馬宗慧，郁 陽(yáng)，王國(guó)凱，劉勁松，張培良，王 剛

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

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·方藥研究·

亳芍內(nèi)生真菌的分離與鑒定

馬宗慧，郁 陽(yáng)，王國(guó)凱，劉勁松，張培良，王 剛

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

目的 對(duì)亳芍內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定，旨在豐富其內(nèi)生真菌資源種類。方法 利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行亳芍內(nèi)生真菌的分離、尖端菌絲挑取法進(jìn)行純化，利用分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果 從亳芍中分離出24株內(nèi)生真菌，初步鑒定為9屬13種，分別為Fusarium，Talaromyces，Dactylonectria，Myxocephala，Llyonectria，Penicillium，Alternaria，Rhexocercosporidium，Lopadostoma。主要為鐮刀屬(占33%)。結(jié)論 本研究首次從亳芍中分離出內(nèi)生真菌，呈多樣性分布，豐富了芍藥內(nèi)生真菌的種質(zhì)資源。

亳芍；內(nèi)生真菌；分離；鑒定

內(nèi)生真菌是一類與植物互利共生的微生物，研究表明其可促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆能力，提高植物的藥用性能。研究證實(shí)藥用植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生種類豐富的生物活性成分，可作為一種新型的天然藥物資源[1-2]，對(duì)其進(jìn)行深入研究已成為天然活性成分開(kāi)發(fā)與應(yīng)用的重要途徑[3]。

亳芍為芍藥科植物芍藥(PaeonialactifloraPall)或其變種毛果芍藥(P.lactifloravartrichocarpa)栽培品的根[4]。其性微寒，味苦酸，有養(yǎng)血柔肝、斂陰收汗之功效，民間常用于治療胸肋疼痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)前腹痛、盜汗等[5]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)于亳芍的研究較多[6-8]，但未見(jiàn)對(duì)其內(nèi)生真菌的研究。本研究首次從亳芍中分離鑒定出內(nèi)生真菌，旨在揭示亳芍內(nèi)生真菌的多樣性，為增加亳芍繁育以及為進(jìn)一步尋找內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 亳芍藥材于2015年11月采自安徽省亳州市，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為芍藥科芍藥屬芍藥(PaeonialactifloraPall)。分離純化培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基。配制方法：稱取3.0 g馬鈴薯浸粉、20.0 g葡萄糖、14.0 g瓊脂粉，加蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌備用。

1.2 儀器 SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠制造；SPT-P35C智能生化培養(yǎng)箱：合肥華利科學(xué)器材有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱：上海一恒儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；T-Gradient Thermo-block PCR儀：德國(guó)Biometra公司；G-BOX凝膠成像系統(tǒng)Gene-Snap：英國(guó)Syngene公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；引物為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1(5′-TCCGTAGGTGA-ACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)：均由上海生工生物工程股份有限公司定制。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化 取無(wú)病害新鮮亳芍根莖，沖洗干凈后，去其須根，用濾紙吸干表面水分。表面常規(guī)滅菌：75%乙醇滅菌1～2 min，再用5%的次氯酸鈉滅菌3～5 min，然后用75%乙醇清洗30 s，最后用無(wú)菌水沖洗(3～5次)干凈后晾干。同時(shí)取最后一次清洗的無(wú)菌水(200 μL)均勻涂布于PDA表面，平行3份，為空白對(duì)照。28 ℃避光、倒置培養(yǎng)3～5 d，要求對(duì)照組平板無(wú)菌落生成以驗(yàn)證表面滅菌徹底性。以無(wú)菌刀片將根切成適當(dāng)大小的小段，每個(gè)PDA平板接種3～5塊/段，平行3份，28 ℃避光、倒置培養(yǎng)5～15 d。觀察根段切口處菌落形態(tài)、顏色差異及長(zhǎng)出時(shí)間的不同，用無(wú)菌接種環(huán)挑取菌落邊緣的菌絲接種于新的PDA平板，培養(yǎng)3～5代，確保所得菌株為純化菌株。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 參考文獻(xiàn)[9]的方法，將保存的菌株復(fù)壯在PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)5～10 d，觀察并記錄菌落的特征。根據(jù)分離出的真菌菌落邊緣形狀、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)類型以及孢子的形態(tài)、顏色、大小等進(jìn)行初步鑒定分類。

2.3 菌株的分子鑒定

2.3.1 內(nèi)生真菌DNA的提取 將已純化的菌株接種于PDA平板上，28 ℃遮光培養(yǎng)5～7 d。挑取菌絲體置于無(wú)菌研缽，液氮研磨。參照真菌基因組DNA小量提取試劑盒步驟進(jìn)行操作，得到提取出DNA溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增真菌的rDNA-ITS序列引物如下，上游引物為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，配制PCR反應(yīng)體系50 μL。

2.3.3 PCR擴(kuò)增程序(每份擴(kuò)增產(chǎn)物平行3份) 預(yù)變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，1 min；復(fù)性49 ℃，1 min；延伸72 ℃，2 min；共30個(gè)循環(huán)，之后延伸72 ℃，10 min。在1%瓊脂糖凝膠中電泳，以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，1×TAE[三羥甲基氨基甲烷(Tris base)、乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)組成的緩沖液]電泳緩沖液，以100 V電壓電泳約40 min，溴化乙錠(Ethidium bromide，EB)染色5 min，由凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照。

2.3.4 內(nèi)生真菌rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，采用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。其中系統(tǒng)進(jìn)化矩陣按Kimura 2-Parameter模型估算，采用鄰接法聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展值分析評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，再結(jié)合序列對(duì)比，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果

3.1 內(nèi)生真菌的分離 通過(guò)組織分離法從亳芍中分離得到24株內(nèi)生真菌，分屬于9屬13種。Fusarium8株，Talaromyces1株，Dactylonectria3株，Myxocephala1株，Llyonectria1株，Penicillium2株，Alternaria5株，Rhexocercosporidium2株，Lopadostoma1株。

3.2 形態(tài)學(xué)鑒定 內(nèi)生真菌通過(guò)菌落特征比對(duì)和顯微觀察，SYJ07菌落初期白色逐漸為桃紅色，棉絮狀，菌絲密集，表面潮濕，氣生菌絲發(fā)達(dá)，有隔。分生孢子著生于分生孢子梗上，小型分生孢子呈卵圓形或紡錘形，大型分生孢子呈鐮刀形，有3～4隔；SY14菌落致密，粉狀，墨綠色或灰綠色菌絲體有隔。分生孢子單孢，圓形或卵圓形，光滑。分生孢子梗和孢子無(wú)色，分生孢子梗掃帚狀，末端生小梗，小梗直立。SY15褐綠色絨狀菌落，氣生菌絲不發(fā)達(dá)。菌絲有隔，帶淡褐色。分生孢子梗較短，單生或簇，與營(yíng)養(yǎng)菌絲幾乎無(wú)區(qū)別。分生孢子為多細(xì)胞，倒棒狀，頂端延長(zhǎng)成喙?fàn)?，淡褐色，有壁磚狀分隔，暗褐色，成鏈生長(zhǎng)，孢子的形態(tài)及大小不規(guī)律。根據(jù)魏景超[9]編著的《真菌鑒定手冊(cè)》，將SYG07鑒定為鐮刀菌屬(Fusarium)屬，SY14為青霉屬(Penicillium)，SY15為交鏈孢霉屬(Alternaria)。分離所得的SYJ07、SY14、SY15內(nèi)生真菌的形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 內(nèi)生真菌SY07、SY14、SY15及其顯微結(jié)構(gòu)

3.3 分子生物學(xué)鑒定

3.3.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 提取分離得到內(nèi)生真菌的DNA，rDNA-ITS序列擴(kuò)增后，在550 bp左右處出現(xiàn)一條單一明亮的條帶。內(nèi)生真菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

注：1.SYG01；2.SYG02；3.SYG03；4.SYG04；5.SYG05；6.SYG06；7.SYJ07；8.SYG08；9.SYG09；10.SYG10；11.SYG11；12.SYG12；13.SY13；14.SY14；15.SY15；16.SY16；17.SY17；18.SY18；19.SYG19；20.SYG20；21.SYG21；22.SYG22；23.SYG23；24.SYG24。

圖2 內(nèi)生真菌16 S rDNA的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

3.3.2 rDNA-ITS序列比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 將測(cè)序結(jié)果與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)生真菌分子鑒定序列比對(duì)表

根據(jù)菌落特征并結(jié)合其分子序列合并為13個(gè)形態(tài)型，對(duì)這些形態(tài)型菌株的5.8 S和ITS序列與Genbank中最相近的參考序列進(jìn)行比對(duì)，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。見(jiàn)圖3。

由表1和圖3可知，內(nèi)生真菌分布在9個(gè)屬中，其種類資源廣泛。主要分布在鐮刀菌屬中，占其總數(shù)的33%，為其優(yōu)勢(shì)種群。

4 討論

植物內(nèi)生真菌不但能誘導(dǎo)和促進(jìn)藥材有效成分的合成和積累，而且能產(chǎn)生具有特殊生物活性的成分，甚至產(chǎn)生與藥材相同或相似的活性成分[10-13]。植物內(nèi)生菌及其次生代謝成分通常具有良好的生理活性。對(duì)內(nèi)生真菌的研究已成為醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

本研究首次對(duì)亳芍內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果顯示其內(nèi)生真菌主要是鐮刀菌屬，為其優(yōu)勢(shì)種群，占33%，鐮刀菌屬?gòu)V泛分布于自然界中，能產(chǎn)生植物刺激素(赤霉素)，可使農(nóng)作物增產(chǎn)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[14]；鏈格孢屬占21%，雖然可能會(huì)危害農(nóng)林作物，但也是一種有應(yīng)用潛力的真菌資源，一些鏈格孢次生代謝物具有殺蟲(chóng)、殺菌和殺原生生物活性[15]；青霉屬(占2%)等也是中藥的真菌屬，具有極其廣泛的醫(yī)藥用途[16]。本研究拓展了亳芍內(nèi)生真菌的種類資源，為進(jìn)一步尋找內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物提供依據(jù)。由于內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物活性與不同的宿主植物密切相關(guān)，本研究中分離所得的內(nèi)生真菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的生理活性有待于后續(xù)深入研究。

圖3 鄰接法構(gòu)建內(nèi)生真菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

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Isolation and Identification of Endophytic Fungi in Bozhou Peony Paeonia lactiflora Pall.

MA Zong-hui,YU Yang, WANG Guo-kai, LIU Jin-song, WANG Gang, Zhang Pei-liang

(School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine & Anhui Key Laboratory of Modern Chinese Materia Medica, Anhui Hefei 230012, China )

Objective To investigate the isolation and identification of endophytic fungi in Bozhou PeonyPaeonialactifloraPall., in order to enrich the species resources of endophytic fungi. Methods The potato dextrose agar medium was used to isolate the endophytic fungi in Bozhou PeonyPaeonialactifloraPall., the cutting-edge hyphae picking was used for purification, and the molecular biological method was used for identification. Results A total of 24 strains of endophytic fungi were isolated in Bozhou PeonyPaeonialactifloraPall. and were identified as 13 species in 9 genera, i.e.,Fusarium,Talaromyces,Dactylonectria,Myxocephala,Llyonectria,Penicillium,Alternaria,Rhexocercosporidium, andLopadostoma, among whichFusariumaccounted for 33%. Conclusion In this study, endophytic fungi are isolated from Bozhou PeonyPaeonialactifloraPall. for the first time and show a pattern of diversity distribution. The species resources of endophytic fungi inPaeonialactifloraare enriched.

Bozhou PeonyPaeonialactifloraPall.; Endophytic fungus; Isolation; Identification

馬宗慧(1989-)，女，碩士研究生

王剛，kunhong_8@163.com

R284

10.3969/j.issn.2095-7246.2016.06.023

2016-05-09；編輯：曹健)