邵偉力，高艷菲，何建新，王 倩，陳 利，崔世忠

（1.天津工業(yè)大學(xué)紡織學(xué)院，天津 300387；2.中原工學(xué)院紡織學(xué)院，河南鄭州 450007；3.紡織服裝產(chǎn)業(yè)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450000）

取向TSF/p LLA靜電紡納米纖維氈的制備及其生物相容性

邵偉力1，2，3，高艷菲1，2，3，何建新2，3，王 倩2，3，陳 利1，崔世忠1，2，3

（1.天津工業(yè)大學(xué)紡織學(xué)院，天津 300387；2.中原工學(xué)院紡織學(xué)院，河南鄭州 450007；3.紡織服裝產(chǎn)業(yè)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450000）

利用靜電紡絲技術(shù)制備了取向的柞蠶絲素/左旋聚乳酸（TSF/PLLA）納米纖維氈。通過掃描電子顯微鏡（SEM）、X射線衍射分析（XRD）和拉伸測試分別對(duì)TSF/PLLA納米纖維的形貌、結(jié)晶結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能進(jìn)行了研究。將人成骨肉瘤細(xì)胞（MG-63）種植在TSF/PLLA納米纖維上，通過熒光顯微鏡分析和MTT（四甲基偶氮噻唑藍(lán)比色法），觀察細(xì)胞在材料表面的生長情況，評(píng)價(jià)納米纖維的生物學(xué)性能。結(jié)果表明，TSF含量為10％時(shí)，纖維直徑分布均勻，結(jié)晶度高。但是，TSF含量超過10％后，纖維直徑粗細(xì)不勻明顯，纖維的力學(xué)性能下降。與無規(guī)纖維氈相比，取向的納米纖維氈力學(xué)性能優(yōu)異，初始模量高，更能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞的生長行為影響大。

柞蠶絲素;聚左旋乳酸;取向納米纖維;生物學(xué)性能

1 引 言

支架材料的制備是組織工程研究的核心技術(shù)之一。由于單一材料很難滿足組織工程的支架材料的要求，由單一材料發(fā)展為復(fù)合材料已是大勢所趨，尤其是人工合成材料與天然材料之間的復(fù)合、改性是組織工程的支架材料的研究熱點(diǎn)［1-3］。

絲素蛋白是天然高分子纖維蛋白，可以用不同的溶劑或與其它的高聚物混合制備靜電紡絲用于制作工程支架［4-5］，然而目前的研究都是基于桑蠶絲素，而對(duì)柞蠶絲素的研究卻很少，王曉磊等使用水作為溶劑，通過靜電紡絲技術(shù)制備了形貌較好的柞蠶絲素納米纖維［6］。柞蠶絲素因?yàn)楹蠥rg-Gly-Asp三肽序列而被認(rèn)為是很有潛力的生物支架材料。聚左旋乳酸（Poly l-lactic，PLLA）是一種無毒、無刺激性生物高分子材料，具有良好的生物降解性，但也存在一定的缺陷，例如力學(xué)強(qiáng)度不高、高疏水性等導(dǎo)致細(xì)胞親和性差，使其應(yīng)用受到限制［7］。本文將TSF和PLLA進(jìn)行復(fù)合，實(shí)現(xiàn)材料的優(yōu)化設(shè)計(jì)，以制備生物相容性好的支架材料。

由于靜電紡納米纖維在結(jié)構(gòu)和尺寸上與天然細(xì)胞外基質(zhì)相似，因此可作為支架材料促進(jìn)細(xì)胞的黏附、生長、分化［8］，而且有研究表明納米纖維的取向?qū)?xì)胞的生長有很大的影響［9］，但是目前用于支架材料的納米纖維都是無規(guī)取向的纖維氈，導(dǎo)致其力學(xué)性能和二次成型性都受到了限制。本文通過靜電紡絲技術(shù)制備了取向的TSF/PLLA納米纖維氈，并在體外與人成骨肉瘤細(xì)胞（MG-63）復(fù)合培養(yǎng)，觀察其生物學(xué)性能以期能夠用于組織工程的支架材料。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 原材料

柞蠶繭（購自中國河南南陽）、聚左旋乳酸（PLLA，重均分子量為10萬，國藥集團(tuán)），MG-63細(xì)胞株（購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)）、MEM-EBSS培養(yǎng)基（購自美國Hyclone公司）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，購自美國Hyclone公司）、NEAA（非必需氨基酸，購自美國Hyclone公司）、PBS液（購自美國Hyclone公司）、若丹明-毒傘素（Sigma），所有試劑均為分析純。

2.2 TSF/p LLA紡絲液的制備

按照1：30的浴比將柞蠶蠶繭放入0.5％的碳酸鈉溶液中，煮沸脫膠三次，用去離子水沖洗，然后在室溫下干燥。將脫膠后的柞蠶絲置于9mol/L硫氰酸鋰溶液中50℃攪拌溶解2h，然后用截留分子量為8000～14000的透析袋透析3d。將透析后的溶液鼓風(fēng)濃縮，然后冷凍干燥制得純柞蠶絲素膜。將TSF和PLLA按照不同的質(zhì)量比混合后置于六氟異丙醇中，在25℃磁力攪拌器攪拌一周制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的紡絲溶液。

2.3 紡絲液導(dǎo)電率測試

在室溫條件下用DDS-11A數(shù)顯導(dǎo)電率儀測試紡絲液的導(dǎo)電率，所用電極為DJS-1型鉑黑電極，實(shí)際電導(dǎo)率常數(shù)J=0.996。

2.4 TSF/p LLA納米纖維氈的制備

圖1為TSF/PLLA納米纖維氈紡絲裝置示意圖，紡絲電壓20k V，紡絲距離18cm，紡絲流量0.3m L/h，無規(guī)的納米纖維氈采用鋁箔收，取向的納米纖維氈利用旋轉(zhuǎn)滾筒裝置接收，轉(zhuǎn)速為1000r/min。

圖1 TSF/PLLA納米纖維氈靜電紡絲裝置示意圖Fig.1 Schematic of TSF/PLLA nanofibers electrospinning device

2.5 掃描電鏡分析

采用JSM-6360型掃描電子顯微鏡觀察納米纖維表面形貌。測試條件：恒溫20℃，相對(duì)濕度65％，加速電壓15k V，測試前樣品進(jìn)行鍍金處理。

2.6 X射線衍射分析

纖維樣品的X射線衍射分析在D/max-2550PC 18k W轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀上測定。樣品安放在玻璃的樣品架上，在穩(wěn)定條件下分析。測試條件：Ni濾波，Cu靶Kα射線，管壓40k V，管流40m A，掃描速度2°/min，從5°到50°。

2.7 力學(xué)性能測試

用美國Instron3365電子強(qiáng)力儀進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測試。用于測試的纖維氈樣品長、寬分別30mm、10mm，厚度約為0.15mm～0.30mm。試樣夾持長度10mm，拉伸速度10mm/min，初始張力為0.2c N。每試樣測定10次，最后取平均值。

2.8 細(xì)胞培養(yǎng)

在37℃，5％CO2，95％濕度條件下無菌培養(yǎng)MG-63成骨細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)MG-63細(xì)胞形成單層，鋪滿培養(yǎng)瓶底80％以上時(shí)，進(jìn)行傳代。用PBS液清洗培養(yǎng)瓶三次，加入胰酶-EDTA消化3分鐘，1000r/min離心5min，棄上清夜加入含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，吹打成均勻細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×l04/m1于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。

2.9 細(xì)胞與材料的復(fù)合

先將滅菌后的材料放于24孔板中，浸泡于含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基24小時(shí)，再接種MG-63細(xì)胞于孔板中。然后根據(jù)分組需要調(diào)整細(xì)胞密度，將密度為5×104個(gè)/細(xì)胞懸液加入到相應(yīng)的24孔板，每孔加入1ml，進(jìn)行細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及MTT（四甲基偶氮噻唑藍(lán)比色）測定。

2.10 熒光顯微鏡測試

對(duì)培養(yǎng)7d的細(xì)胞支架材料進(jìn)行熒光染色分析，用4％的多聚甲醛室溫固定30min后PBS緩沖液稀3次，每次10min。在0.2％Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）溶液處理細(xì)胞以獲得通透性細(xì)胞，然后用若丹明-毒傘素和DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）分別對(duì)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞核進(jìn)行染色，最后在熒光顯微鏡（尼康E200）下觀察。

2.11 MTT法測定細(xì)胞在材料上的增殖情況

首先將各組材料放入24孔培養(yǎng)板中，用含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基浸泡24h，然后調(diào)整MG-63細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種于放有不同材料的培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入培養(yǎng)液lml，然后分別于第1、4、7d各取三組材料加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)后，棄上清液，每孔加入420μL（DMSO（二甲基亞砜）），振蕩10分鐘。吸取每孔液體100μL到96孔平底板內(nèi)，選擇492nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值，記錄并分析結(jié)果。

2.12 統(tǒng)計(jì)分析

有關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，組內(nèi)數(shù)據(jù)資料采用重復(fù)測量方差分析，兩組間結(jié)果分析采用t檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 TSF/PLLA納米纖維氈的掃描電鏡圖片（a）PLLA+10％TSF無規(guī);（b）pure PLLA;（c）PLLA+10％TSF;（d）PLLA+15％TSF;（e）PLLA+20％TSFFig.2 SEM of TSF/PLLA nanofibers （a）PLLA+10％TSF random;（b）pure PLLA;（c）PLLA+10％TSF;（d）PLLA+15％TSF;（e）PLLA+20％TSF

3 結(jié)果分析與討論

3.1 TSF/p LLA納米纖維氈的形貌分析

圖2顯示了不同TSF含量的靜電紡TSF/PLLA納米纖維的SEM照片。圖3為TSF/PLLA納米纖維直徑分布與導(dǎo)電率曲線圖。添加10％TSF的PLLA紡絲液顯示了良好的靜電紡的可紡性，無規(guī)和取向的納米纖維均呈現(xiàn)稍扁的形貌，而且具有均勻的直徑分布，圖2b、c、d、e均顯示納米纖維具有較好的取向，添加少量的TSF（不超過10％）后，納米纖維的直徑變化明顯，從899nm直接減小到593nm，其原因是TSF大分子鏈中含有較多的極性側(cè)基，添加后紡絲溶液的導(dǎo)電率得到提高，在靜電紡絲過程中納米纖維得到了充分拉伸，纖維直徑變得更細(xì)。但TSF的添加量超過10％時(shí)，納米纖維出現(xiàn)了明顯的粗細(xì)節(jié)，直徑分布不勻顯著增加，這是因?yàn)殡S著TSF含量的不斷提高，TSF與PLLA相容性逐漸變差（見之后結(jié)果分析），而且TSF大分子之間容易團(tuán)聚，這些因素會(huì)導(dǎo)致在靜電紡絲時(shí)泰勒錐非常不穩(wěn)定，纖維直徑不勻性變大。

圖3 TSF/PLLA納米纖維氈直徑分布與導(dǎo)電率曲線圖Fig.3 Diameter distribution and Conductivity curve of TSF/PLLA nanofibers

3.2 X-射線衍射分析

圖4所示為不同絲素含量靜電紡TSF/PLLA納米纖維氈的X衍射分析結(jié)果。從圖可以看出純的PLLA納米纖維氈和含有10％TSF的TSF/PLLA納米纖維氈的峰形均較尖銳，且強(qiáng)度較高，結(jié)晶度較大，這是因?yàn)镻LLA和TSF分子之間形成了氫鍵結(jié)合，提高了分子間的規(guī)整性。兩者峰形一致說明紡絲過程對(duì)晶型及結(jié)晶度均沒有影響，但是當(dāng)TSF的含量達(dá)到15％時(shí)，在2θ=10.64°附近出現(xiàn)了較弱的歸屬于絲素I的特征衍射峰，說明在TSF濃度較高（超過10％達(dá)到15％）時(shí)，紡絲液中TSF和PLLA的相容性較差。

圖4 TSF/PLLA納米纖維氈的衍射圖譜Fig.4 X-ray diffraction patterns of TSF/PLLA nanofibers

3.3 力學(xué)性能

TSF/PLLA納米纖維氈應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖5所示，取向的納米纖維氈均展現(xiàn)出較高的初始模量，純PLLA取向納米纖維氈?jǐn)嗔焉扉L最大，達(dá)到100％左右。添加少量的TSF后，TSF/PLLA納米纖維氈的強(qiáng)度得到了較大改善，這是因?yàn)樯倭康腡SF大分子與PLLA充分混合后，TSF主鏈上的活潑氫原子與PLA主鏈上氧原子的孤對(duì)電子形成了氫鍵。TSF含量為10％時(shí)，取向的TSF/PLLA納米纖維氈力學(xué)性能較好，初始模量變大，斷裂強(qiáng)度達(dá)到1.96MPa，斷裂伸長率為79.8％;但是當(dāng)TSF含量超過10％后，取向TSF/PLLA納米纖維氈的力學(xué)性能明顯下降，特別是當(dāng)添加20％的TSF時(shí)，取向納米纖維氈的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率分別只有1.06MPa、19.3％左右。

圖5 TSF/PLLA納米纖維氈的應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.5 Stress-stain curve of TSF/PLLA nanofibers

3.4 生物學(xué)表征

圖6為MG-63細(xì)胞在純PLLA納米纖維氈和TSF/PLLA納米纖維氈上培養(yǎng)7 d后的熒光顯微鏡照片。照片中細(xì)胞肌動(dòng)蛋白顯示為紅色，細(xì)胞核顯示為藍(lán)色，可以看出添加TSF后細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，說明添加TSF使得納米纖維材料的生物相容性得到改善，誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂增殖能力提高，這是因?yàn)門SF中富含R-G-D三肽序列，這種序列可用作生物識(shí)別，更有利于細(xì)胞的粘附和增殖［10］。取向的納米纖維氈表面不僅細(xì)胞的數(shù)量增多，細(xì)胞分布較均勻，而且細(xì)胞生長排列得很規(guī)整，和纖維取向是一致的，說明所制備的納米纖維氈的取向性對(duì)細(xì)胞的生長行為有很大影響，這也提示材料的表面結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞生長有一定影響。

圖7為不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞在材料上的增殖曲線，MTT檢測是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，OD值的大小代表細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞活性。從圖中可以看出，隨著時(shí)間的延長，各組的OD值整體趨勢增大，說明細(xì)胞數(shù)目在不斷增加，不同的時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），添加少量TSF后發(fā)現(xiàn)OD值明顯升高，說明MG-63細(xì)胞在含有TSF的納米纖維氈上的生長和增殖比在純的PLLA納米纖維氈上要好，通過加入TSF改善了PLLA的細(xì)胞相容性。但是TSF的添加量過多（超過10％）時(shí)TSF/PLLA納米纖維氈細(xì)胞相容性有所下降，這可能歸因于TSF濃度較高時(shí)所形成的納米纖維氈直徑分布不均勻所致，有研究［11］表明納米纖維的結(jié)構(gòu)、孔隙率對(duì)于細(xì)胞的粘附、增殖和分化影響很大。此外，還發(fā)現(xiàn)取向的TSF/ PLLA納米纖維氈較無規(guī)的纖維氈能夠更好地促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖。

圖6 細(xì)胞在TSF/PLLA纖維氈表面生長的熒光顯微鏡照片（a）Pure PLLA;（b）PLLA+10％TSF（無規(guī)）;（c）PLLA+10％TSF（取向）Fig.6 Fluorescent microscope picture of cells on TSF/PLLA nanofibers

圖7 不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞在材料上的增殖曲線Fig.7 Growth curve of cells on the material at different time points

4 結(jié) 論

1.本研究成功制備了取向的TSF/PLLA納米纖維氈，添加10％TSF后，納米纖維直徑變小，分布均勻，結(jié)晶度高。取向的TSF/PLLA納米纖維氈?jǐn)嗔褟?qiáng)度達(dá)到1.96MPa，斷裂伸長率為79.8％。當(dāng)添加的TSF含量超過10％后，纖維直徑不勻性增加，力學(xué)性能下降。

2.與無規(guī)的納米纖維氈相比，取向的納米纖維氈具有更優(yōu)異的力學(xué)性能，初始模量高，生物相容性好，更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而且細(xì)胞在材料表面的生長排列方向和納米纖維的取向是一致的，這對(duì)以后我們研究設(shè)計(jì)組織工程支架材料具有很積極的參考價(jià)值。

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preparation and Biological properties of Aligned TSF/p LLA Electrospun Nanofibers

SHAO Wei-li1，2，3，GAO Yan-fei1，2，3，HE Jian-xin2，3，WANG Qian2，3，CHEN Li1，CUI Shi-zhong1，2，3
（1.School of Textiles，Tianjin polytechnic University，Tianjin 300387，China; 2.School of Textiles，Zhongyuan University of Technology，Zhengzhou 450007，China; 3.Collaborative Innovation Center of Textile and Garment Industry，Henan province，Zhengzhou 450007，China）

Aligned TSF（tussah silk fibroin）/Poly l-lactic（PLLA）electrospun nanofibers were successfully fabricated by electrospinning technique.The morphology，secondary structure and mechanical property of the TSF/PLLA nanofibers were characterized by scanning electronic microscope，X-ray diffraction（XRD）and tensile test.Human osteosarcoma cells（MG-63）was cultured in vitro to study the biological properties of TSF/PLLA nanofibers，which was characterized by fluorescence microscope test and four methyl azo thiazole blue colorimetric（MTT）.The results indicated that TSF/PLLA nanofibers had the uniform diameter distribution and high crystallinity when TSF content was 10％.However，the diameters of the fibers were less even and the mechanical properties decreased when the content of TSF was over 10％.Compared with random fiber mat，aligned TSF/PLLA nanofibers showed high mechanical performance and high initial modulus，and we found that aligned TSF/PLLA nanofibers could enhance cell proliferation and had a great effect on cell growth behavior.

tussah silk fibroin（TSF）;poly l-lactic（PLLA）;aligned nanofibers;biological properties

TS102.1

A

10.14136/j.cnki.issn 1673-2812.2016.03.010

1673-2812（2016）03-0384-06

2014-10-20;

2015-02-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（51203196，U1204510）;NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金資助項(xiàng)目（U1204510）;河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)資助項(xiàng)目（14A540003，14A540006）;鄭州市普通科技攻關(guān)資助項(xiàng)目（141PPTGG400）

邵偉力（1987-），男，博士研究生，研究方向?yàn)榧徔棌?fù)合材料。E-mail：weilishao@163.com。

何建新，男，教授，主要從事靜電紡納米復(fù)合材料研究。E-mail：hejianxin 771117@163.com。