許 霞，杜 歡，程 卉，孟慶威，吳亞蘭，郭夢(mèng)園

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

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程氏蠲痹湯加減方含藥血清對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響

許 霞，杜 歡，程 卉，孟慶威，吳亞蘭，郭夢(mèng)園

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

目的 探討程氏蠲痹湯加減方含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠外周血單核細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)表達(dá)的影響。方法 將清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分成6組：胎牛血清組、程氏蠲痹湯加減方(JBT)組、雷公藤多苷片(TGT)組、JBT+sc-13143組、正常大鼠血清組以及陰性對(duì)照組。采用皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑和冷水吹風(fēng)刺激的方法復(fù)制風(fēng)寒濕痹阻型AA模型。檢測(cè)各組大鼠血清培養(yǎng)基中外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平。結(jié)果 JBT組大鼠外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-1β表達(dá)水平明顯降低，與胎牛血清組、正常大鼠血清組以及陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。JBT+sc-13143組與JBT組TNF-α、IL-1β表達(dá)水平相比，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 程氏蠲痹湯加減方能有效下調(diào)AA大鼠外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-1β水平。

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；程氏蠲痹湯；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1β

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種臨床比較常見(jiàn)的結(jié)締組織炎癥，以關(guān)節(jié)滑膜為主要靶組織的慢性、系統(tǒng)性、炎癥性自身免疫性疾病，臨床多見(jiàn)關(guān)節(jié)和肌肉酸楚、重著、疼痛。RA主要發(fā)病于手足中小關(guān)節(jié)，疾病遷延難愈，降低患者的生活質(zhì)量，且具有較高的致殘率。目前尚無(wú)針對(duì)本病的特效藥或效果滿(mǎn)意的藥物。中醫(yī)采用辨證論治的方法治療RA，具有療效較好、毒性及不良反應(yīng)較小的優(yōu)勢(shì)，因而獲得了國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的普遍關(guān)注，并進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究。

程氏蠲痹湯是新安醫(yī)家程鐘齡的自創(chuàng)方，原方名為蠲痹湯，出自于《醫(yī)學(xué)心悟》，冠以“程氏”二字以與其他蠲痹湯相區(qū)分。該方是程鐘齡臨床治療風(fēng)寒濕型痹病的通治方，其主要功效是祛風(fēng)散寒、除濕通絡(luò)。在程氏醫(yī)案中多有效驗(yàn)，后世醫(yī)家治痹醫(yī)案中也常見(jiàn)該方的加減使用，直至現(xiàn)代仍有醫(yī)家使用程氏蠲痹湯的臨床報(bào)道[1-4]。但其治療RA的機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在前期體內(nèi)研究的基礎(chǔ)上，觀察了程氏蠲痹湯加減方(Juanbi Tang,JBT)含藥血清對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠外周血單核細(xì)胞腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物 取清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，平均體質(zhì)量(200±20)g，由安徽長(zhǎng)臨河醫(yī)藥科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2011-002。實(shí)驗(yàn)前在室溫22～28 ℃、相對(duì)濕度50%～60%的環(huán)境下隨機(jī)分籠飼養(yǎng)3 d，自然光照周期。觀察未出現(xiàn)異常者方可入組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品和試劑 JBT(羌活、獨(dú)活、桂枝、白芍、秦艽、川芎、黃芪、海風(fēng)藤、桑枝、乳香、木香等)：飲片均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)門(mén)診部提供，水煎2次，合并煎液，濃縮至2 g/mL的藥液；雷公藤多苷片(tripterygium glycosides tablet，TGT)(批號(hào) 130902，每片10 mg)：上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司；弗氏完全佐劑：美國(guó)Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)液(批號(hào) 1627680)、胎牛血清(批號(hào) 1414426)：Gibco產(chǎn)品；大鼠TNF-α ELISA試劑盒(批號(hào) CK-E30635R)、大鼠IL-1β ELISA試劑盒(批號(hào) CK-E30419R)：上海源葉生物技術(shù)有限公司；sc-13143(批號(hào) F2812)：Santa Cruz生物科技公司。

1.3 儀器 Beckman Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)貝克曼公司；MCO-175 CO2培養(yǎng)箱：日本三洋電氣集團(tuán)；Spectra Max M2e多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司；XB-20雪花制冰機(jī)：浙江省寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q超純水機(jī)：美國(guó)密理博公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 風(fēng)寒濕痹阻型AA模型復(fù)制 除正常大鼠血清組外，向每只大鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1 mL致炎，復(fù)制AA大鼠模型。模型復(fù)制第1天，除正常大鼠血清組外，其余大鼠置于5～7 ℃冷水中，水深2 cm，站立其中20 min，同時(shí)伴以3～4級(jí)風(fēng)力，每日1次，連續(xù)14 d，復(fù)制風(fēng)寒濕證模型。以上兩者結(jié)合，復(fù)制病證結(jié)合模型。

2.1.2 T細(xì)胞分離培養(yǎng) 結(jié)合關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)，選擇模型復(fù)制成功大鼠，腹腔注射予其麻醉，在超凈臺(tái)中，共采集大鼠腹主動(dòng)脈血60 mL備用。將大鼠的新鮮抗凝血分別倒入兩支50 mL的一次性刻度離心管，每只30 mL，加PBS稀釋。在新的小口徑15 mL刻度離心管內(nèi)加入5 mL淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Paque Plus)，用吸管將10 mL稀釋血液沿管壁緩慢加到分離液上。2 000 r/min，15 min室溫離心。取中間云霧狀白膜層細(xì)胞，置于另一離心管中，加入5倍的PBS重懸。然后1 500 r/min離心10 min，迅速倒出上清液，輕彈管底沉淀細(xì)胞團(tuán)塊使其松散。加入6～10倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫裂解5 min。1 500 r/min 離心5 min，棄上清。洗滌細(xì)胞2次，免疫磁珠標(biāo)記并分選獲得目的細(xì)胞，即潘氏T細(xì)胞。補(bǔ)入2 mL PBS，計(jì)數(shù)并用流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞純度。5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，30%濕度，20 mL一次性培養(yǎng)瓶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。1 000 r/min離心5 min，去上清，沉淀，加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。

2.1.3 動(dòng)物血清制備 取清潔級(jí)雄性SD大鼠，平均體質(zhì)量(200±20)g。JBT組大鼠被灌服JBT藥液9 mL/kg(為60 kg成人臨床用藥量8倍)，每日1次。TGT組大鼠被灌服TGT混懸液(將TGT研成細(xì)末，加生理鹽水制成0.57 mg/mL混懸液)10 mL/kg，每日1次。均連續(xù)給藥7 d，于第7 d用藥4 h后麻醉，無(wú)菌條件下股動(dòng)脈取血，分離血清。56 ℃滅活30 min，濾過(guò)，除菌。-20 ℃保存?zhèn)溆?。另設(shè)陰性對(duì)照組，取空白血清，予等量生理鹽水灌胃，其余方法同上。

2.1.4 分組方法 按培養(yǎng)基中所含血清成分的不同分成6組。①胎牛血清組：培養(yǎng)基中含10%胎牛血清；②JBT組：培養(yǎng)基中含10% JBT大鼠藥物血清；③TGT組：培養(yǎng)基中含10% TGT大鼠藥物血清；④JBT+sc-13143組：培養(yǎng)基中除含10% JBT藥物血清之外，還含有G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2，GRK2)阻滯劑sc-13143，濃度按1∶50加入培養(yǎng)液；⑤正常大鼠血清組：培養(yǎng)基中含10%正常大鼠血清；⑥陰性對(duì)照組：不加大鼠血清，培養(yǎng)基中含10%生理鹽水。

3 結(jié)果

3.1 JBT含藥血清對(duì)AA大鼠體外單核細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響 JBT組及TGT組大鼠外周血單核細(xì)胞TNF-α表達(dá)水平明顯降低，與胎牛血清組、正常大鼠血清組和陰性對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。JBT+sc-13143組與JBT組相比，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 JBT含藥血清對(duì)AA大鼠體外單核細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

注：與胎牛血清組比較，*P<0.05；與JBT組比較，#P<0.05。

3.2 JBT含藥血清對(duì)AA大鼠體外單核細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響 JBT組大鼠外周血單核細(xì)胞IL-1β表達(dá)水平明顯降低，與胎牛血清組、正常大鼠血清組和陰性對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。JBT+sc-13143組與JBT組相比，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 JBT含藥血清對(duì)AA大鼠體外單核細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響

注：與胎牛血清組比較，*P<0.05；與JBT組比較，#P<0.05。

4 討論

程氏蠲痹湯是新安醫(yī)家程鐘齡的自創(chuàng)方，是后世中醫(yī)界治療痹病的常用方。JBT由程氏蠲痹湯加減而成。方中君藥由羌活、獨(dú)活二者組成，祛風(fēng)除濕，通利關(guān)節(jié)，祛除一身之風(fēng)寒濕邪。以桑枝、海風(fēng)藤通利關(guān)節(jié)為臣藥，體現(xiàn)了“通”在痹病治療中重要性。輔佐以白芍、桂枝、川芎、秦艽、乳香、木香等行氣活血化瘀、止痛以蠲痹，體現(xiàn)“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”之意。方中再配以黃芪，體現(xiàn)氣血同治。全方諸藥合用，祛風(fēng)散寒、除濕通絡(luò)止痛以治標(biāo)，補(bǔ)氣行氣活血以治本。

由類(lèi)風(fēng)濕性滑膜中巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞或滑液中的中性白細(xì)胞生成的炎性因子TNF-α和IL-1β在RA病情進(jìn)程中有著重要的作用。TNF-α和IL-1β在活動(dòng)性RA中主要參與刺激多形核細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞，產(chǎn)生前列腺素等小分子炎性遞質(zhì)；激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，在關(guān)節(jié)炎時(shí)，正是通過(guò)與黏附分子的互相作用，使血液中白細(xì)胞被匯集到關(guān)節(jié)腔內(nèi)；通過(guò)刺激骨膜細(xì)胞和破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，使糖蛋白的合成減少、降解增加，同時(shí)產(chǎn)生釋放骨鈣的膠原酶和其他中性蛋白酶，從而導(dǎo)致骨和軟骨破壞[5]。TNF-α是一種誘導(dǎo)炎癥發(fā)生的關(guān)鍵因子，是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，并參與正常炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)[6]。TNF-α在RA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是個(gè)強(qiáng)有力的促炎因子，發(fā)揮著重要作用，能刺激IL-1、IL-6、IL-8的產(chǎn)生，并激活地諾前列酮和膠原酶，引起血管生成；TNF-α與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，誘導(dǎo)血管生成。IL-1β主要也是由活化的單核-巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)RA患者的血清及關(guān)節(jié)液中可檢測(cè)到IL-1β，相關(guān)研究顯示IL-1β主要與RA患者的軟骨損傷有關(guān)，也是RA炎癥發(fā)生過(guò)程中重要的細(xì)胞因子，可刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和抗體[7]。IL-1家族中IL-1α、IL-1β作為致炎性激動(dòng)劑，IL-1Rα作為抑制前者的受體拮抗劑，其作用機(jī)制已被廣泛研究。IL-1β占主要致炎地位，它通過(guò)激活單核-巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和抗體，同時(shí)在促進(jìn)破骨細(xì)胞分化方面起著重要作用。同時(shí)有研究表明，TNF-α能夠誘導(dǎo)IL-1和IL-6的分泌增加。因此，當(dāng)IL-1和TNF-α水平表達(dá)高時(shí)，會(huì)刺激軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶和基質(zhì)金屬酶等，同時(shí)激活破骨細(xì)胞，導(dǎo)致滑膜炎癥、骨溶解和軟骨的吸收破壞[5]。大量實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)證實(shí)，IL-1β、IL-6及TNF-α在RA的炎癥過(guò)程中至關(guān)重要。RA疾病的發(fā)生是由相互依賴(lài)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的[8]。

G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G-protein-coupled receptors kinases，GRKs)是一簇與G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)快速失敏相關(guān)的激酶，是GPCRs信號(hào)通路的調(diào)控蛋白。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GRKs與炎性反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)，在免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)中起重要作用。免疫細(xì)胞中GRKs的表達(dá)水平隨著炎癥的發(fā)展是動(dòng)態(tài)變化的[9]。現(xiàn)代研究還發(fā)現(xiàn)，RA大鼠T淋巴細(xì)胞G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其調(diào)控蛋白發(fā)生了異常改變[10]。表明G蛋白偶聯(lián)信號(hào)通路是影響T細(xì)胞功能的重要信號(hào)通路。

本研究結(jié)果顯示，JBT含藥血清可顯著降低大鼠外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-1β表達(dá)水平，效果優(yōu)于TGT含藥血清，兩組均與胎牛血清組、正常大鼠血清組以及不加血清的陰性對(duì)照組有顯著差異。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中加入了GRK2信號(hào)通路的阻滯劑sc-13143，以探討JBT可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備，本研究也證實(shí)了JBT+sc-13143組與JBT組相比有顯著差異(P<0.05)。說(shuō)明GRK2信號(hào)通路可能是JBT治療RA的機(jī)制之一。

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Effect of Modified Cheng’s Juanbi Decoction-containing Serum on Expression of Tumor Necrosis Factor-α and Interleukin-1β in Peripheral Blood Mononuclear Cells in Rats with Adjuvant Arthritis

XU Xia, DU Huan, CHENG Hui, MENG Qing-wei, WU Ya-lan, GUO Meng-yuan

(Anhui University of Chinese Medicine, Anhui Hefei 230012, China)

Objective To investigate the effect of modified Cheng’s Juanbi Decoction-containing serum on the expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) in peripheral blood mononuclear cells culturedinvitroin rats with adjuvant arthritis (AA). Methods Clean male Sprague-Dawley rats were randomly divided into fetal bovine serum group, modified Cheng’s Juanbi Decoction (JBT) group, tripterygium glycoside tablet (TGT) group, JBT+sc-13143 group, normal rat serum group, and negative control group. A model of cold-damp obstruction-type AA was established by intradermal injection of Freund’s complete adjuvant and stimulation with cold water and wind. The expression of TNF-α and IL-1β in peripheral blood mononuclear cells in rats was measured. Results The JBT group had significant reductions in the expression of TNF-α and IL-1β in peripheral blood mononuclear cells compared with the fetal bovine serum group, the normal rat group, and the negative control group (P<0.05). There were significant differences in the expression of TNF-α and IL-1β between the JBT+sc-13143 group and the JBT group (P<0.05). Conclusion Modified Cheng’s Juanbi Decoction can effectively downregulate the expression of TNF-α and IL-1β in peripheral blood mononuclear cells in rats with AA.

Rheumatoid arthritis; Cheng’s Juanbi Decoction; Tumor necrosis factor-α; Interleukin-1β

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81302911)；高校省級(jí)優(yōu)秀青年人才基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013SQRL040ZD)；安徽中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2013qn015)

許霞(1979-)，女，博士，副教授

R593.22；R285.5

10.3969/j.issn.2095-7246.2016.06.022

2016-06-18；編輯：姚實(shí)林)