董雅潔，高維娟，錢 濤，盧鍇鋒，朱炎杰，謝亞芹

(1.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200；3.河北省人民醫(yī)院，石家莊 050051)

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研究報(bào)告

Bcl-2抑制劑對黃芪注射液減輕缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

董雅潔1，高維娟2，錢 濤3，盧鍇鋒1，朱炎杰1，謝亞芹1

(1.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200；3.河北省人民醫(yī)院，石家莊 050051)

目的探討黃芪注射液(AI)對Bcl-2抑制劑(TW-37)作用下的缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(H/R)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響。方法取原代培養(yǎng)8 d的胎鼠海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為6組：正常對照組、H/R組、AI組、AI溶劑對照組、Bcl-2抑制劑(TW-37)+ H/R組、TW-37+AI+H/R組。除正常對照組外，各組均進(jìn)行缺氧缺糖0.5 h，再于復(fù)氧復(fù)糖后七個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h、120 h)分別進(jìn)行指標(biāo)檢測。采用MTT法檢測細(xì)胞活性，western blot法和RT-PCR法檢測海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果與正常對照組比，除0 h外，H/R組海馬神經(jīng)元活性明顯降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白及Caspase-3 mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與H/R組相比，除0h外，AI組海馬神經(jīng)元活性明顯增高(P<0.05)，Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；而AI溶劑對照組、TW-37+ H/R組及TW-37+AI+H/R組則無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論黃芪注射液可通過激活Bcl-2抗凋亡機(jī)制增強(qiáng)H/R大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞活性、降低Caspase-3表達(dá)，Bcl-2是黃芪注射液抑制H/R大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的重要靶點(diǎn)之一。

黃芪注射液；Bcl-2抑制劑；缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖；海馬神經(jīng)元；細(xì)胞凋亡；Caspase-3

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是臨床缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)常見的病理生理過程，程序性細(xì)胞凋亡是神經(jīng)元發(fā)生損害的重要機(jī)制。Bcl-2基因家族是線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的調(diào)控基因之一，其中抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2與CIRI的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，“補(bǔ)藥之長”黃芪的精純制劑黃芪注射液(astragalus injection, AI)可抑制原代培養(yǎng)的缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation，H/R)大鼠胎鼠的海馬神經(jīng)元凋亡[3-4]，并初步推斷其抗凋亡作用與上調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)[5]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇特異性Bcl-2抑制劑TW-37，觀察黃芪注射液對Bcl-2抑制劑預(yù)處理后的缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Caspase-3表達(dá)改變，明確其發(fā)揮腦保護(hù)作用的具體靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級新生24～48 h SD乳大鼠，體重8～10 g，雌雄不限，購于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(冀)2013-1003】。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于承德醫(yī)學(xué)院屏障環(huán)境動(dòng)物室進(jìn)行【 SYXK(冀)2013-0026】。

1.1.2 主要試劑 NSE抗體(AB53025)，英國Abcam公司；GFAP抗體(BA0056)，武漢Boster公司；Caspase-3抗體(SC56050)，美國santa cruz公司；Bcl-2抑制劑(TW-37)，美國Selleck公司；免疫組化檢測試劑盒(SP9001)，北京ZSGB-BIO公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)，上海Beyotime公司；Caspase-3引物F：5′-ACTGGACTGTGGCAT TGAG-3′、R:5′-GAAACAATACATGGAATCTG-3′和β-actin引物F：5′-CAT CCTGCGTCTGGACCT-3′、R： 5′-TCAGGAGGAGCAATGATC TTG-3′，均由上海Sangon Biotech公司合成；RT-PCR試劑盒(RR001Q)，大連Takara Bio公司；黃芪注射液(批號Z51021776)，成都地奧九泓制藥廠。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(HERAcell 150i)，德國Heraeus公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Multiskan MK-3)，芬蘭Thermo Fisher公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-6C)，北京LIUYI公司；RT-PCR儀(PTC-100)，美國MJ Research公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬神經(jīng)元的分離與培養(yǎng) 無菌條件下，取24 h新生SD大鼠，浸于冰浴的75%乙醇1 min消毒，用顯微眼科鑷鈍性分離并夾取海馬組織，放入冰浴的盛有D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，剔除含有血管的軟腦膜，用體積分?jǐn)?shù)為0.125%的胰酶的同時(shí)充分消化，15 min后添加馬血清終止消化。根據(jù)海馬組織量加入適量有血清種植培養(yǎng)液，充分吹打，制成細(xì)胞懸液，用200目濾網(wǎng)過濾。經(jīng)胎盤藍(lán)計(jì)數(shù)后，接種在經(jīng)多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，放入37℃恒溫、5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。8 d后用H/R法建立腦缺血再灌注損傷模型。

1.2.2 免疫化學(xué)染色法檢測海馬神經(jīng)元純度 取經(jīng)冷丙酮固定的海馬神經(jīng)元，采用免疫組化SP法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白A(GFAP)表達(dá)，具體操作按照ZSGB-BIO免疫組化檢測試劑盒說明書進(jìn)行。分別加入一抗NSE多克隆抗體(1∶50稀釋)，GFAP多克隆抗體(1∶100稀釋)。對免疫組化陽性結(jié)果采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。陽性細(xì)胞計(jì)算方法：高倍鏡下計(jì)算3個(gè)非連續(xù)視野陽性數(shù)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及體外H/R模型的建立 將體外培養(yǎng)8 d的大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為6組：正常對照組、H/R組、AI組、AI溶劑對照組、TW-37組、TW-37+AI組。除正常對照組外，其余各組用預(yù)熱的無糖Earle’s液替代原培養(yǎng)基，并將其置于37℃、高純氮?dú)鉁叵渲信囵B(yǎng)0.5 h，隨后用正常無血清培養(yǎng)液，在飽和濕度培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中常規(guī)培養(yǎng)[6]。AI組于缺氧缺糖前10 min加入AI(終濃度為0.5 g/L)；AI溶劑對照組換為等量無菌去離子水(pH7.4)；TW-37組加入TW-37(終濃度為400 nmol/L)；TW-37+AI組缺氧缺糖前15 min加入TW-37，5 min后再加入等量AI，直至細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束。各組均于復(fù)氧復(fù)糖七個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h和120 h)分別進(jìn)行海馬神經(jīng)元活性、Caspase-3蛋白及其mRNA的表達(dá)的測定。

1.2.4 MTT法檢測海馬神經(jīng)元活性 用有血清培養(yǎng)基稀釋后配成細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板，各組均于復(fù)氧復(fù)糖后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h、120 h后，在各孔中加入10%孔內(nèi)培養(yǎng)液量的濃度為5 g/L的MTT溶液20 μL，37℃恒溫孵育4 h，棄去全部培養(yǎng)液，每孔加200 μL DMSO使結(jié)晶迅速溶解，放入酶標(biāo)儀中震蕩10 min，在492 nm處測定OD值。

1.2.4 Western blot法檢測海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá) 收集裂解的神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)蛋白，具體操作步驟按試劑盒和儀器的說明書執(zhí)行，并采用BCA法進(jìn)行定量。蛋白上樣量為30 μg，SDS-PAGE分離膠體積分?jǐn)?shù)12%，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，浸入5%Milk-TBST封閉液中封閉2 h，加入兔抗Caspase-3單克隆抗體(1∶500稀釋)，4℃振搖過夜后，用TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000稀釋)，室溫孵育1 h。洗膜后，用化學(xué)發(fā)光法顯影、定影。膠片掃描后，將顯影條帶輸入Quantity One 凝膠分析系統(tǒng)，進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元純度

NSE細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示：體外無血清原代培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)細(xì)胞，胞體飽滿，成錐體狀，邊緣有光暈，突起較多，末端彼此相互連接形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，NSE表達(dá)陽性細(xì)胞為棕黃色，高倍鏡下隨機(jī)選擇三個(gè)視野中統(tǒng)計(jì)陽性神經(jīng)細(xì)胞的比率，計(jì)算海馬神經(jīng)細(xì)胞純度為 (94.69±0.93) %，GFAP染色則為陰性，證明原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞中膠質(zhì)細(xì)胞較少(圖1)。

注：A：神經(jīng)元特異性烯醇化酶；B：GFAP膠質(zhì)纖維酸性蛋白A。

2.2 黃芪注射液及Bcl-2抑制劑對H/R大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞活性的影響

MTT結(jié)果顯示：與正常對照組相比，除0 h外，H/R組海馬神經(jīng)元活性均顯著降低(P<0.05)；而與H/R組細(xì)胞相比，除0 h外，AI組海馬神經(jīng)元活性明顯升高(P<0.05)，而AI溶劑對照組、TW-37組及TW-37+AI組與之相比則無顯著差異(P>0.05)(表1，圖2)。

表1 MTT法檢測Bcl-2抑制劑及黃芪注射液對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元活性的影響>Tab.1 The effects of Bcl-2 inhibitor and astragalus injection on the activity in the rat hippocampal neurons after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation detected by MTT

注：與正常對照組比，△P <0.05；與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組比，*P<0.05。

2.3 黃芪注射液及Bcl-2抑制劑對H/R大鼠海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示：與正常對照組相比，除0 h外，其余各時(shí)間點(diǎn)H/R組海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá)均顯著增高(P<0.05)，復(fù)氧復(fù)糖后24 h最高；與H/R組比，除0 h外，在其余各時(shí)間點(diǎn)AI組海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，而AI溶劑組、TW-37組及TW-37+AI組海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá)在各點(diǎn)與之相一致，無顯著差異 (P>0.05)(圖3)。

注：與正常對照組比，△P <0.05；與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組比，* P<0.05。

2.4 黃芪注射液及Bcl-2抑制劑對H/R大鼠海馬神經(jīng)元Caspase-3的mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示：與正常對照組比，除0 h外，其余各時(shí)間點(diǎn)H/R組海馬神經(jīng)元Caspase-3 mRNA的表達(dá)均顯著增加(P<0.05)，24h最高；與H/R組比，除0 h外，在其余各時(shí)間點(diǎn)AI組Caspase-3的mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，而AI溶劑組、TW-37組及TW-37+AI組的海馬神經(jīng)元Caspase-3的mRNA的表達(dá)在各點(diǎn)與之無明顯差別(P>0.05)(圖4)。

注：與正常對照組比，△P <0.05；與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組比，* P<0.05。

3 討論

缺血后再灌注過程中引起的神經(jīng)元的損傷是造成ICVD的發(fā)病率、致死率逐年上升的重要病理生理機(jī)制，而H/R是缺血再灌注損傷的一種最常見的表現(xiàn)形式[7-8]。我們前期的研究表明，H/R可通過激活JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)C-JUN氨基末端激酶-3(JNK3)的表達(dá)，并引發(fā)其下游底物Caspase-3表達(dá)增加，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)元凋亡[4,9]。

Bcl-2基因家族是JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的調(diào)控因素，作為代表的Bcl-2和Bax二者在功能上相互對立[10]。定位于線粒體外膜上的Bcl-2含有抗凋亡蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域BH4，決定其抗細(xì)胞凋亡功能的存在[11]；定位于胞漿中的 Bax的結(jié)構(gòu)中含有BH1、BH2和BH3三個(gè)結(jié)構(gòu)域，可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，兩蛋白間的比例決定是否發(fā)生細(xì)胞凋亡[12]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蛲鲂盘柎碳ず驜ax可轉(zhuǎn)位至線粒體膜上，Bax/Bax同源二聚體形成增多，Bcl-2抑制作用減弱，利于形成通透性PT孔道，釋放出細(xì)胞色素C等促凋亡因子，即刻與凋亡酶激活因子Apaf-1及dATP結(jié)合，形成復(fù)合體，從而啟動(dòng)下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活關(guān)鍵效應(yīng)蛋白酶Caspase-3，進(jìn)入凋亡進(jìn)程[13-15]。

抑制細(xì)胞凋亡是治療缺血性腦損傷的有效途徑之一，中藥制劑對CIRI神經(jīng)元凋亡干預(yù)作用的研究是目前研究的熱點(diǎn)。黃芪注射液是從黃芪中提取的有效成分精制而成，包括多種皂苷、多糖、氨基酸和微量元素等，每毫升注射液中所含有效成分相當(dāng)于含生藥2 g。大量研究發(fā)現(xiàn)，其在擴(kuò)血管、清除氧自由基，增加微循環(huán)灌注、增強(qiáng)免疫功能以及抗血栓等方面具有一定的藥理活性，可抑制神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，臨床應(yīng)用廣泛[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)選取對缺血缺氧最為敏感的胎大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，用H/R法模擬CIRI，并用黃芪注射液和Bcl-2抑制劑干預(yù)海馬神經(jīng)元缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：海馬神經(jīng)元經(jīng)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值明顯減低，細(xì)胞活性明顯下降，Caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯增加(P<0.05)，24 h最高。這證明海馬神經(jīng)元在H/R條件下凋亡信號觸發(fā)啟動(dòng)，Caspase-3表達(dá)升高，進(jìn)一步地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在24h Caspase-3的表達(dá)達(dá)到最高，分析原因可能是先通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，封閉Bax形成孔道的活性減弱，進(jìn)而活化Caspase-3，促使細(xì)胞凋亡[18-20]。在以后各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3表達(dá)量平穩(wěn)下降，推測可能是與磷酸化的Caspase-3半衰期密切相關(guān)[21]。而與同時(shí)間點(diǎn)H/R組相比，AI組海馬神經(jīng)元活性顯著升高(P<0.05)，而Caspase-3蛋白和mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，AI溶劑對照組、TW-37組及TW-37+AI組與之相比卻無顯著差異(P>0.05)，則提示Bcl-2抑制劑可拮抗黃芪注射液提高H/R大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞活性、降低Caspase-3表達(dá)的作用，黃芪注射液是以Bcl-2為靶點(diǎn)來抑制Caspase-3表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。且因?yàn)辄S芪注射液可使海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白表達(dá)降低，Caspase-3 mRNA的表達(dá)也相應(yīng)的下調(diào)，說明黃芪注射液是在轉(zhuǎn)錄水平抑制Caspase-3的表達(dá)。因此，推測黃芪注射液是以Bcl-2為靶點(diǎn)來抑制Caspase-3表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，這為缺血性腦血管病的靶向治療提供了理論依據(jù)。

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The influence of Bcl-2 inhibitor on the alleviation action of astragalus injection on apoptosis of hippocamal neurons of rats induced by hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation

DONG Ya-jie1, GAO Wei-juan2, QIAN Tao3, LU Kai-feng1,ZHU Yan-jie1, XIE Ya-qin1

(1.Department of Pathophysiology, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China;2.Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China;3.Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China)

Objective To observe the influence of Bcl-2 inhibitor (TW-37) on the alleviation action of astragalus injection (AI) on apoptosis of hippocamal neurons of rats induced by hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation (H/R). Methods The hippocampal neurons were isolated from fetal rat and cultured for eight days. The cells were randomly divided into six groups: normal control group, H/R group, AI group, AI solution group (sterile deionized water), TW-37 group, TW-37 with AI group. All groups were tested after 0 h, 0.5 h, 2 h, 6 h, 24 h, 72 h and 120 h since they were treated with hypoglycemia and reoxygenation after deprived of oxygen and glucose for 30 min except normal control group. The activity of hippocampal neurons were detected with MTT，The expression level of Caspase-3 was measured by western blotting, the expression of mRNA of Caspase-3 was tested by RT-PCR. Results Compared with normal control group, aside from 0 h group, the activity of neurons decreased obviously (P<0.05), moreover, the protein and mRNA expressions of Caspase-3 were enhanced significantly (P<0.05) in H/R groups. Compared with H/R group, the activity of neurons increased obviously in astragalus group (P<0.05), and the expressions of Caspase-3 protein and the expression of Caspase-3 mRNA in the AI groups decreased significantly (P<0.05) besides 0 h group; but there was no significant difference in both AI solution group、TW-37+ H/R and TW-37+AI+H/R group (P>0.05). Conclusions Astragalus injection to increase the neurons activity and decrease the expression level of Caspase-3 in hippocampal neurons of rat by activating the effect of anti-apoptosis of Bcl-2. Bcl-2 is one of the targets exerting the inhibitory action of astragalus injection on apoptosis of hippocamal neurons of rats induced by hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation.

Astragalus injection; Bcl-2 inhibitor; Hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation; Hippocamal neurons of rats; Apoptosis; Caspase-3

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(13272504D)；河北省普通高等學(xué)校高層次人才科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(GCC2014031)；河北省教育廳青年基金項(xiàng)目(Q2012002)；承德醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(Q201506)；河北省高校重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助(冀教高【2013】4號病理學(xué)與病理生理學(xué))。

董雅潔(1980-)，女，碩士生，研究方向：腦血管病發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)藥防治。Email： dyj9606@163.com。

高維娟(1966-)，女，教授，研究方向：腦血管病發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)藥防治。Email： gwj6088@163.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0011-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.003

2016-06-28