肖利龍，張鑫鑫，花 錦

（1.太原學(xué)院，山西太原 030032；2.山西出入境檢驗檢疫局，山西太原 030024）

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定蜂膠中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留量

肖利龍1，張鑫鑫2，花 錦2

（1.太原學(xué)院，山西太原 030032；2.山西出入境檢驗檢疫局，山西太原 030024）

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定蜂膠中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留的方法。結(jié)果表明：在1～30μg/ L范圍內(nèi)氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素3 種目標(biāo)物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997；氯霉素的檢出限為0.01μg/kg，甲砜霉素和氟甲砜霉素的檢出限均為0.05μg/kg；3 種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為67.3%～121%、變異系數(shù)為0.82%～12.2%。該方法準(zhǔn)確可靠、靈敏簡便，能夠滿足對蜂膠中氯霉素類藥物的殘留確證。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；氯霉素；甲砜霉素；氟甲砜霉素；蜂膠

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素為氯霉素類藥物，是預(yù)防和治療蜜蜂細(xì)菌性疾病的一類廣譜抗生素[1]。若蜂產(chǎn)品的原料收獲期使用氯霉素類藥物，將導(dǎo)致該類藥物大量殘留[2]。研究表明，氯霉素有較強(qiáng)的毒副作用，能夠?qū)е氯梭w再生障礙性貧血和嬰兒灰色綜合癥等疾病[3]。歐美等發(fā)達(dá)國家在其法規(guī)中規(guī)定食品中氯霉素不得檢出。為保證我國蜂膠的食用及外貿(mào)出口安全，建立一種準(zhǔn)確可靠、靈敏簡便的氯霉素類藥物殘留定性定量的方法是十分必要的。

目前，對于蜂膠中氯霉素的檢測報道很多[4-5]，而對多種氯霉素類藥物的同時測定，國內(nèi)外尚未見報道。本試驗采用HPLC-MS/MS法建立了蜂膠中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留的定性定量檢測方法。為縮短測定周期和消除基質(zhì)干擾，對萃取和洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化。本試驗方法靈敏準(zhǔn)確，簡便快速，重現(xiàn)性好，能夠滿足蜂膠進(jìn)出口檢測的要求。

1 試驗部分

1.1 材料與試劑

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品（CAP）、甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品（TAP）、氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品（FF）純度均≧99.9%，Dr Ehrenstorfer GmbH；乙酸乙酯、正己烷、無水硫酸鈉、醋酸鉛和乙醇均為分析純；水為超純水；甲醇為色譜純；25%氨水（1mL 氨水加入到3mL 純凈水中混勻）；堿化乙酸乙酯：乙酸乙酯/25%氨水=97/3（體積比）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜儀：Waters超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（ACQUITYTMUPLC/TQ Detector）；渦旋振蕩器；離心機(jī)：4 000r/min；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；Oasis HLB固相萃取小柱：500mg；10mL容量瓶；微孔濾膜：0.45μm；Millipore純水機(jī)。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別準(zhǔn)確稱取0.010 0g氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品，置于100mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，1～4℃冰箱保存。根據(jù)所需用流動相配制成一系列適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品處理

稱取2g蜂膠粉末（精確到0.01g）置于50mL具塞離心管中，加入5mL乙醇，超聲處理20min，使蜂膠徹底溶解。加入10mL 水于渦旋混合器上2 000r/min渦旋3min，加10mL4%醋酸鉛溶液，2 000r/min渦旋振蕩2min，靜置10min，然后3 000r/min離心5min，過濾，提取液置于50mL離心管中。樣品殘渣中再加入10mL4% 醋酸鉛溶液，2 000 r/min渦旋振蕩2min，靜置10min，3 000 r/min離心5min，過濾，提取液合并至50mL離心管中。合并提取溶液中加入20mL堿化乙酸乙酯，渦旋 1min，2 500r/min離心 3min，取上層乙酸乙酯溶液到20mL玻璃試管中并在50℃以下水浴減壓濃縮至近干。依次用4mL正己烷和4mL水將殘渣轉(zhuǎn)移至10mL具塞玻璃離心管中，并于2 000r/min渦旋振蕩1 min，然后2 000r/min離心3min。上層正己烷溶液棄去，再加4mL正己烷，重復(fù)上述操作。水層轉(zhuǎn)移至Oasis HLB固相萃取小柱，再用10mL水分次洗滌離心管，洗滌液過HLB小柱，棄去流出液，用6mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，加水定容至10mL，混勻，通過0.45μm濾膜（5.7），供HPLC-MS/MS測定。

1.3.3 色譜測定條件

色譜柱：Eclipace XDB-C18，5μm，150mm×4.6mm（i.d.）流動相梯度洗脫程序見表1。流速：800μL/min；進(jìn)樣量：8μL；色譜柱溫度：20℃。

表1 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

根據(jù)氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素三個目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)特征，將1μg/mL的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液選擇ESI負(fù)離子電離模式，進(jìn)行一級質(zhì)譜母離子全掃描。測定氯霉素、甲砜霉素、和氟甲砜霉素的分子離子分別為 m/ z 321.0，354.0和355.8，然后以測出的分子離子作為母離子，進(jìn)行子離子掃描，結(jié)果見圖1。在這種質(zhì)譜條件下，氯霉素主要產(chǎn)生m/z 257.0，121.0，175.9和152.0等子離子；甲砜霉素主要產(chǎn)生m/z290.0和184.8等子離子；氟甲砜霉素主要產(chǎn)生m/ z335.7和184.9等子離子。各目標(biāo)物選用離子豐度最強(qiáng)的碎片離子作為定量離子，豐度次強(qiáng)的碎片離子作為定性離子。為了得到最佳質(zhì)譜條件，對錐孔電壓和碰撞能量進(jìn)行配比優(yōu)化，從而使選定的母離子和子離子組成的特征離子的豐度和比例達(dá)到最佳，結(jié)果見表2。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素屬于弱極性化合物，為目標(biāo)物的色譜峰得到較好的分離效果，本試驗對 Symmety C18色譜柱和Eclipace XDB-C18色譜柱進(jìn)行比較。結(jié)果表明：以水-甲醇為流動相，采用梯度洗脫的方式，流速為800μL/min，在8min內(nèi)，氯霉素、甲砜霉素與氟甲砜霉素均得到了較好的分離。所得色譜圖見圖2。

表2 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的優(yōu)化質(zhì)譜條件

圖1 氯霉素（1）、甲砜霉素（2）和氟甲砜霉（3）子離子全掃描質(zhì)譜

圖2 蜂膠中氯霉素、甲砜霉素與氟甲砜霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量色譜圖

2.3 線性范圍和靈敏度

氯霉素、甲砜霉素與氟甲砜霉素為內(nèi)標(biāo)，配制0.1～50ng/ mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值 Y 為縱坐標(biāo)，工作溶液的質(zhì)量濃度ρ（μg/L）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，3種目標(biāo)物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997，符合要求。以信噪比（S/N）為5，確定為方法的檢出限，所得數(shù)據(jù)見表3。

Simultaneous Determination of Residues of ChlorampHenicol，hiampHenicol and Florfenicol in Propolis By Hplc-Ms/Ms

Xiao Li-long，Zhang Xin-xin，Hua Jin

A method has been developed for the determination of ChlorampHenicol，ThiampHenicol and Florfenicol in Propolis by High performance liquid chromatograpHy-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）.The calibration curve of target was linear in the range of 1～30μg/L with correlation coefficients not less than 0.997.The detection limits of this method were 0.01μg/ kg for chlorampHenicol and 0.03μg/kg for thiampHenicol and florfenicol.The average recoveries were oranged from 67.3%～129% with relative standard deviations of0.82%～15.2%.The method is simple，reliable，sensitive，accurate and was suitable for the determination and confirmation of chlorampHenicol，thiampHenicol and florfenicol residues in Propolis.

HPLC-MS/MS；ChlorampHenicol；ThiampHenicol；florfenicol；propolis

TS254.7

A

1003–6490（2016）09–0073–03

2016–08–18

肖利龍（1986—），男，山西太原人，助教，主要研究方向為食品科學(xué)。