白東艷，易瑋，李艷慧，王澍欣，劉暢，廖穆熙

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405）

中藥穴位敷貼對實(shí)驗(yàn)性乳腺增生模型大鼠雌、孕激素受體表達(dá)的影響

白東艷1，易瑋1，李艷慧2，王澍欣2，劉暢1，廖穆熙2

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405）

【目的】探討中藥穴位敷貼療法對實(shí)驗(yàn)性乳腺增生模型大鼠的作用機(jī)制?！痉椒ā繉?0只SD（遠(yuǎn)交群）大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、穴位敷貼組，每組10只。采用雌激素誘導(dǎo)法復(fù)制大鼠實(shí)驗(yàn)性乳腺增生模型，以中藥穴位敷貼治療。采用免疫組織化學(xué)染色方法，觀察各組大鼠乳腺組織細(xì)胞中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）的分布或含量?！窘Y(jié)果】與正常組比較，模型組ER、PR表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，穴位敷貼組ER、PR表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）?！窘Y(jié)論】中藥穴位敷貼療法可能通過下調(diào)乳腺組織ER、PR表達(dá)，從而起到抑制乳腺增生的作用。

乳腺增生；中藥穴位敷貼；雌激素受體；孕激素受體；疾病模型，動(dòng)物；大鼠

乳腺增生屬中醫(yī)“乳癖”范疇。中藥穴位敷貼療法屬中醫(yī)外治法，是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，應(yīng)用中草藥制劑施于腧穴的治病方法。經(jīng)臨床驗(yàn)證，中藥穴位敷貼療法用于乳腺增生病治療，療效確切[1-2]。為進(jìn)一步探討中藥穴位敷貼治療乳腺增生的作用機(jī)理，本研究擬觀察其對實(shí)驗(yàn)性乳腺增生模型大鼠雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠30只，清潔級，雌性，未孕，體質(zhì)量（200±20）g，鼠齡3個(gè)月，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（粵）2003-001。

1.2 試劑與儀器己烯雌酚注射液，由上海通用藥業(yè)股份有限公司出品，國藥準(zhǔn)字H31021403，批號：050101；黃體酮注射液，廣州明興制藥廠出品，國藥準(zhǔn)字H31021401，批號：041102；ER抗體（BA0345，兔多抗，1∶100）、PR抗體（BA0107，兔多抗，1∶100）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。BMK-D500型數(shù)碼光學(xué)顯微鏡，由重慶奧特光學(xué)有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物穴位敷貼藥物由本課題組自制。將冰片與三棱、莪術(shù)、天南星按質(zhì)量比1∶3∶3∶3研成粉末，加甘油調(diào)成糊狀，制成膏，恒溫保存，待用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及造模將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組（N=10）：正常組、模型組、穴位敷貼組，苦味酸標(biāo)記。常規(guī)喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后造模。正常組每天注射生理鹽水0.2 mL/只，連續(xù)30 d。其他2組參考黃月玲等[3]的造模方法，在大鼠大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射己烯雌酚注射液0.5 mg·kg-1·d-1，連續(xù)25 d后，改用肌肉注射黃體酮注射液4 mg·kg-1·d-1，連續(xù)5 d。

1.5 干預(yù)方法造模成功后，正常組和模型組以蒸餾水灌胃，2 mL/次，每天1次，連續(xù)28 d。穴位敷貼組每天給予穴位敷貼治療6～8 h，連續(xù)28 d，具體方法：應(yīng)用硫化鋇將大鼠中下腹部（相當(dāng)于關(guān)元、氣海穴）脫毛，脫毛面積約為2 cm×4 cm，將大小約1 cm×1 cm、厚0.5 cm的藥膏，以紗布做襯，用膠布敷貼固定于氣海、關(guān)元穴及乳房局部阿是穴上。3組大鼠均予同等條件喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死。

1.6 標(biāo)本采集及指標(biāo)觀察處死大鼠后，取乳腺組織，以體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片。采用免疫組織化學(xué)染色方法，觀察各組大鼠乳腺組織細(xì)胞中ER、PR分布和陽性表達(dá)強(qiáng)度。

免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：參照文獻(xiàn)[4]。乳腺組織細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒的細(xì)胞即為ER或PR陽性表達(dá)細(xì)胞。高倍鏡下每例隨機(jī)選取10個(gè)視野，共計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算得出陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)。根據(jù)顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)2項(xiàng)指標(biāo)來綜合判定ER或PR陽性表達(dá)強(qiáng)度：顯色淺、陽性細(xì)胞數(shù)＜25%者為“+”；顯色較淺、陽性細(xì)胞數(shù)介于25%～50%者為“++”；顯色較深、陽性細(xì)胞數(shù)介于50%～75%者為“+++”；顯色深、陽性細(xì)胞數(shù)＞75%者為“++++”。并將+、++、++++、++++、分別計(jì)為1、2、3、4分。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。3組ER、PR蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較，采用Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。3組ER、PR蛋白表達(dá)強(qiáng)度計(jì)分均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間經(jīng)K-S檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布，經(jīng)Levene檢驗(yàn)，若方差齊，采用方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，應(yīng)用LSD法進(jìn)行兩兩比較；方差不齊，采用Dunnett’s T3法。

2 結(jié)果

圖1～2結(jié)果顯示：正常組乳腺腺泡上皮僅有少量細(xì)胞核呈棕色著色；模型組增生的腺泡上皮細(xì)胞核著色加深；穴位敷貼組腺泡上皮細(xì)胞核著色較模型組變淺。

表1結(jié)果顯示：正常組ER、PR陽性表達(dá)強(qiáng)度多在+～++，模型組多在+++～++++，穴位敷貼組多在++～+++。模型組ER、PR陽性表達(dá)強(qiáng)度與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；穴位敷貼組ER表達(dá)與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而穴位敷貼組PR表達(dá)與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組ER、PR表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，穴位敷貼組ER、PR表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠乳腺組織ER表達(dá)（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 1Comparison of ER expression in rat mammary gland tissues of various groups（by immunohistochemistry，×200）

圖2 各組大鼠乳腺組織PR表達(dá)（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 2Comparison of PR expression in rat mammary gland tissues of various groups（by immunohistochemistry，×200）

表1 各組大鼠乳腺組織ER、PR蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較Table 1Comparison of ER and PR expression intensity in rat mammary gland tissues of various groupsn/例

3 討論

3.1 穴位敷貼藥物處方及選穴依據(jù)

敷貼藥物選用天南星、三棱、莪術(shù)、冰片4種中藥。天南星化痰散結(jié)、消腫止痛，外用善治癰疽、痰核腫痛；三棱、莪術(shù)功專破血行氣、消積止痛；冰片辛香走竄，清熱止痛，又能通諸竅、散郁結(jié)。四藥外用，共奏行氣活血、消積止痛之功。本研究參考靳三針療法中“陽三針”的配穴方法，選用關(guān)元穴、氣海穴及乳房局部阿是穴。關(guān)元穴、氣海穴均為任脈之穴，任脈與女性生長發(fā)育和生殖關(guān)系密切。關(guān)元穴又為足三陰、足陽明、任脈的交會穴，主一身元?dú)?；氣海穴為臍下“丹田”，“主一切氣疾”，兩穴可通調(diào)沖脈、任脈、足三陰經(jīng)的氣血，舒暢氣機(jī)、培補(bǔ)元?dú)?。乳腺增生屬本虛?biāo)實(shí)之證，以肝腎不足、沖任失調(diào)為本，氣滯、痰凝、血瘀為標(biāo)。本中藥穴位敷貼法針對乳腺增生的病機(jī)特點(diǎn)，調(diào)沖任以固本培元，行氣活血以消腫止痛，標(biāo)本兼顧，已被證實(shí)運(yùn)用于臨床治療乳腺增生病患者有良好的療效[4]。本課題組既往研究[5]亦表明，穴位敷貼法干預(yù)乳腺增生模型大鼠后乳腺組織結(jié)構(gòu)與模型組比較，乳腺導(dǎo)管上皮排列基本規(guī)則，導(dǎo)管管腔未見明顯擴(kuò)大。

表2 各組大鼠乳腺組織ER、PR蛋白表達(dá)強(qiáng)度計(jì)分Table 2 Comparison of ER and PR expression intensity scores in rat mammary gland tissues of various groups，s/分）

表2 各組大鼠乳腺組織ER、PR蛋白表達(dá)強(qiáng)度計(jì)分Table 2 Comparison of ER and PR expression intensity scores in rat mammary gland tissues of various groups，s/分）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組穴位敷貼組N 10 10 10 ER 1.5±0.53 3.5±0.71①2.6±0.52②PR 1.5±0.53 3.7±0.42①2.4±0.70②

3.2 ER、PR與乳腺增生病

乳腺增生病屬內(nèi)分泌障礙性疾病。若雌激素分泌過多、孕激素相對減少，可導(dǎo)致乳腺組織在增生和復(fù)舊的周期性過程中發(fā)生病理性改變，引起乳腺末梢導(dǎo)管上皮呈不規(guī)則增生、導(dǎo)管擴(kuò)張和囊腫形成，發(fā)生乳腺實(shí)質(zhì)增生[6]。ER、PR是可以與雌激素、孕激素特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，雌、孕激素的水平是否正常直接影響ER、PR的表達(dá)情況。病理狀態(tài)時(shí)，雌二醇（E2）與細(xì)胞內(nèi)ER亞型ERα結(jié)合后激活轉(zhuǎn)錄，促使乳腺細(xì)胞線粒體數(shù)量顯著增多[7]。當(dāng)乳腺細(xì)胞線粒體過度表達(dá)時(shí)，自身功能障礙隨之產(chǎn)生[8]，可誘導(dǎo)乳腺上皮及間質(zhì)纖維增生[9]，降低細(xì)胞自身修復(fù)能力，還可促進(jìn)ER和PR的合成，使乳腺上皮對雌激素的敏感性增加[10]。另外，E2和ER異常升高時(shí)，可引起PR亞型PR-A過度表達(dá)，使乳腺組織增生細(xì)胞的黏附力下降，誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變；PR-A可激活特異性生長因子，致使乳腺上皮細(xì)胞對孕激素應(yīng)答紊亂，不能由增殖轉(zhuǎn)入復(fù)舊[11]。研究表明，正常乳腺導(dǎo)管和小葉上皮細(xì)胞存在ER和PR，其數(shù)量因乳腺分化程度而異；良性乳腺疾病的腫塊組織ER和PR陽性率高于正常組織，但低于惡性腫瘤[12]。研究[12]表明，臨床患者乳腺增生病理組織中ER、PR呈高表達(dá)；SD大鼠乳腺增生模型研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組ER、PR陽性強(qiáng)度及表達(dá)數(shù)量隨乳腺增生程度加重而增加[9]。

本研究結(jié)果顯示，大鼠乳腺組織增生程度越明顯，其ER及PR積分值也越高，ER、PR表達(dá)也越強(qiáng)，與臨床試驗(yàn)病理結(jié)果[13]一致。中藥穴位敷貼療法能抑制雌激素過度刺激所致的大鼠乳腺上皮增生，其機(jī)制可能是通過降低乳腺組織ER、PR含量，使乳腺組織對雌激素的敏感性下降，從而減弱雌激素在靶細(xì)胞上的生物學(xué)效應(yīng)，產(chǎn)生抑制和治療乳腺增生作用。提示按照受體—受體病—受體調(diào)控模式，研究中醫(yī)藥對乳腺增生病的干預(yù)機(jī)制，針對性更強(qiáng)，更有利于提高臨床研究效能。

［1］于慶生，黃梅.中醫(yī)外治法治療乳腺增生病研究現(xiàn)狀［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（7）：690.

［2］牛博真，李艷慧.穴位貼敷法治療乳腺增生病療效觀察［J］.中國針灸，2008，23（3）：179.

［3］黃月玲，黃霖.大鼠乳腺增生模型的建立［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2002，23（4）：362.

［4］許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)［J］.中國癌癥雜志，1996，6（4）：230.

［5］白東艷，李艷慧，易瑋.穴位敷貼對實(shí)驗(yàn)性乳腺增生模型大鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)及相關(guān)臟器系數(shù)的影響［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（11）：1753.

［6］孟金風(fēng)，宋心紅，姜晶，等.女性乳腺增生與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性研究［J］.中國婦幼保健，2011，26（1）：90.

［7］Ali P，Mahnaz R，Douglas C，et al.Functional estrogen receptors in the mitochondria of breast cancer cells［J］.Mol Biol Cell，2006，17（5）：2125.

［8］Ma Y，Bai R K，Trieu R，et al.Mitochondrial dysfunction in human breast cancer cells and their transmitochondrial cybifds［J］.Biochim Biophys Acta（BBA），2010，1797（1）：29.

［9］周導(dǎo)，易維真，徐英納，等.乳腺增生病動(dòng)物模型的建立及ER、PR表達(dá)的觀察［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，6（1）：1.

［10］Santen R J，Mansel R.Benign breast disorders［J］.N Engl J Med，2005，353（3）：275.

［11］Pathiraja T N，Shetty P B，Jelinek J.Porgesterone receptor isoform-specificpromotermethylation：associationofPR A promoter methylation with worse outcome in breast cancer patients［J］.Clin Cancer Res，2011，17（12）：4177.

［12］安鳳玲，李永茂.乳腺增生病的性激素受體表達(dá)及臨床意義［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2007，14（4）：426.

［13］龔東方，陸智華，鄺幸華.針刺和中藥對乳腺增生的抑制作用研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20（3）：216.

【責(zé)任編輯：黃玲，侯麗穎】

Effect of Chinese Medicine Point Application on Estrogen Receptor and Progesterone Receptor Expression in Experimental Rat Model with Hyperplasia of Mammary Glands

BAI Dongyan1，YI Wei1，LI Yanhui2，WANG Shuxin2，LIU Chang1，LIAO Muxi2
（1.Clinical Medical College ofAcupuncture，Moxibustion and Rehabilitation，Guangzhou UniversityofChinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；2.The First Clinical Medical College，Guangzhou UniversityofChinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

ObjectiveTo explore the therapeutic mechanism of acupoint application of Chinese medicine for experimental rat model with hyperplasia of mammary glands.MethodsThirty Sprague Dawley rats were randomly divided into normal group，model group，and acupoint application group，10 rats in each group.Experimental model with hyperplasia of mammary glands was established by estrogen-induced method.The acupoint application of Chinese medicine was used for the treatment.The estrogen receptor（ER）and progesterone receptor（PR）expressionin mammary glands of various groups were determined by immunohistochemistry.ResultsCompared with the normal group，the levels of ER and PR expression were increased in the model group（P＜0.01）.Compared with the model group，the levels of ER and PR expression were decreased in the acupoint application group（P＜0.01）.ConclusionThe acupoint application of Chinese medicine has curative efficacy on hyperplasia of mammary glands，and its mechanism may be related with the down-regulation of ER and PR expression.

hyperplasia of mammary glands；Chinese medicine acupoint application；estrogen receptor（ER）；progesterone receptor（PR）；disease models，animal；rats

R285.5

A

1007-3213（2016）06-0827-04

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.017

2016-06-21

白東艷（1974－），女，副教授；E-mail：bdyan203@gzucm.edu.cn

易瑋（1966-），女，教授；E-mail：yw8013@gzucm.edu.cn

廣州中醫(yī)藥大學(xué)青年教師科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目（編號：06c026）