少，導致血中SOD活性和NO水平的下降，MDA含量的升高，這些可能是導致心肌缺血損傷的原因之一[10]。本研究結果顯示，丹酚酸A能明顯抑制心肌缺血再灌注損傷所致血漿AST、LDH、CK和CK-MB活性的升高，并能明顯提高血漿NO含量，降低血漿MDA含量，從而抑制心肌脂質過氧化，保護血管內皮和保護心肌的作用，這與減少心肌梗死面積的結果較為一致。

大量的研究表明，交感神經(jīng)活性的增強和/或迷走神經(jīng)活性的減弱，均會使HRV值降低，HRV是預測心血管事件發(fā)生的重要指標。HRV參數(shù)中SDNN可反映交感和迷走神經(jīng)張力的變化，與HRV三角指數(shù)tr. Ind一樣均可反映總的HRV變化；RMSSD反映迷走神經(jīng)張力，并與心率快速變化有關。頻域分析中HF與迷走神經(jīng)活性有關，LF與交感神經(jīng)活性有關，也有學者認為LF受交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的共同活動。TP反映HRV的總和；LF/HF比值反映了交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)系統(tǒng)的均衡性[2]。另外，氧化應激可加劇脂質過氧化反應，促進兒茶酚胺的釋放，激活NF-κB/促炎因子通路，導致內皮細胞和神經(jīng)元細胞壞死或凋亡等，使得心血管系統(tǒng)交感-副交感神經(jīng)系統(tǒng)失衡，甚至可引起心肌梗死或心肌缺血。同時，心肌缺血又可進一步激發(fā)交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，導致血漿和心臟中兒茶酚胺持續(xù)增高，最終導致HRV降低，大大增加了心肌梗死、心臟性猝死的發(fā)生率[11-12]。此外，臨床顯示冠心病病人存在低HRV和自主神經(jīng)功能失調；而HRV的降低與心肌缺血缺氧對化學感受器、心室壁機械的刺激引發(fā)心臟自主神經(jīng)調節(jié)失衡[13]。同樣本研究發(fā)現(xiàn)MI/RI模型大鼠SDNN、tr. Ind、TP、RMSSD和HFnu均降低顯著，LFnu和LF/HF比值均明顯升高，提示MI/RI模型大鼠出現(xiàn)明顯HRV降低，主要表現(xiàn)在交感神經(jīng)活性相對亢奮，迷走神經(jīng)活性則顯著抑制，這可能與氧化應激導致心臟植物神經(jīng)系統(tǒng)失衡，促發(fā)心肌缺血有關。相反，丹酚酸具有較強的抗氧化和抑制NF-κB/促炎因子通路的激活[14]，給予丹酚酸A后能明顯提高SDNN、tr.Ind、RMSSD、HFnu，降低LFnu和LF/HF比值，并減慢心率，表明丹酚酸A通過抗氧化作用，抑制自由基產生和炎性因子釋放，保護內皮細胞，同時擴張冠脈血管和降低心肌耗氧，提高迷走神經(jīng)活性，從而改善心臟自主神經(jīng)調控，減少心律失常的發(fā)生，這也可能是丹酚酸A抗心律失常發(fā)生的作用途徑之一[15]。

由此可見，丹酚酸可增加MI/RI大鼠的HRV，減少心肌梗死面積，其作用機制與丹酚酸A的抗氧化作用有關。

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Effects of salvianolic acid A on heart rate variability and myocardial injury in myocardial ischemia reperfusion injured rats

WANG Mu-lan1, PAN Yong-ming2, JIN Min1, XU Xiao-ping2,WANG De-jun2, MA Quan-xin2，CHEN Min-li2

(1. Chiatai Qingchun Bao Pharmaceutical Co., Ltd.Hangzhou 310023;2. Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053,China)

Objective To observe the effects of Salvianolic acid A (SAA) on heart rate variability (HRV) and myocardial injury in myocardial ischemia reperfusion injured (MI/RI) rats. Methods Sixty SD rats were divided into 6 groups randomly (n=10); the sham group, the MI/RI model group, high, middle and low-dose SAA group (2 mg/kg, 1 mg/kg and 0.5 mg/kg) and positive control group (2 mg/kg Diltiazem). The MI/RI model was made by ligating the left anterior descending branch of coronary artery in rats. Before ligation, the rats were intravenously administered with corresponding drugs. The changes of electrocardiogram of J point and HRV parameters were analyzed. At the end of reperfusion, the myocardial infarct size was measured by using Evans blue and tetrazolium chloride (TTC) double staining. The changes of plasma aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK) and its isoenzyme (CK-MB), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (no) content were also detected. Results Compared with MI/RI model group, SAA low, middle and high dose group and Diltiazem group were significantly reduced the total or average value of J point during reperfusion(P<0.05,P<0.01),reduced myocardial infarct size and inhibited the rising of AST, CK-MB and CK activities(P<0.05,P<0.01), and increased the standard deviation of RR intervals (SDNN), the root-mean-square of successive differences (RMSSD), HRV triangle index (tr. Ind) and high frequency (HFnu), reduced the low frequency (LFnu) and the ratio of LF/HF(P<0.05,P<0.01). Moreover, SAA could significantly increase the content of NO and reduce the content of MDA (P<0.05). Conclusion SAA could increase HRV and reduce myocardial infarction area in MI/RI rats, its mechanism of action maybe related with antioxidant effects.

Salvianolic acid A; Myocardial ischemia reperfusion injury; Heart rate variability; Anti-oxidation; Rats

浙江省中醫(yī)藥管理局重點項目(2015ZZ009)；浙江中醫(yī)藥大學比較醫(yī)學創(chuàng)新團隊( XTD201301)。

王木蘭(1983-)，女，工程師，研究方向：中藥藥理。E-mail:qcbwml@163.com。

陳民利(1963-)，女，教授，研究方向：實驗動物與比較醫(yī)學。E-mail: cmli991@ aliyun.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0024-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.005

2016-06-30