楊 洋,孫文基,張 錦,周田妹,馬岑,朱忠良,翟西峰,張勇民

(1.西北大學 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室,陜西 西安 710069;2.西北大學 陜西省生物醫(yī)藥重點實驗室,陜西 西安 710069/法國巴黎第六大學分子化學研究所, 巴黎 75005;3.西安醫(yī)學院, 陜西 西安 710021)

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·生命科學·

秦艽不同提取物中3種環(huán)烯醚萜苷的含量測定

楊 洋1,2,孫文基1,2,張 錦3,周田妹3,馬岑3,朱忠良1,2,翟西峰3,張勇民1,2

(1.西北大學 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室,陜西 西安 710069;2.西北大學 陜西省生物醫(yī)藥重點實驗室,陜西 西安 710069/法國巴黎第六大學分子化學研究所, 巴黎 75005;3.西安醫(yī)學院, 陜西 西安 710021)

測定陜西隴縣和鳳縣地區(qū)10批秦艽藥材水提取物和80%乙醇提取物中龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷3種活性成分的含量。采用HPLC-ELSD法,Hedera C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm) 色譜柱,以甲醇-0.5 %乙酸為流動相,進行梯度洗脫分離檢測。結果顯示 80%乙醇提取的提取物量高于水提取的提取物量,以及醇提取物中龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的含量都比水提取物中的含量高,并且提取物中這3種活性成分以龍膽苦苷含量最高,落干酸次之,獐牙菜苦苷含量較低。表明通過80%的乙醇對秦艽藥材中化學成分提取的效果優(yōu)于水提取。

秦艽;含量測定;HPLC-ELSD;水;80%乙醇

秦艽(GentianamacrophyllaPall)為龍膽科龍膽屬多年生草本植物,是我國傳統(tǒng)常用中藥之一。秦艽藥用部位為根,性平,味苦、辛,具有祛風濕,清濕熱,止痹痛的功效,常用于風濕痹痛,中風半身不遂,筋脈拘攣等[1]?，F(xiàn)代科學研究發(fā)現(xiàn)秦艽具有明顯的保肝作用[2]、抗炎作用[3]和降低尿酸的作用[4]。秦艽在我國許多省份均有栽培,但以陜西、甘肅和青海地區(qū)所產秦艽為道地藥材。秦艽中的主要化學成分為環(huán)烯醚萜苷類[5],其中龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷經現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)具有較強和廣泛的藥理活性。龍膽苦苷具有治療結腸炎[6],促進肝臟對脂肪的代謝[7],以及保肝利膽[8]等作用;落干酸亦稱馬錢苷酸,具有治療動脈粥樣硬化的作用[10];獐牙菜苦苷具有保護心肌細胞[11],抑制膽汁淤積性肝損傷肝纖維化[12]和治療脂肪肝[13-14]等作用。因此,本實驗比較了兩種不同提取溶劑其提取物中這3種活性成分的含量,進而為陜西秦艽藥材中活性成分的研究和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

10批秦艽藥材(2015年10月采挖自陜西省隴縣和鳳縣)。對照品:龍膽苦苷(批號:20140520),落干酸(批號:20140728),獐牙菜苦苷(批號:20140521),均由中國食品藥品檢定研究院提供。水(雙蒸水),95%乙醇(分析純,天津市海濱科迪化學試劑有限公司),甲醇(色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司),乙酸(分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司)。

1.2 儀 器

高效液相色譜儀(Waters 2694型, Empower色譜工作站),蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech 2000ES型,Alltech公司)。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱:Hedera C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm);洗脫條件:甲醇(A)-0.5 %乙酸(B)[15],梯度洗脫:0 ～ 20 min, 20% A ～ 40% A;進樣量:5 μL;柱溫:25℃;流速:0.8 mL/min;蒸發(fā)光散射檢測:漂移管溫度為90.0℃,載氣流速為3.2 L/min;樣品采集時間20 min。

2.2 混合對照品溶液制備及線性關系的考察

分別精密稱取龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷3種對照品于容量瓶中,用甲醇溶解分別定容至刻度,然后將3種對照品溶液混合制備成混合對照品儲備溶液,混合液中龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的濃度分別為3 308.8μg·mL-1,861.6 μg·mL-1,895.5 μg·mL-1。以“2.1節(jié)下”色譜條件,按1 μL,2 μL,5 μL,10 μL,20 μL,連續(xù)進樣5次,所得色譜圖如圖1A。 記錄被測目標化合物色譜峰面積,以峰面積為橫坐標,對照品進樣量(μg)為縱坐標繪制標準曲線。

2.3 精密度試驗

精密吸取“2.2節(jié)下”混合對照品儲備液5 μL,連續(xù)進樣6次,記錄峰面積積分值,計算結果表明儀器精密度良好,以龍膽苦苷計算RSD為1.31% (n=6)。

2.4 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“2.2節(jié)下”混合對照品儲備液5 μL,每隔3 h進樣一次,進樣8次,記錄峰面積積分值,計算結果表明龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷在24 h內穩(wěn)定性良好,RSD分別為1.27%,1.05%,1.36% (n=8)。

2.5 重復性試驗

精密稱取同一批藥材粉末,每份藥材粉末為10 g,按“2.7節(jié)”方法制備秦艽80%乙醇提取物供試品溶液及水提取物供試品溶液各5份。按“2.2節(jié)”色譜條件進行測定,記錄峰面積積分值,以龍膽苦苷計算2種提取溶劑提取下的RSD值分別為0.9%,0.7%。

2.6 加樣回收率實驗

精密稱取已知龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷含量的藥材粉末10 g,精密加入龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷1.0 mg,0.8 mg,0.6 mg,如此平行5份,然后按“2.7節(jié)”方法制備80%乙醇提取物供試品溶液。按“2.2節(jié)”色譜條件進行測定,計算回收率。同時以相同方法,計算水提取方法下的回收率。結果顯示:80%乙醇提取方法下龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷平均回收率分別為 101.5% (RSD=1.73%), 105.6% (RSD=1.80%), 99.6% (RSD=1.67%);水提取方法下龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷平均回收率為 99.6% (RSD=1.73%), 98.8% (RSD=1.80%), 102.3% (RSD=1.67%)。

2.7 供試品溶液制備和測定

藥材提取 10批秦艽藥材,分別粉碎過100目(150μm)篩,用80%乙醇和水分別提取,其中料液比為1∶10 (100 g/1 000 mL),加熱沸騰回流提取各1h,過濾,如此再重復提取2次,合并濾液濃縮得浸膏,將浸膏干燥后,稱量并記錄數(shù)據。

溶液制備及測定 精密稱取10批秦艽藥材醇提取物和水提取物的干燥浸膏各50 mg于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,搖勻,過濾后,以“2.1節(jié)下”色譜條件分別進行測定,樣品檢測色譜圖如圖1B和圖1C。記錄峰面積,用外標法計算結果。

3 結果與分析

3.1 3種活性成份的線性方程的建立

根據實驗中色譜條件,測得對照品色譜圖如圖1A,龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的分別在3.3 ～ 66 μg,0.8 ～ 17.2 μg,0.9 ～ 17.9 μg范圍內呈良好線性,它們的線性回歸方程性、線性范圍、相關系數(shù)如表1。

表1 3種活性成分的線性回歸方程

Tab.2 Linear relationships of three active ingredients

組 分回歸方程相關系數(shù)R線性范圍/μg龍膽苦苷Y=6E?06X?575430991733～66落干酸Y=6E?07X+1260999508～172獐牙菜苦苷Y=1E?05X+4E?150999809～179

3.2 醇提取物和水提取物中3種活性成分的比較

根據實驗中色譜條件,測得秦艽藥材80%醇提取物的樣品色譜圖如圖1B,水提取物的樣品色譜圖如圖1C,并根據峰面積,以外標法通過線性方程計算得80%醇提取物和水提取物中龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的含量分別見表2和表3。 從表2和表3中的龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的數(shù)據比較,可以發(fā)現(xiàn)醇提取物中3種活性成份比水提取中高,且醇提取物的總提取物量高于水提取物。

A 混合標準品,B 80%乙醇提取物,C 水提取物;1 落干酸,2 獐牙菜苦苷,3 龍膽苦苷圖1 色譜圖Fig.1 Chromatograms

4 討 論

本實驗為了使被檢測的目標化合物與相鄰的雜質峰得到較好的分離,以及縮短分析時間,對流動相先進行了優(yōu)化。試驗中發(fā)現(xiàn)采用ELSD檢測,在以甲醇(A)-0.5%乙酸(B)梯度洗脫: 0 ～ 60 min, 20% A ～ 80% A,流速為1 mL/min分離時,龍膽苦苷色譜峰后再無其他明顯的色譜峰。但是，峰1和峰2與它們之間的色譜峰分離度差。因此,將流動相條件最終優(yōu)化成為甲醇(A)-0.5%乙酸(B)梯度洗脫: 0 ～ 20 min,20% A ～ 40% A,流速為0.8 mL/min, 結果被檢測目標物與相鄰的雜質峰分離良好,而且在相對較短時間即可完成檢測。

表2 水提取物中龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的含量(n=2)

Tab.2 Content of gentiopicroside, loganic acid, and swertiamarin in the water extract(n=2)

編號來源(水提)浸膏量/g 龍膽苦苷 落干酸 獐牙菜苦苷 浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%1鳳縣南星鎮(zhèn)寺溝村364628700545410132640272隴縣關山草原361026910647010212570423鳳縣三岔鎮(zhèn)孔家莊村334027300495650342950314隴縣東風鎮(zhèn)峪頭村35372674056857017283045鳳縣三岔鎮(zhèn)葦子坪村327128670246120642800436隴縣曹家灣鎮(zhèn)曹家山村313533440557120533270437鳳縣三岔鎮(zhèn)三官殿村320926190674930141860138隴縣八渡鎮(zhèn)桃園村387532660836400372900219隴縣八渡鎮(zhèn)西坡村3812229105893304326103410鳳縣三岔鎮(zhèn)酒鋪村3661277404752203422104

表3 80%醇提取物中龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的含量(n=2)

Tab.3 Content of gentiopicroside, loganic acid, and swertiamarin in the 80% ethanol extract(n=2)

編號來源(醇提)浸膏量/g 龍膽苦苷 落干酸 獐牙菜苦苷 浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%1鳳縣南星鎮(zhèn)寺溝村400330600426250232720212隴縣關山草原439129160357910312670373鳳縣三岔鎮(zhèn)孔家莊村388528990286240213460414隴縣東鳳鎮(zhèn)峪頭村3918322004797704342043

續(xù)表3

編號來源(醇提)浸膏量/g 龍膽苦苷 落干酸 獐牙菜苦苷 浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%浸膏中含量/%RSD%5鳳縣三岔鎮(zhèn)葦子坪村358829670339720393380376隴縣曹家灣鎮(zhèn)曹家山村362735370437460123840587鳳縣三岔鎮(zhèn)三官殿村436527170235640342050478隴縣八渡鎮(zhèn)桃園村439435850639140273350349隴縣八渡鎮(zhèn)西坡村4219400405395302937102910鳳縣三岔鎮(zhèn)酒鋪村42192866037923019272034

實驗比較了80%乙醇和水提取下,它們總提取物的量和提取物中龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的含量,同時也比較分析了兩種提取溶劑對這3種化合物提取的效果,并且對結果的差異性進行了兩樣本獨立性檢驗中的曼-惠特尼U檢驗,結果發(fā)現(xiàn)80%乙醇提取物的量明顯高于水提取的量,80%乙醇對龍膽苦苷、落干酸、獐牙菜苦苷的提取效果明顯優(yōu)于水的提取效果,而且這3種活性成分在80%乙醇提取物中的比例明顯高于水提取物中,且都存在顯著性差異(P≤ 0.05)。因此通過本實驗發(fā)現(xiàn)80%乙醇對秦艽藥材的提取效果優(yōu)于水提取。

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(編 輯 陳鐿文)

Simultaneous determination of three iridoid glycosides in the different extract ofGentianamacrophyllaPall

YANG Yang1,2, SUN Wenji1,2, ZHANG Jin3, ZHOU Tianmei3, MA Cen3,ZHU Zhongliang1,2, ZHAI Xifeng3, ZHANG Yongmin1,2

(1. Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China of Ministry of Education,Northwest University,Xi′an 710069, China; 2.Biomedicine Key Lab. of Shaanxi Province, Northwest University, Xi′an 710069,China/Institut Parisien de Chimie Moléculaire, CNRS UMR 8232, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, 4 Place Jussieu, 75005 Paris, France; 3.Xi′an Medical College, Xi′an 710021, China)

GentianamacrophyllaPallwas purchased from Longxian County in Shaanxi Province. This study aimed at determining the content of gentiopicroside, loganic acid, and swertiamarin in this herb water extract and 80% ethanol extract. The contents of gentiopicroside, loganic acid, and swertiamarin in the two extracts were determined by HPLC-ELSD equipped with a Hedera C18 (250 mm×4.6 mm, 5 microns) chromatographic column using a gradient elution with 0.5 % acetic acid and methanol. The results showed that the 80% ethanol total extract was higher than the water total extract, and the three kinds of active ingredient content in ethanol extract were higher than the water extract. In addition, the content of gentiopicroside was the highest, loganic acid was second and swertiamarin was the lowest. The study indicated that 80% ethanol as the extract solution ofGentianamacrophyllaPallwas better than water.

GentianamacrophyllaPall; Determination; HPLC-ELSD; Water; 80% ethanol

2016-03-11

陜西省“百人計劃”專家基金資助項目; 陜西省自然科學基金資助項目 (2014JM4125)；陜西省科學技術研究發(fā)展計劃基金資助項目(2015SF2-06 )

楊洋，男，陜西漢中人，西北大學博士生，從事中藥藥物化學研究。

張勇民，男，法國巴黎人，西北大學特聘教授，從事藥物化學研究。

R248.1

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-06-014