田雨光，王玉玨，岳 敏

(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心暨比較醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510515)

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研究報(bào)告

生長(zhǎng)激素基因在西藏小型豬不同生長(zhǎng)階段和不同組織器官中的表達(dá)

田雨光，王玉玨，岳 敏

(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心暨比較醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510515)

目的對(duì)西藏小型豬生長(zhǎng)激素基因在不同臟器和不同年齡階段的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。方法采用Real-time PCR的方法,以GAPDH為內(nèi)參,定量分析0歲(1日齡)、0.1歲(36日齡)、0.25歲(90日齡)、0.5歲(180日齡)、1歲(360日齡)、2歲(720日齡)、3歲(1080日齡)的西藏小型豬的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、皮膚組織中生長(zhǎng)激素基因mRNA表達(dá)水平,并且進(jìn)行比較分析。結(jié)果生長(zhǎng)激素基因在各個(gè)年齡階段的西藏小型豬的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、皮膚中均有表達(dá)。在不同臟器的表達(dá)中,生長(zhǎng)激素基因在0歲、0.5歲時(shí)皮膚中的表達(dá)量最高,肌肉組織中的表達(dá)量最低。在0.25歲、1歲時(shí)肺組織中表達(dá)量最高,在0.1歲、3歲時(shí)肝臟表達(dá)量最高；在不同年齡階段的表達(dá)中,生長(zhǎng)激素基因在0.1歲時(shí)表達(dá)達(dá)到峰值。結(jié)論西藏小型豬的生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的時(shí)空特異性。

西藏小型豬；生長(zhǎng)激素基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

生長(zhǎng)激素(growthhormone,GH)是神經(jīng)內(nèi)分泌生長(zhǎng)軸中調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的核心,是一種具有廣泛生理功能的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素,能影響幾乎所有組織類型和細(xì)胞,甚至包括免疫組織、腦組織及造血系統(tǒng)[1]。豬的GH基因全長(zhǎng)2231 bp,是由190個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽[2],與牛的90%的氨基酸同源性,但兩者與人的GH同源只有65%[3]。豬的GH基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。外顯子大小分別為10、161、117、162和198 bp,內(nèi)含子大小分別為242、210、197和278 bp,編碼前導(dǎo)肽的為78 bp,編碼成熟區(qū)的為570 bp,豬GH基因已被定于12號(hào)染色體[4-6]。不同種動(dòng)物或同種不同個(gè)體之間的生長(zhǎng)速度的顯著差異與GH基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平有著密切相關(guān)性[7]。豬生長(zhǎng)激素通過其受體(GHR)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的傳遞,豬GH只受一個(gè)因子即生長(zhǎng)激素因子Ⅰ(GHF-Ⅰ)的調(diào)控,GHF-Ⅰ不僅維持GH基因的組織特異性表達(dá),而且使表達(dá)具有發(fā)育階段性[8]。對(duì)豬的GH基因在不同組織及年齡階段的表達(dá)情況少有報(bào)道,本文旨在探討西藏小型豬GH基因表達(dá)的變化情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及采樣

選用0歲(1日齡)、0.1歲(36日齡)、0.25歲(90日齡)、0.5歲(180日齡)、1歲(360日齡)、2歲(720日齡)、3歲(1080日齡)的西藏小型豬,每個(gè)年齡段各3頭，共21頭。西藏小型豬來自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2011-0015】,相同的飼養(yǎng)環(huán)境。在南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(粵)2011-0074】處死后,立即取其心、肝、脾、肺、腎、肌肉、皮膚組織,立即放入去除RNA酶的1.5 mL EP管中,迅速投入液氮中,帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑

DEPC處理水：1000 mL ddH2O中加入0.1 mL DEPC,于37℃過夜溫育后高壓滅菌。TRIZOL Reagent,購自Invitrogen公司。無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇，購自廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心。引物由Invitrogen廣州分公司合成。PrimeScript RT-PCR Kit、SYBR Premix DimerEraser(Perfect Real Time)購自Takara公司。

1.2.2 儀器

熒光定量PCR儀(美國伯樂),紫外分光光度計(jì)(美國熱電),水平電泳儀(美國伯樂),凝膠成像系統(tǒng)(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司),高溫烤箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 各種組織總RNA的提取及質(zhì)量測(cè)定

各種組織中總RNA用酚-氯仿一步法提取,紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄

使用Takara SYBR Premix DimerEraser(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL：包括5×PrimeScript Buffer 4 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix 1 1 μL, Oligo Dt Primer(50 μmol/L)1 μL, Random 6 mers(100 μmol/L)1 μL, Total RNA 1 μg,加RNase free DH2O到20 μL。反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)),85℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增條件

根據(jù)GenBank上豬的GH基因(X53325)、GAPDH基因(AF017079)設(shè)計(jì)引物為GHF: 5′-ATC ACATCCTCTTCGCATCTCTT-3′;GHR: 5′-TGAAATAA AAGCCCCTGTCTCC-3′;GAPDHF：5′-TTGGCTACAGC AACAGGG-3′；GAPDHR: 5′-CTGGGATGGAAACTGG AAGT-3′。以樣品的cDNA第一鏈為模版,擴(kuò)增GH基因,以GAPDH作為內(nèi)參。于冰上避光加樣操作,混勻,瞬時(shí)離心進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系為20 μL，包括：SsoFast EvaGreen supermix(1×)10 μL；Forward primer(300 nmol/L)1 μL；Reverse primer(300 nmol/L)1 μL；RNase/DNase-free water 7 μL； cDNA template 1 μL。熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 30 s、40個(gè)循環(huán)(95℃ 1 min、55℃ 1 min，72℃ 30 s)、72℃ 10 min。1.4 熒光定量數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)樣本,每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)信噪情況的設(shè)定和調(diào)整基線和閾值,通過獲得的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。根據(jù)GAPDH作為參照物,從而得出西藏小型豬GH在測(cè)定組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 組織樣品中總RNA的提取效果鑒定

圖1 RNA電泳圖Fig.1 Detection of total RNA

提取好西藏小型豬各個(gè)組織總RNA后,采用瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定,鑒定結(jié)果見圖1,18S和28S條帶清晰,結(jié)果說明RNA具有較好的完整性?？俁NA能夠達(dá)到要求,進(jìn)而反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2.2 西藏小型豬GH基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分析

GH基因的擴(kuò)增曲線及融解曲線如圖2。擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn),基線期、對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期三階段分期明顯,融解曲線均在一條直線上,圖形為平滑的單峰曲線,且Tm溫度附近無雜峰,表明引物特異性較好,沒有因?yàn)橐锒垠w及非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生的雜帶熒光干擾。說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度較高,能真實(shí)反應(yīng)檢測(cè)到的基因的表達(dá)水平。

2.3 GH基因在不同臟器及不同年齡階段的組織表達(dá)分析

以GAPDH為內(nèi)參,根據(jù)組織內(nèi)基因擴(kuò)增的域值循環(huán)數(shù)(Ct值),來計(jì)算GH基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。從表4可以看出：在不同臟器的表達(dá)中,GH基因在0歲、0.25歲、0.5歲、1歲、2歲表達(dá)量最低都是肌肉,在0歲、0.5歲時(shí)在皮膚中的表達(dá)量最高,在0.25歲、1歲時(shí)在肺組織中表達(dá)量最高,在0.1歲、2歲、3歲時(shí)表達(dá)量最高的是肝臟。從圖3、表5中可以看出,在不同年齡階段的表達(dá)中,GH基因在0.1歲時(shí)達(dá)到峰值。所以西藏小型豬的生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的時(shí)空特異性。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)西藏小型豬GH基因在不同臟器中的表達(dá)有顯著性差異(P<0.05),在不同年齡階段的表達(dá)也均有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 西藏小型豬GH基因片段實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增曲線和融解曲線Fig.2 Amplification plots and dissociation curves of Tibet mini-pig GH gene

表4 西藏小型豬生長(zhǎng)激素基因在不同臟器中的mRNA相對(duì)表達(dá)Tab.4 GH mRNA of Tibet mini-pig relative expression in different organs

表5 西藏小型豬生長(zhǎng)激素在不同年齡階段中的mRNA相對(duì)表達(dá)Tab.5 GH mRNA of Tibet mini-pig relative expression in different age stages

圖3 西藏小型豬生長(zhǎng)激素基因 mRNA在不同年齡階段的相對(duì)表達(dá)趨勢(shì)圖Fig.3 GH mRNA of Tibet mini-pig relative expression tendency in different age stages

3 討論

對(duì)于動(dòng)物來說,不同品種、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段及不同臟器,基因表達(dá)差異都較大。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定了西藏小型豬的GH基因在不同年齡階段不同組織中的表達(dá)分布情況。

2013年單艷菊等[9]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究生長(zhǎng)速度不同的高郵鴨和金定鴨13、17、21、25、27胚齡和出雛后7日齡時(shí)垂體GH基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明兩個(gè)鴨種垂體GHmRNA表達(dá)水平均隨著胚齡(或日齡)的增加而增加,而本文就西藏小型豬GH基因在不同年齡階段中同一臟器中的表達(dá)進(jìn)行研究同樣發(fā)現(xiàn)表達(dá)具有一定的規(guī)律,GH基因在所有臟器中均在0.1歲時(shí)達(dá)到了峰值,后不斷降低。2015年閆云峰[10]等利用熒光定量PCR SYBR Green Ⅰ熒光染料法,對(duì)綿羊腸系膜淋巴結(jié)、心臟、肝臟、垂體、大腦、腎臟、骨骼肌、皮膚、肺臟、睪丸和脾臟11個(gè)組織中的GH基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。結(jié)果表明,GH基因在睪丸、腸系膜淋巴結(jié)和脾臟中的表達(dá)量顯著高于心臟、肝臟、大腦、腎臟和骨骼肌,同樣本文研究GH基因在同一年齡階段不同臟器的表達(dá)中,GH基因在0歲、0.25歲、0.5歲、1歲、2歲表達(dá)量最低都是肌肉,在0歲、0.5歲時(shí)在皮膚中的表達(dá)量最高,在0.25歲、1歲時(shí)在肺組織中表達(dá)量最高,在0.1歲、2歲、3歲時(shí)表達(dá)量最高的是肝臟。說明在同一年齡階段,不同臟器表達(dá)量均不同。比較有特點(diǎn)是：在0歲、0.5歲時(shí)表達(dá)量最高的是皮膚,最低的是肌肉；0.25歲時(shí)表達(dá)量最高的是肺組織,最低的是肌肉。所以西藏小型豬的生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的時(shí)空特異性。

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Study on the expression of Growth Hormone gene in different tissues and different growth stages of Tibet-minipigs

TIAN Yu-guang, WANG Yu-jue, YUE Min

(Laboratory Animal Center, Southern Medical University, Guangzhou 510515,China)

Objective To study the expression of Growth Hormone (GH) gene in different tissues and different growth stages of Tibet-minipigs. Methods The expression level ofGHgene in heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle, skin tissue of Tibet mini-pig was analyzed by Real-time PCR in 0 years old (1 days), 0.1 years old (36 days), 0.25 years old (90 days), 0.5 years old (180 days), 1 years old (360 days), 2 years old (720 days), and 3 years old (1080 days).ResultsThe expressions ofGHmRNA could be detected in various tissues (heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle, skin) in different growth stages (0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 3 years old) in Tibet mini-pigs. TheGHgene was most highly expressed in skin in 0, 0.5 years old and most lowly expressed in muscle comparing with other tissues. Moreover, theGHgene was also most highly expressed in lung and liver in 0.25, 1 years old and 0.1, 3 years old, respectively. The expression level ofGHgene reached the peak in 0.1 years old among different growth stages. Conclusion The expression ofGHgene in Tibet mini-pig showed an obvious temporal and spatial specificity.

Tibet-minipigs；GHgene；Real-time PCR

國家自然科學(xué)基金(801402625)；中國博士后自然科學(xué)基金(2014M550439)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016A030303008)；南方醫(yī)科大學(xué)2015科研助手項(xiàng)目(C1032246)。

田雨光(1987-)，男，理學(xué)博士，研究方向：比較醫(yī)學(xué)和人類疾病動(dòng)物模型。E-mail： yuguang.tian@qq.com。

岳敏(1982-)，女，醫(yī)學(xué)博士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：比較醫(yī)學(xué)和人類疾病動(dòng)物模型。E-mail： 343779791@qq.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0001-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.001

2016-07-12